1.3拷贝c基因型hbv转基因小鼠的构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法。所述方法是通过囊胚注射ES细胞制备定点整合1.3拷贝C基因型乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）转基因小鼠。首先构建定点整合1.3拷贝C型HBV的表达载体，然后采用电转导转化方法把重组质粒转化到ES细胞中，经过筛选和培养后获得定点整合重组的ES细胞，再把定点整合重组的ES细胞经消化成单个细胞后注射到囊胚中，然后把囊胚移植到假孕母鼠子宫中。该方法在国内外率先建立了1.3拷贝C型HBV的转基因小鼠，针对性的应用于乙肝相关研究领域中，为我国乙型肝炎预防和治疗研究更加理想的动物模型。
【专利说明】1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物模型构建领域。更具体地，涉及一种1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球范围内影响人类健康的重大问题。由HBV感染导致的慢性进行性肝脏炎症病变，常常发展为肝硬化、肝癌并最终导致死亡。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年因此死亡的人数约为100万~200万。我国一直是HBV感染的高发区，最新的资料表明:我国现有的慢性HBV感染者约为9300万例，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，占慢性HBV感染者的1/5强。慢性HBV感染者和慢性乙型肝炎患者由于携带有大量HBV，是HBV的最主要传染源。我国每年都投入大量的经费和人力物质资源用于该类人群的治疗和阻止HBV在人群中的进一步 传播，给我国带来了非常严重的经济和社会负担，使本已十分有限的医疗资源更加紧张。为此，开展深入和多层次的HBV感染尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的相关研究，对于攻克这一影响我国近I亿人口身体健康的疾病，维护我国人口的身体健康具有重要意义。
[0003]在乙型肝炎的相关研究中，乙型肝炎动物模型具有举足轻重的地位，乙型肝炎动物模型应用于从HBV感染机制、被感染机体的免疫状态改变、HBV在被感染机体内的免疫逃逸机制、HBV的基因治疗以及HBV治疗药物的疗效评价等的各个层次和各个方面。因而合适的动物模型的建立与选择往往成为HBV研究工作的关键，对研究工作起到事半功倍的作用。为此，许多学者都曾致力于建立各种类型的乙型肝炎动物模型。然而由于人类HBV属于嗜肝DNA病毒科，有较强的种属特异性，自然条件下只感染人和非人灵长类(如黑猩猩等)，建立起能广泛应用的动物模型并非易事。黑猩猩模型因其体积较大、成本高以及受伦理道德约束等限制了其应用；而树駒模型则由于其感染效率低，仅能导致短暂的轻度感染，病毒滴度很低，而难以推广应用；鸭乙型肝炎的动物模型，则存在其药代动力学和免疫学遗传背景与人类有很大的不同的缺陷、土拨鼠仅产于北美，运输困难且价格昂贵，从而限制了这些动物模型的广泛应用，进而限制了对乙型肝炎发病机制、免疫病理、治疗药物以及免疫治疗的相关研究。
[0004]近年来，由于遗传和免疫背景清楚、易于饲养等优点，小鼠逐渐受到研究人员的关注，成为构建HBV动物模型的最佳选择。研究人员建立了人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型、基因转染HBV小鼠模型和HBV转基因小鼠模型。
