一种检测柑橘衰退病毒t3基因型的实时荧光定量rt-pcr方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，包括以下步骤：1）提取待测样品总RNA；2）以所提取的RNA为模板，利用T3基因型的特异性引物T3-4R进行反转录反应，得到反转录产物cDNA；3）利用特异性引物T3-4F和T3-4R，以反转录产物cDNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR检测；特异性引物T3-4F和T3-4R序列如下：T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT;T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA。该检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简便、重复性好的特点。
【专利说明】—种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种柑橘衰退病毒的检测方法，尤其是一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]目前生物学中定量检测的方法有转磷光免疫层析技术、实时荧光定量PCR技术等，其中实时突光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RTFQPCR)技术在目前定量检测技术中使用最广泛，精确度最高。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
[0003]Taqman实时荧光定量PCR技术是1996年美国PE公司发明的一种高灵敏度PCR试验方法。其技术原理是在PCR的反应体系中加入一条带有双荧光标记的探针，该探针能与模板核酸发生特异性杂交。探针的5’端标记荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素，荧光发射值在518nm处)，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA (6-羧基四甲基罗丹明，荧光发射值在582nm处)。探针结构完整时，5’端FAM所发出的荧光被3’端TAMRA所吸收，不出现荧光信号的变化。随着PCR反应的进行，当合成的新链移动到探针结合的位置时，Taq聚合酶将探针切断，探针的完整性遭到破坏，3’端的淬灭作用被解除，5’端的FAM荧光信号被释放出来。PCR每复制一个核苷酸片段，就有一个探针被切断，同时一个荧光信号被释放出来，产物与荧光信号产生一对一的对应关系。随着产物的增加，荧光信号亦随之增强，当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值，即为阈值)，此时的循环次数即循环阈值Ct (cycle threshold, Ct)被记录下来。该循环参数Ct和PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系。利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟合制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以准确的确定起始模板的数量，因此根据PCR产物的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
[0004]SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR GreenI在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。[0005]此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很闻。
[0006]由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的柑橘衰退病是柑橘生产中的重要病害之一，对全世界的柑橘产业造成了严重的损失。CTV是目前已知植物病毒中基因组最大的病毒，其病毒颗粒呈纤维状弯曲，大小为llnmX2000nm。其基因组为包含12个开放阅读框(ORFs)和5’端及3’端非翻译区(UTRs)的一条正义单链RNA。CTV主要通过带毒繁殖材料嫁接和蚜虫传播，其中褐色橘蚜是最有效的传播媒介。已有研究表明CTV存在不同的变异株系，导致柑橘不同程度的损失。目前已有报道的能引发柑橘表现症状的CTV有4种不同基因型(T36、T30、T3、VT):T36基因型CTV分离株主要引起速衰症状，T3、VT基因型CTV分离株主要引起茎陷点症状。目前已有许多技术检测和区别不同基因型CTV分离株，应用TaqMan探针法能够对Τ36、Τ30、VT三种基因型CTV分离株进行定量分析，但利用荧光定量RT-PCR特异、高效检测Τ3基因型CTV分离株的技术体系尚未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种检测柑橘衰退病毒Τ3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，用于柑橘衰退病毒Τ3基因型的特异、灵敏、快速、高效检测。
