专利名称：：猪白色被毛纯合基因型的检测方法
技术领域：
：本发明属于猪的分子生物学领域。具体地说，本发明涉及猪白色被毛基因型的纯合性检测方法。
背景技术：
：猪的毛色类型大体可以分为两类全白色和非全白色，非全白色包括了野猪色、全黑色、全红色、白底带黑斑和黑色花斑等各种颜色。毛色都是由基因控制的，其中各基因的显隐性关系是白色座位基因〉非白色座位基因(Spillmanetal.1906)，Wright在1918年提出猪的白毛色由两个显性基因控制的假说，Hetzer在1945年约克夏猪和长白猪)通常I基因是纯合的(I/I)。有色品种如巴克夏猪、波中猪、大黑猪、杜洛克猪、皮特兰猪以及有色的中国品种是隐性基因的纯合体(i/i)。目前发现在I位点除了I和i等位基因外，还有r(Johanssonetal.1992)等其它等位基因，值得注意的是I等位基因对于其它等位基因是显性的。KIT基因与I基因等位。猪的KIT基因由21个外显子组成，整个编码序列长2919bp。对编码序列中2892bp的片段进行了克隆和RT-PCR产物测序发现该位点上存在至少三个等位基因i，r，i。它们的显性等级为I〉T>i。等位基因I对应于完全显性白毛色，分子结构上除带有正常KIT基因(称为KIT1)外，还携带含有两种突变的全长KIT基因拷贝(称为KIT2),突变之一发生在内含子18上，缺失四个碱基，导致KIT基因表达失调，称为调节突变。另一突变发生在内含子17的第一个核苷酸位置上，导致G—A的剪接突变，剪接时忽略外显子17，致使酪氨酸激酶活性受损，称为结构突变。T等位基因表现为白色或有色毛的斑块或斑点性状，斑块及斑点分界处明显，无缓冲区带。分子结构上既有正常KIT基因(KIT1)，还带有一个完全一样的KIT基因(KIT1)全长拷贝，该拷贝增加了KIT基因的表达量，从而影响肥大干细胞生长因子之配体的可利用性，扰乱黑色素细胞前体物的迁移与存活，产生斑块或斑点表型。i等位基因仅携带一个正常KIT基因(KIT1)，黑色素细胞前体物能正常迁移与存活，表现出正常毛色。由于白毛色猪有吸收阳光中紫外线的能力强，抗佝偻病能力高，发病易从皮肤变化看出，乳腺无色素，胴体美观，国际市场上受欢迎并且白毛色的猪较有色被毛猪的屠宰成本较低(Rothchildetal.1998)等优点，国内养殖户更倾向于饲养白色猪种。近年来，一些养殖户从国外引进的以及已有的纯白色猪种配种后后代也会出现黑斑，这是由于该纯白色猪是等位基因I的非纯合个体，因此由于等位基因I对于其它等位基因有显性作用，其个体的毛色总是表现为纯白色，掩盖了该个体的真实遗传背景，只有当该个体与其他等位基因I非纯合个体交配后其后代才会在毛色表型中显现出黑斑来。目前，还没有一项针对该问题且能客观方便快捷的解决方法。
发明内容本发明提供了一种猪白色背毛纯合基因型的检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种猪白色被毛纯合基因型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤-(1)获取猪耳组织基因组DNA;(2)确定不同白色被毛基因型的差异；(3)猪白色被毛基因KIT第18内含子的PCR扩增；(4)白色被毛猪基因型I/I的纯合性检测。进一步地，所述步骤(3)具体为根据美国国立生物技术信息中心GenBank中的猪KIT基因第18内含子序列设计一对引物来体外扩增该突变区域序列，引物序列如下K18F:5'-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG-3';K18R:5'-ACTGGCATTCCGGGGTAG-3'，用此引物以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增。进一步地，所述步骤(4)具体为全白色被毛猪基因组DNA中得到的PCR扩增产物经溴化乙锭EB染色，在2.596琼脂糖10V/cm水平电泳1.5小时后，能清晰看到预计大小为161bp和165bp的两产物，凝胶成像系统拍照后利用系统自带分析软件分析每个个体两产物的光密度强度并计算其比例，当165bp比161bp的比值达到0.9l范围，可确定该个体为纯合的白色基因型I/I个体，若该比值小于0.9，则可确定该个体为非纯合白色基因型。本发明的有益效果是本发明的猪白色被毛纯合基因型快速检测方法可用于不同被毛颜色猪的检测，以及控制其后代被毛颜色。本发明有助于明确白色被毛猪的真实白色基因遗传信息，为控制后代被毛颜色，固定白色被毛猪所具有的优点提供技术支持，具有重要的生产意义。