[0005]但是，尽管人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型可以说是目前最好的HBV感染复制模型，但是由于该模型没有免疫机能，因而不能进行免疫介导的病毒清除和肝炎免疫致病机制的研究。基因转染HBV小鼠模型由于是一过性的HBV复制模型，因而只能用于急性HBV感染的研究，不适用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎研究。此外，由于注射剂量太大(相当于小鼠全身体液的总量)，对小鼠肝脏和其他器官造成的损伤也不能忽视。目前已有的HBV转基因小鼠也存在着明显的缺陷。首先，目前已有的HBV转基因小鼠由于并非通过被HBV感染的途径建立，因此无法用来进行HBV进入被感染机体和HBV在机体内的散布研究；其次，目前已有的HBV转基因小鼠对HBV病毒抗原处于免疫耐受状态，机体不能产生对HBV的免疫反应，也不产生乙型肝炎病变。以上原因导致了可用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎非免疫耐受的动物模型的缺失，客观上影响了相关研究的深入开展。因此建立可控、支持HBV体内感染并能导致类似于临床乙肝病变的，非免疫耐受的HBV小鼠模型成为深入了解乙肝发病机制，肝脏病变的发展和转归机制，抗乙肝药物的研发及评价新的乙肝免疫疗法的重要关键因素。
[0006]另外，由于目前临床治疗乙型肝炎广泛使用的的HBV抗病毒疗法存在很多不足，如干扰素会引起患者白细胞和血小板下降、可能会加重肝损害、有可能致畸或阻碍儿童发育、不能耐受药 物的不良反应等等；核苷类似物则由于导致宿主体内的HBV基因发生突变而产生耐药。这些因素导致临床上HBV感染治疗尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的治疗效果不甚理想，临床上期待新的治疗方法问世，以达到控制或逆转乙型肝炎尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎致病的过程和进展，直至达到彻底治愈乙肝的目的。免疫调节治疗有望成为治疗慢性乙型肝炎的重要手段。研究表明，HBV慢性感染者体内的T细胞被HBV触发而自杀，这也许是决定HBV慢性感染者体内HBV无法清除的关键。
[0007]另外，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒,可引起各种急慢性肝炎、肝硬化等疾病，并与肝细胞癌的发生有非常密切的关系。根据HBV基因序列的差异，可将HBV毒株分为不同的基因型，目前已确定有A~H8个基因型。HBV基因型与其流行特征、致病性、疾病治疗及预后等方面存在十分紧密的关系。不同基因型呈一定的地理区域性分布，我国的主要流行株有B型和C型。而基因型C在全国各地均有流行，尤其以北方地区流行为主，有的城市甚至高达69%。
[0008]由于HBV具有高度的宿主特异性，仅感染人和少数灵长类动物，不感染小鼠等常见实验动物，有关HBV及乙型肝炎的研究受到很大限制。转基因小鼠的建立，为乙型肝炎的基础研究和抗乙肝病毒药物的开发带来了希望。但是HBV全基因组单拷贝或二拷贝转基因动物实验显示HBV的复制和表达效率很低，严重影响了其广泛应用。目前国内研究多为D型转基因小鼠。而针对国流行株C型转基因小鼠研究较少。因此十分有必要建立一种C型HBV基因高效复制和表达的转基因小鼠，为我国乙型肝炎预防和治疗研究更加理想的动物模型。然而，本实验室通过显微原核注射的方法制备出的C型转基因小鼠，在免疫组化结果中显示H)代到F3代阳性小鼠的肝组织和肾组织均有HBsAg表达，且均为胞质型，表明该基因可以表达且可以传代。但是小鼠血清和尿液HBsAg和HBeAg很难检测到，血清荧光定量PCR也显示HBV DNA为低复制表达水平，拷贝数为IO2~IO3拷贝/mL。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是克服现有乙型肝炎研究转基因动物模型存在的技术不足，提供一种能稳定传代和表达的C型乙肝疾病研究动物模型，即高效复制和表达C型HBV转基因小鼠的构建方法。
[0010]本发明目的是提供一种1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备方法。
[0011]本发明还提供上述1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的应用。[0012]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法，步骤如下:
