专利名称：一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法
技术领域：
本发明涉及三角帆蛘优良品种的选育，具体说是一种三角帆蛘基因型快速精确鉴 定方法，属分子生物学技术领域。
背景技术：
我国是世界第一产珠大国，目前珍珠总产量高达1800多吨，占世界珍珠总产量的 90%以上。而在这1800多吨的总产量中，淡水珍珠占98%以上，其中90%以上是由三角帆 蛘G^rioASi1S育出的。当前，已形成了以浙江诸暨山下湖珍珠市场和江苏渭塘 珍珠市场为辐射中心的淡水珍珠产业群，2009年全世界珍珠及相关产品销售额约100亿美 元，中国只有15亿美元左右。我国珍珠产业正在堕入有“名”无“利”的“高产陷阱”。与骄 人的产量相比，质量低劣与“下游”产品开发乏力，使中国珍珠产业链呈现出畸形的“头重脚 轻”，中国珍珠的“珍宝”形象难以实至名归。培育高产、优质、抗逆能力强的优良品种已是 我国淡水珍珠产业发展的迫切需求。三角帆蛘是我国特有的优质淡水育珠蛘，主要分布于河北、山东、安徽、江苏、浙 江、江西、湖北和湖南等省大、中、小型湖泊及其周围河流内。目前，上海海洋大学通过我国 三角帆蛘优异种质筛选工作，发现鄱阳湖、洞庭湖、太湖三角帆蛘种质优异，但这些三角帆 蛘是野生蛘，仍需进一步改良和培育。利用不同的育种和生物技术手段，将不同的品系或品 种的优良性状进行转移、整合或固定，是培育良种的有效的途径。由于三角帆蛘具有如下两 大特点一是出生时个体非常小，无法进行物理标记，这是难于利用陆生动物已行之有效的 家系选育技术的原因之一；二是三角帆蛘的生存介质是水体，各养殖池之间生态差异较大， 分池饲养获得的差异有时被环境差异所淹没，得到的差异很难代表遗传差异使育种效率大 大降低；三角帆蛘的这两个特点使传统选育方法见效很慢，尤其是对低遗传力的性状选育 效率低下。近十年来，国际上贝类遗传育种的研究趋势是在鉴定经济性状相关的分子标记 的基础上，将选择育种与现代育种生物技术特别是分子遗传标记技术结合，形成分子标记 辅助育种技术。分子标记辅助育种技术已在罗非鱼、虹鳟等水产动物育种工作中发挥了重 要作用。分子标记辅助育种技术的核心内容之一就是鉴定选育后代基因型，目前三角帆蛘 基因型的鉴定仍采用酚氯仿法提取DNA，然后用微卫星标记引物进行PCR鉴定，该方法费时 费力，且DNA提取过程对人体有害。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有三角帆蛘基因型鉴定方法所存在的不足 而提供一种三角帆蛘基因型快速精确鉴定方法。本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现 三角帆蛘基因型快速精确鉴定方法，具体包括如下
1、三角帆蛘基因组DNA的抽提步骤取三角帆蛘组织用Chelex-IOO溶液，从三角帆蛘组织中抽提出含基因组DNA的上清 液，用0. 8-1%的琼脂糖胶电泳检测；
2、三角帆蛘SSR序列扩增步骤
采用上述上清液作为DNA模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶检测， EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录；
3、三角帆蛘基因型鉴定
凝胶电泳预检测合格的PCR扩增反应产物，采用ABI3730核酸分析仪检测，用 GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析，并由Excel格式输出结果。(请 补充如何分析)
所述三角帆蛘基因组DNA的抽提步骤，具体如下
A.将Chelex-IOO溶于无菌水中，配制成Chelex-IOO溶液；
B.取500uL该Chelex-IOO树脂溶液于1.5mL的Eppendorf离心管中；
C.取IXIX Imm的三角帆蛘组织放入盛有Chelex-100的离心管中，加入10mg/mL的 蛋白酶K15uL ；
D.离心管放在摇床上(温度50-60°C，转速50rpm)震荡lh，接着将该混合液在100°C 下温浴15-30min，然后将蛋白质彻底变性的混合液放在4°C -20°C条件下保存；
E.混合液在振荡器上振荡IOsec,然后10，000-15，OOOrpm离心2_5min，上清中含有
DNA ；
F.取5uL上清液，用1%的琼脂糖胶电泳检测；
上述步骤A中，在60°C条件下将Chelex-100溶于无菌水中，配置成10%浓度的 Chelex-100 溶液。所述步骤D步中，将蛋白质彻底变性后的混合液放在-20°C条件下保存。所述三角帆蛘SSR序列扩增步骤具体如下
所述三角帆蛘SSR序列扩增步骤中微卫星的正向引物采用FAM荧光染料进行标记； PCR 反应体系为 25μ ，含 IOXBuffer 2. 5PL，Mg2+ 2mmol/dm3, dNTP 0. 2mmol/dm3, Taq DNA 聚合酶IU，上、下游引物各0. 2Mmol/dm3,模板DNA5uL ；PCR反应条件94°C预变性3min， (94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s)进行38个循环，最后72°C延伸5min ； PCR扩 增产物经1. 5%琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录。本发明中基因组DNA抽提方法区别于已有的酚氯仿DNA提取法，在DNA提取过程 中实现了细胞裂解和DNA萃取的同步化，节约了 DNA萃取和纯化步骤，省时省力，且对人体 无害；其次，本发明中的三角帆蛘微卫星序列扩增的PCR体系是更优化的；另外，本发明 采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分 析，精确度可达lbp，建立了三角帆蛘微卫星精确分型方法，克服了传统琼脂糖凝胶电泳和 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测灵敏度低，准确性差的问题。
具体实施例方式
应理解本发明所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明 构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发 明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技 术内容，已经全部记载在权利要求书中。