图1为猪白色被毛基因的等位基因组合内含子组成示意图；其中，A，1/1基因型；B，1/;T基因型；C，1/i基因型。图2为白色与非白色被毛猪PCR产物琼脂糖电泳图；其中，M,pBR322DNA/BsuRIMarker;1，黑斑皮特兰猪PCR产物结果；2-5，白色被毛猪PCR产物结果。图3为基因型I/I纯合性检测示意图；其中，A，不同个体PCR产物琼脂糖电泳检测；BC，分析每个泳道对应不同个体的两内含子扩增产物光密度强度。具体实施方式本发明提供的猪白色背毛纯合基因型的检测方法，包括以下步骤1.猪耳组织基因组DNA获取。2.确定不同白色被毛基因型的差异。根据
背景技术：
可知，猪全白色被毛纯合基因型等位基因组合为I/I相当于2个KIT1和2个KIT2，即有两个正常的18内含子和两个缺失4碱基的18内含子，其比率应为1;猪全白色被毛非纯合基因型中只有一个等位基因I相当于1个KIT1和1个KIT2，而另一个非I等位基因不会再带有KIT2，因此这种个体KIT基因正常的18内含子和有4碱基缺失的18内含子的比率应该大于1(图1)。3.猪白色被毛基因KIT第18内含子的PCR扩增。根据美国国立生物技术信息中心GenBank中的猪KIT基因第18内含子序列(登录号X93082)设计了一对引物来体外扩增该突变区域序列，引物序列如下K18F:5'-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG-3';K18R:5'-ACTGGCATTCCGGGGTAG-3'，用此引物以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，在全白色被毛猪基因组DNA中预计可得到161bp和165bp的两个产物，而在非全白色被毛猪基因组DNA中预计只得到一个165bp的产物。在电泳过程中相对于全白被毛个体PCR的两个产物，非全白色被毛猪基因组的PCR产物只有一个165bp条带，它不受另外161bp条带的阻碍而泳动的快一些，因此在电泳图上其所处位置与非全白被毛猪PCR产物的161bp产物所在位置相当(图2)。4.白色被毛猪基因型I/I的纯合性检测。全白色被毛猪基因组DNA中得到的PCR产物经溴化乙锭(EB)染色，在2.5%琼脂糖10V/cm水平电泳1.5小时后，能清晰看到预计大小为161bp和165bp的两产物，凝胶成像系统拍照后利用系统自带分析软件分析每个个体两产物的光密度强度并计算其比例(图3)，当165bp比,161bp的比值达到0.91范围，可确定该个体为纯合的白色基因型I/I个体，若该比值小于0.9则可确定该个体为非纯合白色基因型。由于PCR的选择性竞争，在白色被毛纯合基因型个体的PCR扩增中，'由于长片段的正常18内含子拷贝数与短片段的4碱基缺失18内含子拷贝数相同，引物会稍稍偏向于结合短片段的4碱基缺失18内含子，因而165bp产物比161bp产物比值将会出现大于0.9接近于1的比率值。而在白色被毛非纯合基因型个体的PCR扩增中，因为长片段的正常18内含子拷贝数是较短片段的4碱基缺失18内含子的数倍，所以引物会优先结合到4碱基缺失18内含子序列上进行聚合酶链式反应，因此165bp产物比161bp产物比值将小于0.9。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例l实验动物选取和个体基因组DNA提取在浙江大学动物实验牧场随机选取白色被毛约克夏猪后代12头及对照纯种白色被毛约克夏猪2头和黑色花斑被毛皮特兰猪2头，采猪耳组织样0.3克，用传统酚/氯仿抽提法提取耳组织中基因组DNA，所得基因组DNA纯度约在80%97%左右，TE溶解后稀释到终浓度50ng/uL。实施例2猪白色被毛基因KIT第18内含子的PCR扩增用根据美国国立生物技术信息中心GenBank中的猪KIT基因第18内含子序列(登录号:X93082)设计的引物(K18F:5'-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG-3';Kl服5'-ACTGGCATTCCGGGGTAG-3')，以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为15uL，反应体系组成为50ng基因组DNA，IXPCRbuffer,1.5,1/LMgCl2，0.2pmol/LdNTP和lUTaq酶，正反向引物各O.2umol/L。