51.胚胎干细胞系的建立；
52.将1.3倍加长片段C型HBV质粒电转导到胚胎干细胞，经过培育和嘌呤霉素筛选得到阳性的胚胎干细胞，进行扩大培养；
53.把阳性胚胎干细胞注射到囊胚期小鼠卵细胞中，将注射好的囊胚移植到假孕母鼠的子宫，培育得到1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠。
[0013]其中，步骤SI所述胚胎干细胞系的建立方法如下:
511.取怀孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，断颈处死；
512.用酒精将Sll处死的孕鼠消毒；
513.打开孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，从输卵管根部及子宫下端分叉处剪下双侧子宫，将双角子宫于阴道处剪断；
514.注射器吸入M2(购自美国Sigma公司)作为冲胚液，注射器的针头在使用之前把针尖剪掉磨平灭菌； 将注射器从子宫的一端插入子宫腔内，夹紧，吹入冲胚液，再从子宫的另一端插入注射器，吹入冲胚液；
515.将上述冲胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖镜下，用口叼管吸取少量冲胚液，将囊胚吸出；
516.然后将囊胚放入KSOMaa胚胎培养基(购自美国ZenithBiotech公司)中，观察，选择比较好的囊胚；
517.将选择的囊胚吹入预先接种了饲养层细胞(北京思赛因公司提供)的细胞板，换用小鼠胚胎干细胞建系培养基(购自北京思赛因公司)，每孔中放I个囊胚；
518.放入培养箱培养，囊胚逐渐长大，最后贴壁，滋胚层展开，囊胚的内细胞不断增
殖；
519.培养4~6天后，囊胚的内细胞成为一团圆柱形或凸起细胞团，此时可离散囊胚的内细胞团，得到胚胎干细胞系。
[0014]步骤S2所述1.3倍加长片段C型HBV质粒由中国人民解放军第302医院赠与，序列全长如SEQ ID N0.1所示。
[0015]所述1.3倍加长片段C型HBV质粒的构建方法为:通过Spe I和如a I两个酶切位点将1.3倍加长片段C型HBV的DNA片段连接入pcDNA3.1质粒中，得到1.3倍加长片段C型HBV质粒的示意图如附图1所示。
[0016]步骤S2所述电转导的方法如下:
521.将培养的胚胎干细胞系用胰酶消化为单个细胞，加入终止培养基(广州科学院与健康研究院提供)终止消化，离心，去除上清，然后用减血清培养基opt1-MEM (购自美国Gbico公司)悬浮；
522.悬浮液中加入电转导所需的C型HBV质粒，混匀，转移到电转杯中，用电转仪进行电转导，电转导后迅速加入细胞培养基(广州科学院与健康研究院提供)，然后铺到细胞板中；
523.第二天，更换培养基为嘌呤霉素抗性的培养基，每天进行换液；
524.培养5~7天后，只有转入了质粒的细胞才能生长成集落克隆，分别挑取筛选出来的克隆到细胞板中，每个孔I个细胞克隆；
525.第二天，将细胞传代到新的细胞板中，再次长满后，细胞用于提取DNA进行PCR鉴定，得到阳性克隆；
526.将得到的阳性克隆的细胞进行扩大培养，得到阳性胚胎干细胞系。
[0017]步骤S3所述注射的方法如下:
531.将电转导获得的阳性胚胎干细胞系消化重悬成单个细胞；
532.用激光破膜仪在囊胚的透明带上打孔，用注射针将10~20枚阳性胚胎干细胞打到囊胚腔里面，然后用胚胎培养基KSOMaa (购自美国Zenith Biotech公司)培养2~3小时后，显微镜下观察囊胚形态恢复。
[0018]步骤S3所述的假孕母鼠通过如下方法获得:将KM母鼠和KM结扎公鼠按照雌雄比例2:1进行合笼饲养，次晨挑选有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠，即为假孕母鼠，记作0.5天假孕母鼠，而囊胚注射移植于2.5天假孕母鼠。
[0019]本发明还提供了上述1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠在乙肝相关研究领域方面的应用。