[0008]本发明所采用的技术方案如下:一种检测柑橘衰退病毒Τ3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，包括如下步骤:
[0009]I)提取待测样品总RNA作为反应模板；
[0010]2)以步骤I所提取的RNA为模板，利用Τ3基因型的特异性引物T3-4R进行反转录反应，得到反转录产物cDNA ；
[0011]3)利用特异性引物T3-4F和T3-4R，以及步骤2得到的反转录产物cDNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR检测；
[0012]所述的特异性引物T3-4F和T3-4R序列如下:
[0013]T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT
[0014]T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA
[0015]所述步骤2的反转录反应，反应体系为:总反应体系10 μ L,其中RNA反应模板4μ L,5XRT-buffer 2 μ L，浓度为 10mM/L 的 dNTPs 0.5 μ L，浓度为 10 μ mol/L 的引物T3-4R 0.5 μ L，浓度为30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5 μ L,浓度为100U/ μ L的反转录酶RTase 0.5 μ L，无RNase超纯水2 μ L，；反应程序为:42°C反转录30分钟，94°C加热I分钟。
[0016]所述步骤3的实时荧光定量PCR反应，反应体系为:总反应体系20 μ L，其中2 X SYBR Green Supermix 10 μ L，浓度为 10 μ mol/L 的引物 T3-4F 和 T3-4R 各 0.2 μ L，无RNase超纯水8.6 μ L，步骤2得到的反转录产物cDNA模板I μ L ;PCR扩增程序为:95°C预变性30秒，95 °C变性5秒，63 °C退火15秒，72°C延伸20秒，40个循环；
[0017]所述步骤3的实时荧光定量PCR反应检测，以柑橘Fbox基因为内参照基因，采用2_Δ "ct方法对CTV T3基因进行相对定量分析。
[0018]有益效果:本发明建立了检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、操作简便、重复性好等特点。根据柑橘衰退病毒T3基因型分离株的ORFla基因所设计的特异引物在退火温度为63°C时，融解曲线仅见单一峰，同时用于T36、T30、VT型CTV检测时无扩增峰，说明该引物特异性好。不同浓度cRNA的扩增曲线显示该实时荧光定量方法能检测到最少2 X IO1拷贝/ μ L，而常规的RT-PCR只能检测到2 X IO3拷贝/ μ L，表明实时荧光定量RT-PCR检测灵敏度比常规RT-PCR检测提高了100倍。该检测方法体系对标准品检测的标准曲线显示其扩增效率为97.1%，相关性系数为
0.992，该反应体系扩增效率高。该方法组内重复检测的变异系数最大为0.57%，组间重复检测各梯度的变异系数最大为2.94%，说明该方法具有良好的重复性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明特异性引物对T3-4F/T3-4R在退火温度63°C的融解曲线图。
[0020]图2是柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR检测的标准品的标准曲线图。
[0021]图3是不同浓度cRNA的扩增曲线图，从左到右的曲线的稀释倍数依次是:109、108、17Uo6UO5UO4UO3UO2UO10
[0022]图4是不同浓度cRNA的普通RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图，M:1OObp DNA分子量标准，I~9的稀释倍数依次是=19Uo8Uo7Uo6Uo5Uo4Uo3Uo2Uo^图5是柑橘衰退病毒T36、T30、VT、T3基因型的实时荧光定量RT-PCR检测图。 【具体实施方式】