本具体实施方式
的三角帆蛘基因型鉴定 1.三角帆蛘基因组DNA的提取
首先将Chelex-IOO在60°C条件下溶于无菌水中，配制浓度为10%的Chelex-IOO溶液， 然后取500uL10%的Chelex-IOO树脂溶液于1. 5mL的Eppendorf离心管中，再取少量三角 帆蛘组织(约IX IX Imm)放入盛有Chelex-100的离心管中，加入10mg/mL的蛋白酶K15uL， 将离心管放在摇床上(温度55 °C，转速50rpm)震荡lh，接着将该混合液在IOiTC条件下 温浴15min，将蛋白质彻底变性，该混合液可以放在-20°C保存。使用前，混合液在振荡器上 振荡lOsec，然后13，000印111离心31^11，上清中含有0嫩，取51^上清液，用1%的琼脂糖胶电 泳检测。2.三角帆蛘SSR序列扩增
采用上述上清液作为DNA模板，进行PCR扩增，其中，微卫星的正向引物须采用FAM等 荧光染料进行标记，gCAM2-ATGT-Fl :FAM_ACAAAATGTTCGCAAATAACTGTA，gCAM2_ATGT_Rl CACTCGGAATGCCTCCCTGATT。PCR 反应体系为 25μ ，含 IOXBuffer 2. 5PL，Mg2+ 2mmol/dm3, dNTP 0. 2mmol/dm3,Taq DNA 聚合酶 1U，上、下游引物各 0. 2Mmol/dm3，模板 DNA5uL。PCR 反 应条件先94°C预变性3min，而后94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，共进行38 个循环，最后72°C延伸5min。 PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成 像系统下观察并拍照记录。3.三角帆蛘基因型鉴定
凝胶电泳预检测合格的PCR扩增反应产物，采用ABI3730核酸分析仪检测，用 GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析，并由Excel格式输出结果。
权利要求
三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，具体包括如下1)、三角帆蚌基因组DNA的抽提步骤取三角帆蚌组织用Chelex 100溶液，从三角帆蚌组织中抽提出含基因组DNA的上清液，用0.8 1%的琼脂糖胶电泳检测；2)、三角帆蚌SSR序列扩增步骤采用上述上清液作为DNA模板，进行PCR扩增，PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录；3)、三角帆蚌基因型鉴定凝胶电泳预检测合格的PCR扩增反应产物，采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper软件(Applied Biosystems)进行基因型分析，并由Excel格式输出结果。
2.如权利要求1所述的三角帆蛘基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，所述三角帆 蛘基因组DNA的抽提步骤，具体如下A.将Chelex-IOO溶于无菌水中，配制成Chelex-IOO溶液；B.取500uL该Chelex-IOO树脂溶液于1.5mL的Eppendorf离心管中；C.取1X 1 X Imm的三角帆蛘组织放入盛有Chelex-100的离心管中，加入10mg/mL的 蛋白酶K15uL;D.离心管放在摇床上(温度50-60°C，转速50rpm)震荡lh，接着将该混合液在100°C 下温浴15-30min，然后将蛋白质彻底变性的混合液放在4°C -20°C条件下保存；E.混合液在振荡器上振荡IOsec,然后10，000-15，OOOrpm离心2_5min，上清中含有DNA ；F.取5uL上清液，用1%的琼脂糖胶电泳检测；如权利要求2所述的三角帆蛘基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，所述步骤A中， 在60°C条件下将Chelex-100溶于无菌水中，配置成10%浓度的Chelex-100溶液。
3.如权利要求2所述的三角帆蛘基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，所述步骤D 步中，将蛋白质彻底变性后的混合液放在-20 V条件下保存。
4.如权利要求1所述的三角帆蛘基因型快速精确鉴定方法，其特征在于，所述三角帆 蛘SSR序列扩增步骤具体如下所述三角帆蛘SSR序列扩增步骤中微卫星的正向引物采用FAM荧光染料进行标记； PCR 反应体系为 25μ ，含 IOXBuffer 2. 5PL，Mg2+ 2mmol/dm3, dNTP 0. 2mmol/dm3, Taq DNA 聚合酶IU，上、下游引物各0. 2Mmol/dm3,模板DNA5uL ；PCR反应条件94°C预变性3min， (94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s)进行38个循环，最后72°C延伸5min ； PCR扩 增产物经1. 5%琼脂糖凝胶检测，EB染色，于凝胶成像系统下观察并拍照记录。
全文摘要
本发明的一种三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法，包括三角帆蚌基因组DNA的快速提取，三角帆蚌微卫星序列扩增和三角帆蚌基因型鉴定的方法。首先，利用Chelex100能有效除去非核酸有机物的特点，建立了Chelex-100DNA快速提取方法，实现了DNA提取过程中细胞裂解和DNA萃取的同步化；然后根据Chelex100法提取的DNA溶液特点，优化PCR反应体系，建立了三角帆蚌微卫星序列扩增的方法；最后，采用ABI3730核酸分析仪检测，用GeneMapper软件(AppliedBiosystems)进行基因型分析，建立了三角帆蚌基因型快速精确鉴定方法。此方法具有高效、快速、准确、对人体无害等优点。
文档编号C12Q1/68GK101993955SQ201010580578
公开日2011年3月30日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者李家乐, 林静云, 白志毅, 罗明 申请人:上海海洋大学