[0020]更具体地，所述应用是指1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠在研究机体免疫系统抗乙肝病毒感染、免疫致病过程中和抗乙肝病毒药物开发方面的应用。
[0021]本发明所用C57BL/6J鼠由本实验室保存。C57BL/6J鼠的主要特性为:(摘自《实验动物学》，主编:郝光荣，第二军医大学出版社，见该书105页)
(O免疫学特性=IgG在20月龄前缓慢增加，IgG2b为高值，IgG为低值。无菌饲养较普通饲养者IgG绝对量低。IgG为高值，有的个体12个月龄后可超过800 μ g/mL。无菌饲养的IgM较高。细胞免疫力随增龄较少降低,可能与自发肿瘤较少有关。较易诱发免疫耐受性。干扰素产量较高。对百日咳易感因子(Pertussis HSF)敏感；
(2)形态学特性:新生仔中雌性的16.8%、雄性的3%为小眼或无眼症；新生仔的0.6%出现后肢多趾症；
(3)生理学特性:嗜酒精性高，肾上腺贮存脂质少；将雄鼠皮肤移植至同系雌鼠，20天后出现排拆；这是因为组织相容性原中存在雄性抗原，C57BL/6J小鼠较其它系小鼠更为显著；注射酪蛋白后易引起淀粉样变症；用可的松可诱发出现腭裂的概率为20%，对结核杆菌敏感，对鼠痘病毒有一定抗力；
(4)癌发生率:乳腺癌少发(乳腺癌率为O~1%);用致癌剂难以致癌。老龄鼠淋巴瘤自发率为20~25% ;雌鼠白血病为7~16% ;经X线照射后肝癌发生率高；
(5)寿命:最长达1200天；平均雌鼠692天，雄鼠676天。
[0022]本发明选用C57BL/6J鼠主要是因为其毛色为黑色，而囊胚注射时胚胎来源为白毛的KM鼠，这样就无需通过另外的检测方法来检测嵌合鼠的嵌合率，直接通过毛色就可以判断嵌合率。
[0023]目前针对国内流行株C型HBV转基因小鼠研究较少。本发明利用囊胚注射法在国内率先建立一种能稳定传代和高效复制表达C型HBV转基因小鼠，为我国乙型肝炎预防和治疗研究提供更加理想的动物模型。本发明通过囊胚注射ES细胞法构建转基因小鼠，C型HBV基因能够定点重 组ES细胞(定点重组的结构示意图如附图2所示。基因定点整合技术又称为基因打靶，是指构建含有同源序列的DNA片段的整合载体，通过各种转化方法，使外源DNA序列与靶序列之间发生同源重组，从而将靶DNA序列定点破坏，通过一系列筛选手段，最终得到定向转化的细胞。基因定点整合技术的其中一个方法就是引入重组酶Flp+Cre系统，在胚胎干细胞(ES cell)中通过置换型载体进行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因，并在其两侧分别引入同向排列的FRT和Loxp位点。两条同源染色体都带有FRT和Loxp位点且引入的FRT和Loxp位点不能干扰祀基因的转录。
[0024]通过大量的实验表明，根据本发明所述构建方法获得的阳性C基因型HBV转基因小鼠的效率非常高，且能够稳定传代。经过反复的实验验证，本发明通过囊胚注射ES细胞得到的小鼠嵌合率有40%~60%，大大提高了小鼠的转基因效率。另外，本发明使用囊胚注射ES细胞的方法，HBV-C基因能够定点重组ES细胞，得到的C型HBV嵌合体小鼠阳性率更高，阳性率为50%，明显高于现有技术获得的C型HBV转基因小鼠。
[0025]另外，本发明转基因小鼠具有与传统转1.3拷贝的C基因型HBV转基因小鼠不同的特点，该模型的H BV的复制和表达效率较高，为进一步研究乙肝发病机制，肝脏病变的发展和转归机制研究，为C型HBV感染后机体的病理改变以及机体免疫系统在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供理想的动物模型。这一模型的建立将填补国内外缺乏此类动物模型的空白，使相关的研究手段更加丰富，也为抗乙肝药物的研发提供更加先进的评价体系和技术平台，为建立乙肝的免疫治疗方法并作出评价提供一种全新的思路和研究平台，可以利用此转基因小鼠模型进行乙肝免疫致病机制的研究及乙肝免疫治疗新方法的探索性研究，并为后续实现这种新的乙肝疾病模型的产业化和批量供应奠定坚实的基础，促进我国乙肝治疗、研究水平的提高。