[0023]本发明中的柑橘衰退病T3基因型分离株由美国佛罗里达大学柑橘研究与教育中心William Dawson教授赠送。柑橘衰退病T3基因型的全序列公布在NCBI网站上，ID号为DQ355053.1，ORFla基因序列在此全基因序列中有标注。
[0024]dNTP (deoxy-ribonucleoside triphosphate)为脱氧核糖核苷三憐酸(天根公司，中国)，5\町-131^€61 (Τ0Υ0Β0，日本)，RNasin(RNase Inhibitor)为 RNA 酶抑制剂(天根公司，中国)，RTase (Reverse Transcriptase)为反转录酶(Τ0Υ0Β0,日本)，SYBR GreenSupermix为荧光染料(TAKARA，日本)。
[0025]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
[0026]实施例一、提取待测柑橘植株的总RNA，按照如下步骤操作:
[0027]I)取0.08g柑橘叶片，液氮充分研磨后加入预先放置Iml Trizol溶液(Invitrogen,美国)的1.5ml的离心管中，润旋混匀Imin,然后室温放置IOmin,将离心管在12900rpm，4°C下离心 Imin ；
[0028]2)取上清液Iml置于新的1.5ml离心管中，并加入200 μ L氯仿，涡旋混匀，4°C静置 IOmin ；
[0029]3)将步骤2中的离心管在12900rpm，4°C离心5min，取上清液置于新的1.5ml离心管中，加入等体积的水饱和酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)溶液，涡旋混匀，4°C放置IOmin ；
[0030]4)将步骤3中的离心管在12900rpm，4°C离心5min，取上清液置于新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(体积比24:1)溶液，涡旋混匀，4°C放置IOmin ；
[0031]5)将步骤4中的离心管在12900rpm，4°C离心5min，取上清液置于新的1.5ml离心管加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，_20°C放置lh-2h，然后12000rpm，4°C离心10min，弃上清液，再离心15s用枪头吸弃上清液；
[0032]6)在步骤5中的离心管中加入用DEPC水(用二乙基焦碳酸酯和ddH20配制的体积百分比为0.1%的溶液)配制的75%的乙醇溶液Iml,颠倒混匀，在8000rpm,4°C下离心3min,弃上清液；再离心15s用枪头吸弃上清液，重复2次；
[0033]7)将含有RNA沉淀的步骤6中的离心管置于通风橱中室温干燥2_3min，加入50 μ L DEPC 水溶解 RNA。
[0034]实施例二、建立实时荧光定量RT-PCR检测体系，按照如下步骤操作:
[0035]I)以实施例一所提取的RNA为模板，使用柑橘衰退病毒Τ3基因型的特异性引物T3-4R进行反转录反应，反转录体系为:总体积10 μ L，其中RNA模板4 μ L，5XRT-buffer2 μ L，无 RNase 超纯水 2 μ L，浓度为 lOmM/L 的 dNTPs 0.5 μ L,浓度为 10 μ mol/L 的 T3-4R引物0.5 μ L，浓度为30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5 μ L，浓度为100U/μ L的反转录酶RTase 0.5 μ L0反应程序为:42°C反转录30min，94°C加热lmin。得到反转录产物cDNA。
[0036]2)以步骤I得到的反转录产物cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为:总体积 20 μ L，其中 2 X SYBR Green Supermix 10 μ L，浓度为 10 μ mol/L 的引物T3-4F和T3-4R各0.2 μ L，无RNase超纯水8.6 μ L，反转录产物cDNA模板I μ L。PCR扩增程序为:95°C预变性30s，95°C变性5s，63°C退火15s，72。。延伸20s，40个循环。得到PCR扩增目的片段产物，仪器自动进行实时荧光定量分析。其中，熔解曲线分析:65°C~95°C，每升高0.5°C检测I次荧光信号。得到退火温度为63°C的融解曲线，如图1所示，在退火温度为63 °C时仅见单一峰。
[0037]采用上述步骤1和2同时对柑橘衰退病毒了36、了30、￥1\了3基因型用引物了3_4?和T3-4R进行实时荧光定量RT-PCR检测。如图5所示，只有T3基因型出现扩增，T36、T30、VT均未出现扩增。说明该引物对的特异性好。
[0038]所述引物T3-4F和T3-4R的碱基序列如下:
[0039]T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT
[0040]T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA
[0041]实施例三、标准品cRNA的制备及标准曲线的建立
[0042]一、制备标准品cRNA，按照如下步骤操作:
[0043]I)采用实施例一的方法提取柑橘衰退病T3基因型分离株(由美国佛罗里达大学柑橘研究与教育中心William Dawson教授赠送)的总RNA。
[0044]2)以步骤I所提取的RNA为模板，使用柑橘衰退病毒T3基因型的特异性引物T3-4R进行反转录反应，反转录体系为:总体积10 μ L，其中RNA模板4 μ L，5 X RT-buf fer2 μ L，无 RNase 超纯水 2 μ L，浓度为 lOmM/L 的 dNTPs 0.5 μ L,浓度为 10 μ mol/L 的 T3-4R弓丨物0.5 μ L，浓度为30U/ μ L的RNA酶抑制剂RNasin0.5 μ L，浓度为100U/ μ L的反转录酶RTase 0.5μ L0反应程序为:42°C反转录30min，94°C加热lmin。得到反转录产物cDNA。
[0045] 3)以步骤2得到的反转录产物cDNA为模板，进行普通RT-PCR反应，反应体系为:总体积25 μ L，其中10 X buffer (Mg2+) 2.5 μ L，浓度均为10 μ mol/L的引物T3-4R和插入了启动子T7的修饰引物T3-T7-4F各0.5 μ L，浓度为10mM/L的dNTPs 0.5 μ L，无RNase超纯水19.8 μ L，浓度为5U/ μ L的Ex-Taq酶(TAKARA,日本)0.2 μ L，反转录产物cDNA模板I μ L。PCR扩增程序为:95°C预变性30s，95°C变性5s，63°C退火20s，72°C延伸20s，35个循环。得到PCR扩增产物。
[0046]T3-T7-4F:
[0047]GATCACTAATACGACTCACTATAGGGTCTAAATTCTACCCGAGGCAT(下划线为 T7 启动子序列，启动子前面6个碱基为保护碱基)
[0048]T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA
[0049]4)将步骤3得到的PCR扩增产物经电泳切胶回收纯化后作为模板，用T7体外转录试剂盒(Τ0Υ0Β0,日本)根据说明书进行体外转录得到cRNA,并用RNase-Free Dnase
1(Promega，美国)对cRNA进行纯化，纯化后用分光光度计测定cRNA浓度，_20°C保存备用。用下列公式计算cRNA的拷贝数:
[0050]拷贝数(copies/μ L) =6.02 X IO23 (copies/ μ L) X cRNA 浓度(g/ μ L) / 质量 MW(g/mol)[0051]其中:质量MW=cRNA 喊基数(bp) X 330dalton/bp
[0052]经计算得到cRNA拷贝数为2 X IO13拷贝/ μ L。
[0053]二、建立标准曲线，按照如下步骤操作:
[0054]I)将标准品cRNA用EASY Dilution (TAKARA,日本)按10倍梯度稀释为2X IO1~
2X IO9拷贝/ μ L，共9个梯度作为cRNA模板，每一浓度设定3个技术重复，同时设定阴性对照、空白对照和阳性对照，进行PCR扩增。反应体系:总体积20 μ L，其中2X SYBR GreenqPCR Mix (TAKARA,日本)10 μ L、10 μ mol/L 正反向引物 T3-4F 和 T3-4R 各 0.2 μ L，cRNA 模板 IyL和ddH208.6 yL ;荧光定量PCR 扩增条件:95°C 预变性 30s，95°C 5s, 63 °C 15s，72。。20s, 40个循环。
[0055]2)步骤I的PCR程序结束后仪器自动进行实时荧光定量检测。熔解曲线分析:65°C~95°C，每升高0.5°C检测I次荧光信号。仪器自动生成标准曲线。如图2所示，柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR检测的标准品的标准曲线，标准曲线的横坐标为模板数的对数值，纵坐标为临界循环值Ct，可见扩增效率为97.1%，相关性系数为0.992，扩增效率高。
[0056]浓度为2X IO1~2X IO9拷贝/ μ L的9个梯度cRNA模板的PCR产物进行实时荧光定量检测，得到的扩增曲线如图3所示，cRNA模板浓度从左到右依次是2 X 109-2 X IO1拷贝/ μ L，可见采用实时荧光定量PCR检测，其检测下限为2 X IO1拷贝/ μ L。
[0057]以“制备标准品cRNA”方法的步骤2中得到的cDNA为模板，设定2 X IO1~2 X IO9拷贝/ μ L的9个浓度梯度，进行普通的RT-PCR反应，总反应体系25 μ L，其中cDNA模板