PCR反应条件为94。C预变性5min，然后进行程序为94。C变性40s，55。C复性40s，72。C延伸40s，30个循环，最后72。C延伸7min，4。C保存。实施例3基因型I/I的纯合性检测各个体PCR产物经溴化乙锭(EB)染色，在2.5%琼脂糖10V/cm水平电泳1.5小时后，能清晰看到白色被毛猪都有预计大小为161bp和165bp的两条带，黑色花斑皮特兰猪只有一条带产物(图2)。凝胶成像系统拍照后利用系统自带分析软件分析每个个体两条带的光密度强度并计算正常内含子产物比突变内含子产物比值(图3)，根据白色被毛基因型I/I纯合子的18内含子PCR产物165bp比161bp的比值应达到0.91范围，得到具有白色被毛基因型I/I纯合子个体4头(与对照约克夏猪结果相当)，其余均为全白色被毛的基因型非纯合子个体，如表1基因型I/I的纯合性检测结果示意表所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4杂交实验及应用用该方法筛选出的全白色被毛基因I非纯合子个体71与黑花斑皮特兰交配，其后代出现了毛色分离现象，并且后代毛色表型白色仔猪与非白色仔猪数量比例约为l:l，符合孟德尔遗传规律，进一步证实个体71是白色被毛基因I非纯合子；同样筛选出的全白色被毛的基因型I/I纯合子个体4-18与57交配，其后代全是全白色被毛个体，这些个体采用本发明方法测定后均得到大于0.9的比值，如表2基因I纯合子个体4-18与57交配的后代基因型I/I纯合性检测结果示意表所示，即这些个体均为白色被毛的基因型I/I纯合子个体，我们还用该4-18个体与黑花斑皮特兰交配，其后代均为全白色被毛个体，这些结果都进一步证实4-18确实是白色被毛的基因I纯合子个体。这样，我们就得到了具有白色被毛的基因型I/I纯合子的个体，并且它们和任何颜色被毛的猪交配，其后代均为全白色。这就控制了后代被毛的颜色，固定了白色被毛个体所具有抗佝偻病能力高、发病易于从皮肤观察、乳腺无色素、胴体美观、屠宰成本低、养殖户更倾向饲养和国际市场上受欢迎等优点。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。权利要求1.一种猪白色被毛纯合基因型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)获取猪耳组织基因组DNA。(2)确定不同白色被毛基因型的差异。(3)猪白色被毛基因KIT第18内含子的PCR扩增。(4)白色被毛猪基因型I/I的纯合性检测。2.根据权利要求1所述的猪白色被毛纯合基因型的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为根据美国国立生物技术信息中心GenBank中的猪KIT基因第18内含子序列设计一对引物来体外扩增该突变区域序列，引物序列如下K18F:5,-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG—3';Kl服5'—ACTGGCATTCCGGGGTAG-3'，用此引物以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增。3.根据权利要求1所述的猪白色被毛纯合基因型的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)具体为全白色被毛猪基因组DNA中得到的PCR扩增产物经溴化乙锭EB染色，在2.59()琼脂糖10V/cm水平电泳1.5小时后，能清晰看到预计大小为161bp和165bp的两产物，凝胶成像系统拍照后利用系统自带分析软件分析每个个体两产物的光密度强度并计算其比例，当165bp比161bp的比值达到0.91范围，可确定该个体为纯合的白色基因型I/I个体，若该比值小于0.9，则可确定该个体为非纯合白色基因型。全文摘要本发明公开了一种猪白色被毛纯合基因型的检测方法，包括以下步骤猪耳组织基因组DNA获取，确定不同白色被毛基因型的差异，猪白色被毛基因KIT第18内含子的PCR扩增，白色被毛猪基因型I/I的纯合性检测。本发明有助于明确白色被毛猪的真实白色基因遗传信息，为控制后代被毛颜色，固定白色被毛猪所具有的优点提供技术支持，具有重要的生产意义。文档编号C12Q1/68GK101255478SQ20081006057公开日2008年9月3日申请日期2008年3月28日优先权日2008年3月28日发明者徐宁迎,赵丽莉,赵晓枫,郭晓令申请人:浙江大学