[0026]本发明具有以下有益效果:
本发明克服了乙型肝炎研究的传统转1.3拷贝的C基因型HBV转基因小鼠HBV复制和表达效率较低等技术问题，提供了一种利用囊胚注射法构建转基因小鼠的方法，该方法能够实现C型HBV定点整合转基因小鼠，获得能稳定传代和高效的C型乙肝疾病模型，即高效复制和表达C型HBV转基因小鼠的构建方法，填补了国内外缺乏此类动物模型的空白。
[0027]另外，本发明构建转基因小鼠使用的ES细胞来源是C57BL/6小鼠，毛色为黑色，而囊胚来源是KM小鼠，毛色为白色，将ES细胞注射到囊胚后，生出的小鼠的毛色是部分是灰的或黑的，而且可以遗传到下一代，这样就可以通过毛色简单地鉴定嵌合率。而且选择繁殖能力强的KM鼠做假孕鼠，产仔率高，母性好。
[0028]本发明构建方法构建得到的转基因小鼠能够全面、真实地反映临床乙肝发生、发展过程，为乙肝发病机制、肝脏病变的发展和转归机制研究、机体免疫系统在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制研究及抗乙肝药物的研发和评价提供理想动物模型，为建立乙肝的免疫治疗方法并作出评价提供了一种全新的思路和研究平台，促进我国乙肝治疗研究水平的提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为1.3倍加长片段C型HBV质粒示意图。
[0030]图2为C型HBV基因定点重组ES细胞的结构示意图。
[0031]图3为本发明构建方法构建得到的阳性嵌合鼠。【具体实施方式】
[0032]以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本【技术领域】常规试剂、设备和方法。
[0033]除非特别说明，本发明实施例所用C57BL/6J小鼠和KM小鼠均为市购。
[0034]实验例I构建1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠 1、胚胎干细胞(ES细胞)系的建立
(I)取怀孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，断颈处死。
[0035](2)用75%酒精将Sll处死的孕鼠消毒，尽量喷湿全身。
[0036](3)打开孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，从输卵管根部及子宫下端分叉处剪下双侧子宫，将双角子宫于阴道处剪断。
[0037](4)注射器吸入M2 (购自美国Sigma公司)作为冲胚液，注射器的针头在使用之前把针尖剪掉磨平灭菌；将注射器从子宫的一端插入子宫腔内2~3mm，夹紧，吹入冲胚液，再从子宫的另一端插入注射器，吹入冲胚液。
[0038](5)将上述冲胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖镜下，用口叼管吸取少量冲胚液，将囊胚吸出。
[0039](6)然后将囊胚放入KSOMaaa胚胎培养基(购自美国Zenith Biotech公司)中，观察，选择比较好的囊胚。
[0040](7)将选择的囊胚吹入预先接种了饲养层细胞(北京思赛因公司提供)的4孔板或24孔板，换用小鼠胚胎干细胞建系培养基(购自北京思赛因公司)，每孔中放I个囊胚。
[0041](8)放入培养箱培养，囊胚逐渐长大，最后贴壁，滋胚层展开，囊胚的内细胞不断增殖。
[0042](9)培养4~6天后，囊胚的内细胞成为一团圆柱形或凸起细胞团，此时可离散囊胚的内细胞团，得到胚胎干细胞系。
[0043]2、本实施例所用的1.3倍加长片段C型HBV质粒由中国人民解放军第302医院赠与，序列全长如SEQ ID N0.1所示。
[0044]所述1.3倍加长片段C型HBV质粒的构建方法为:通过Spe I和Apa I两个酶切位点将1.3倍加长片段C型HBV的DNA片段连接入pcDNA3.1质粒中，得到1.3倍加长片段C型HBV质粒的示意图如附图1所示。
[0045]3、1.3拷贝C基因型HBV电转导到胚胎干细胞(ES细胞)