1μ L, ddH20 水 19.8 μ L，10 X buffer (含 Mg2+) 2.5 μ L,浓度为 10mM/L 的 dNTPs 0.5 μ L,浓度为 1(^11101/1的引物了3-4?、了3-41?各0.5 4 1^，浓度为 5U/μ L 的 Ex-Taq 酶(TAKARA，日本)
0.2μ L0 PCR 扩增程序:95°C 4min, (95°C 30s, 63°C 20s, 72°C 20s) X 35 循环，72°C延伸5min。将该9个PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图片如图4所示，可见普通的RT-PCR凝胶电泳检测只能检测到2X IO3拷贝/ μ L0而实时荧光定量RT-PCR能检测到
2X IO1拷贝/ μ L，普通的RT-PCR只能检测到2 X IO3拷贝/ μ L，实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度比普通的RT-PCR提高了 100倍。
[0058]实施例四、本发明的重复性检测:对不同浓度的标准品cRNA进行实时荧光定量RT-PCR重复检测[0059]以实施例三中的浓度为2 X IO4~2 X IO8拷贝/ μ L的5个梯度的标准品cRNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR，反应体系以及PCR扩增和检测程序同实施例三，每个梯度做3个重复作为组间重复，且每个重复进行3次检测作为组内重复，计算Ct值、标准差(SD)和变异系数(CV)，结果如表一所示，扩增曲线及统计学分析结果表明，各梯度组内重复检测的变异系数最大为0.57%，表明该方法具有较好的组内重复性。而进行的组间重复性试验结果显示，各梯度的变异系数最大为2.94%，表明该方法具有较好的组间重复性。
[0060]表一不同浓度梯度的标准品cRNA重复检测结果分析表
[0061]
【权利要求】
1.一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，包括以下步骤: 1)提取待测样品总RNA作为反应模板； 2)以步骤I所提取的RNA为模板，利用Τ3基因型的特异性引物T3-4R进行反转录反应，得到反转录产物cDNA ； 3)利用特异性引物T3-4F和T3-4R，以及步骤2得到的反转录产物cDNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR 检测； 所述的特异性引物T3-4F和T3-4R序列如下:
T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT
T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA。
2.根据权利要求1所述的一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，其特征在于: 所述步骤2的反转录反应，反应体系为:总反应体系10 μ L，其中RNA反应模板4 μ L，5XRT-buffer 2 μ L，浓度为 10mM/L 的 dNTPs (λ 5 μ L，浓度为 10 μ mol/L 的引物 T3-4R0.5 μ L，浓度为30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5 μ L,浓度为100U/ μ L的反转录酶RTase0.5 μ L，无RNase超纯水2 μ L ;反应程序为:42°C反转录30分钟，94°C加热I分钟。
3.根据权利要求1所述的一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，其特征在于: 所述步骤3的实时荧光定量PCR反应，反应体系为:总反应体系20 μ L，其中2 X SYBRGreen SupermixlO μ L，浓度为 10 μ mol/L 的引物 T3-4F 和 T3-4R 各 0.2 μ L，无 RNase 超纯水8.6 μ L，步骤2得到的反转录产物cDNA模板I μ L ；PCR扩增程序为:95°C预变性30秒，95°C变性5秒，63 °C退火15秒，72 °C延伸20秒，40个循环。
4.根据权利要求1所述的一种检测柑橘衰退病毒T3基因型的实时荧光定量RT-PCR方法，其特征在于: 所述步骤3的实时荧光定量PCR反应检测，以柑橘Fbox基因为内参照基因，采用2_Λ Δε?方法对CTV Τ3基因进行相对定量分析。
【文档编号】C12Q1/70GK103937909SQ201410142402
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】陶珍珍, 周常勇, 周彦, 宋震, 李中安 申请人:中国农业科学院柑桔研究所