(1)将培养的胚胎干细胞系(12孔板一个孔长满)用胰酶消化为单个细胞，加入终止培养基(广州科学院与健康研究院提供)终止消化，转移到15mL离心管中1000rpm离心5分钟，去除上清(尽量完全去除干净)，然后用100μL的opt1-MEM (购自美国Gbico公司)悬浮，转移到 1.5mL的离 心管(EP)管中；
(2)加入电转所需的1.3倍加长片段C型HBV质粒5Pg，用移液枪轻轻混匀，再转移到电转杯中，用电转仪进行电转，电转后迅速加入细胞培养基(广州科学院与健康研究院提供)，然后铺到细胞板(6孔板I个孔)中。
[0046](3)第二天，更换培养基为有抗性的培养基(使用Wg/mL的puix)进行筛选)，每天进行换液(抗性的)。[0047](4) 5~7天后，只有转入了质粒的细胞才能生长成集落克隆，分别挑取筛选出来的克隆到96孔板中，每个孔I个细胞克隆。
[0048](5)第二天，将细胞传代到48孔板中，再次长满后，大部分细胞可以用于提取DNA进行PCR鉴定，剩下的细胞继续培养直至鉴定结果出来。
[0049](6)将得到的阳性克隆的细胞进行扩大培养，得到阳性胚胎干细胞系。
[0050]经电转导后，1.3拷贝C型HBV基因能够定点重组ES细胞，定点重组ES细胞的示意图如附图2所示。
[0051 ] 4、阳性胚 胎干细胞囊胚注射
(I) 3.5天KM母鼠通过冲双侧子宫取得囊胚。
[0052](2)将电转导获得的阳性胚胎干细胞系消化重悬成单个细胞。
[0053](3)用激光破膜仪在囊胚的透明带上打孔，用注射针将15~20枚的阳性胚胎干细胞打到囊胚腔里面，然后用KSOMaa胚胎培养基(购自美国Zenith Biotech公司)培养2~3小时后，显微镜下观察囊胚形态恢复。
[0054]5、囊胚移植 (I)假孕母鼠的制备
KM鼠繁殖能力强，产仔率高，母性好，因此选用KM鼠来制备假孕鼠。
[0055]假孕母鼠的制备方法如下:将KM母鼠和KM结扎公鼠按照雌雄比例2:1进行合笼饲养，次晨挑选有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠，即为假孕母鼠，记作0.5天假孕母鼠，而囊胚注射移植于2.5天假孕母鼠。
[0056]将注射好的囊胚移植到2.5天的假孕母鼠的子宫，培育得到1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠。
[0057]6、结果统计
结果共注射囊胚221枚，成活180枚，注射成活率81.45%。共移植假孕雌鼠14只，10只怀孕，假孕雌鼠妊娠率71.4% ;产仔10只，其中2只产后第二天被吃，存活的8只H)代小鼠。
[0058]实验例2实施例1制备1.3拷贝C型HBV转基因小鼠的鉴定 1、小鼠嵌合率的统计
(I)根据小鼠毛色判断小鼠的嵌合率:由于ES细胞来源于黑色毛的C57BL/6J鼠，而囊胚来源于白毛的KM鼠，因而根据出生小鼠黑毛的百分率来判断小鼠的嵌合率。
[0059](2)将得到的嵌合鼠(H)代)和正常的KM鼠合笼。如果得到的Fl代小鼠是嵌合鼠，证明了该H)代嵌合鼠有生殖嵌合，可以遗传到下一代。
[0060]2、ELISA检测转基因小鼠血清和尿液中的乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg )，检测方法如下:
(I)乙肝表面抗原(HBsAg)的检测(ELISA法)
利用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(购自上海科华生物技术有限公司)生产许可证号:沪20110148，批准文号:国药准字S10910113，生产批号:20130105进行检测，检测方法参照说明书进行。
[0061]检测具体操作如下:
S1.配置工作浓度洗涤液，用纯水进行25倍稀释；52.根据实验要求(9个孔，一个空白对照孔，两个阴性对照孔，两个阳性对照孔，4个嵌合鼠样品)，选择9个孔的反应板条；
53.分别加入75PL的4个嵌合鼠样品和阴性对照、阳性对照(阴性对照何阳性对照为试剂盒自带)于反应孔中(预留阳性对照2孔，阴性对照2孔，空白对照I孔)。然后用封片纸覆盖反应板，将反应板置于37°C孵育60min ；
54.取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴、阳性对照的孔中加入50μL酶结合物(试剂盒自带)，空白对照孔不加，轻轻震荡10s，用封片纸覆盖反应条，将反应板置于37°C孵育30min ；
55.洗板:取出反应板，撕去封片，弃去孔内液体，用步骤SI配置的工作浓度洗涤液注满各孔，静置30~60s，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干；
56.在所有孔内加入显色剂A、显色剂B各50μL，混匀；轻轻震荡10s，用封片纸覆盖反应条，将反应板置于37°C孵育30min ；
57.在所有孔内加入50μL终止液，振荡反应板5s;酶标仪读数，波长为450nm和630nm双波长，先用空白孔调零，然后读取各孔OD值。
[0062]结果判断:C0V=阴性对照平均值+0.1。当待测样本OD值≥COV时，判断为阳性；当待测样本OD值〈C0V时，判断为阴性。
[0063](2)乙肝 e 抗原(HBeAg) (ELISA 法)
乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(购自上海科华生物技术有限公司)生产许可证号:沪食药监械生产许20030916号，产品注册号:国食药监械(准)字2012第3400740号，产品标准号:YZB/国2142-2012生产批号:20121206进行检测，检测方法参照说明书进行。
[0064]检测具体操作如下:
S1.配置工作浓度洗涤液，用纯水进行25倍稀释；
S2.根据实验要求，选择9个孔的反应板条(9个孔，一个空白对照孔，两个阴性对照孔，两个阳性对照孔，4个嵌合鼠样品)；
S3.每孔加入待测样品50μL，设阴性对照、阳性对照(阴性对照何阳性对照为试剂盒自带)各2孔，每孔加入阴性对照(或阳性对照)各50μL，并设空白对照I孔；
S4.每孔加入50μL酶结合物(空白对照孔不加)，充分混匀，封板，置于37°C孵育30min ；
S5.洗板:弃去孔内液体，用步骤SI配置的工作浓度洗涤液注满各孔，静置5s，甩干，重复5次后拍干；
S6.每孔加入显色剂A、显色剂B各50μL，混匀，封板，置于37°C孵育15min；
S7.每孔加入终止液50μL，混匀；酶标仪读数，波长为450nm和630nm双波长，先用空白孔调零，然后读取各孔OD值。
[0065]结果判断=COV=阴性对照平均OD值X 2.1 (阴性对照OD值低于0.050按0.050计算，高于0.050按实际OD值计算)。当待测样本OD值≥ COV时，判断为阳性；当待测样本OD值〈C0V时，判断为阴性。
[0066]3、鉴定结果
8只H)代小鼠中有阳性嵌合小鼠4只，嵌合鼠阳性率为50%。
[0067]实验例3实施例1制备1.3拷贝C型HBV转基因小鼠的传代鉴定1、将实施例制备得到的嵌合鼠(H)代)和正常的KM鼠合笼，得到Fl代小鼠32只。
[0068]2、小鼠嵌合率的统计，以及ELISA检测转基因小鼠血清和尿液中的乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的方法同实施例2。
[0069]3、鉴定结果
(1)32只Fl代小鼠中有5只为阳性嵌合小鼠，嵌合鼠阳性率为15.6%，表明本发明方法构建得到能够传代的嵌合鼠。
[0070](2) 5只Fl代嵌合小鼠分别编号为BI~B5。
[0071]ELISA检测乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的结果显示，BI~B5小鼠血清和尿液中的HBsAg和HBeAg均为阳性。测得OD值如表1所示:
表1 ELISA检测Fl代嵌合小鼠血清和尿液中的HBsAg和HBeAg
【权利要求】
1.一种1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的构建方法，其特征在于，步骤如下: .51.胚胎干细胞系的建立； .52.将1.3倍加长片段C型HBV质粒电转导到胚胎干细胞，经过鉴定得到阳性的胚胎干细胞，进行扩大培养； .53.把阳性胚胎干细胞注射到囊胚中，将注射好的囊胚移植到假孕母鼠的子宫，培育得到1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，SI所述胚胎干细胞系的建立方法如下: .511.取怀孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，断颈处死； .512.用酒精将Sll处死的孕鼠消毒； .513.打开孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，从输卵管根部及子宫下端分叉处剪下双侧子宫，将双角子宫于阴道处剪断； .514.注射器吸入冲胚液，注射器的针头在使用之前把针尖剪掉磨平灭菌；将注射器从子宫的一端插入子宫腔内，夹紧，吹入冲胚液，再从子宫的另一端插入注射器，吹入冲胚液； .515.将上述冲胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖镜下，用口叼管吸取少量冲胚液，将囊胚吸出； .516.然后将囊胚放入胚胎培养基中，观察，选择比较好的囊胚； .517.将选择的囊胚吹入预先接种了饲养层细胞的细胞板，换用小鼠胚胎干细胞建系培养基，每孔中放I个囊胚； .518.放入培养箱培养，囊胚逐渐长大，最后贴壁，滋胚层展开，囊胚的内细胞不断增殖； .519.培养4~6天后，囊胚的内细胞成为一团圆柱形或凸起细胞团，此时可离散囊胚的内细胞团，得到胚胎干细胞系。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S2所述电转导的方法如下: .521.将培养的胚胎干细胞系用胰酶消化为单个细胞，加入终止培养基终止消化，离心，去除上清，然后用减血清培养基opt1-MEM进行悬浮； .522.悬浮液中加入电转导所需的C型HBV质粒，混匀，转移到电转杯中，用电转仪进行电转导，电转导后迅速加入细胞培养基，然后铺到细胞板中； .523.第二天，更换培养基为嘌呤霉素抗性的培养基，每天进行换液； .524.培养5~7天后，只有转入了质粒的细胞才能生长成集落克隆，分别挑取筛选出来的克隆到细胞板中，每个孔I个细胞克隆； .525.第二天，将细胞传代到新的细胞板中，再次长满后，细胞用于提取DNA进行PCR鉴定，得到阳性克隆； . 526.将得到的阳性克隆的细胞进行扩大培养，得到阳性胚胎干细胞系。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S3所述注射的方法如下: .531.将电转导获得的阳性胚胎干细胞系消化重悬成单个细胞； .532.用激光破膜仪在囊胚的透明带上打孔，用注射针将阳性胚胎干细胞打到囊胚腔里面，然后用KSOMaa胚胎培养基培养2~3小时后，显微镜下观察囊胚形态恢复。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S3所述的假孕母鼠通过如下方法获得:将KM母鼠和KM结扎公鼠按照雌雄比例2:1进行合笼饲养，次晨挑选有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠，即为假孕母鼠，记作0.5天假孕母鼠，而囊胚移植于2.5天假孕母鼠。
6.根据权利要求1所述所述构建方法制备得到的1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠在乙肝相关研究领域方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，1 .3拷贝C基因型HBV转基因小鼠在研究机体免疫系统抗乙肝病毒感染、免疫致病过程中和抗乙肝病毒药物开发方面的应用。
【文档编号】C12N5/0735GK103952441SQ201410011674
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】刘光泽, 陈媚娟, 李秀梅, 谢勇, 张振伟, 孔祥平 申请人:中国人民解放军第四五八医院