一种检测ercc1基因多态性的引物与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其设及一种检测ERCC1基因多态性的引物与方 法。
【背景技术】
[0002] 销类抗癌药物，包括顺销、卡销和奥沙利销等，是目前临床应用中对多种癌症具 有较高活性的抗癌药物，主要通过引起细胞内DNA损伤来清除癌细胞。
[0003] 切除修复交叉互补基因UERCC1)，为人类DNA损伤修复基因，位于染色体 19ql3. 2-13. 3。切除修复交叉互补基因2巧RCC2)，参与核巧酸切除修复和基因转录，在DNA 损伤修复中起着重要作用。
[0004] 现有研究数据显示，ERCC1_C118TC/C，C/T，T/T基因型频率分别约为52. 6〇/〇， 43. 1%，4. 2% ;ERCC2_L751QK/K，K/Q，Q/Q基因型频率分别约为 84. 92%，15. 08%，0%。因此， 通过ERCC1基因多态性的检测，有助于预测销类药物化疗的预后，在帮助指导用药和个性 化治疗方面具有重要意义。现有技术缺少一种特异性好、灵敏度高、可实现ERCC1基因多态 性检测的引物及其方法。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测邸CC1基因多态性的引物与 方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，实现了ERCC1基因多态性的检测。本发明 检测的位点包括ERCC1_C118T;c. 354T〉C(p.Asnll8=)(SNP;rsll615)。
[000引本发明提供一种检测邸CCl基因多态性的引物，包括PCR扩增引 物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对ERCC1_C118T的 上游引物 5' -TCCAGAACACTGGGACATGA-3'（SEQIDNO. 1)和下游引物 5，-TCCCTATTGATGGCTTCTGC-3,（SEQIDNO. 2);所述SNaPshotPCR引物包括；针对ERCC1_ C118T的SNaPshotPCR引物 5，-TTTTTTTTAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA-3,（沈QID NO. 3) 0
[0007] 采用上述技术方案，本发明提供的检测邸CCl基因多态性的引物，可w实现邸CCl 基因多态性的特异性检测，准确性好。
[000引相应地，本发明还提供一种检测邸CC1基因多态性的方法，包括如下步骤；A)提取DNA样品；B)采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行纯化； C)采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，对扩增产物进行 纯化；D)毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0009] 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。
[0010] 优选地，所述步骤B)中的PCR扩增反应条件包括；阶段1 ;98°C3min;阶段2 : 981：1〇3;阶段3;581：3〇3;阶段4;721：1111111;阶段5;返回到阶段2,29个循环；阶段6; 72°C5min;阶段 7;25°C保温。即，St巧 1 ;98。Cfor3minutes;Step2 ;98。Cfor10 seconds;Step3 ；58°Cfor30seconds;Step4 ；72°Cfor1minute;Step5；Goto step2,29times;Step6 ；72°Cfor5minutes;Step7 ；25°Cforever。
[0011] 所述步骤c)中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括；阶段1;96它10s;阶段2: 55它5s;阶段3;6(TC30s;阶段4;返回到阶段1，25个循环；阶段5:4它保温。即，St邱 1 ；96°CforlOseconds;Step2 ；55°Cfor5seconds;Step3 ；60°CforSOseconds; Step4；Gotostep1，25times;Step5 ；4°Cforever。
[0012] 优选地，所述步骤D)中，采用GE肥MAP阳RIDV4. 1软件对检测结果进行分析。
[0013] 此外，本发明还提供检测ERCC1基因多态性的引物在制备检测ERCC1基因多态性 试剂中的用途。
[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测ERCC1基因多态 性的引物，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种检测 ERCC1基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物， 具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可W为销类药物的临床用药提供指导。
【附图说明】
[0015] 图1本发明提供的ERCC1基因引物的扩增片段。
[0016] 图2ERCC1基因引物扩增产物的部分测序图。
[0017] 图3样品的ERCC1基因多态性检测结果图。
【具体实施方式】
[001引下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[001引实施例一引物 发明人针对ERCC1的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和 比较，筛选出了特异性好的引物。本发明提供的引物包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引 物，PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过 UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
[0020]
实施例二引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting,ERCC1_C118T引物扩增片段位于C虹19: 45923504-45923722,长度为219bp;结果如图1所示，引物的扩增片段均覆盖了相应的检测 位点，无其它同源基因。
[0021] 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显 示，引物扩增片段与ERCC1基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表1中SNaPshotPCR 引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示。从图3可知，各产物峰的相对位置及测序反 应渗入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。
[0022] 实施例二ERCC1基因多态性的检测 提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit(购自Tiagen，货号；DP318)的说明书，将DM样品稀释至l(K)ng/yL，备用。
[002引 PCR扩增采用Q5?热启动超保真2XMasterMix(购自肥B公司，货号；M049化），反 应体系如表2所示，ERCC1_C118T的引物浓度为5pmol/uL。PCR扩增反应条件包括；阶段1 ; 98°C3min;阶段2;98°C10s;阶段3;58°C80s;阶段4;72°CImin;阶段5;返回到阶段2， 29个循环；阶段6 ;72°C5min;阶段7 ;25°C保温。PCR扩增结束后，取2. 0yLExoSAP-IT (购自Affymetrix，货号；78205)和3. 0yLd地20,混匀，加入PCR扩增产物2. 0yL，混匀微 离屯、；在PCR仪中进行酶切反应，程序；37°C，15min;80°C，15min;4°C，保温。
[0024]
采用SNaPshot?MultiplexKit(购自ABI公司，货号4323151)进行扩增，反应体系如 表3所示，6贿(：1_(：1181'的引物浓度为59111〇1/祉。5化?311〇1?0?反应条件包括；阶段1;961： 10s;阶段2;55°C5s;阶段3;6(TC30s;阶段4;返回到阶段1，25个循环；阶段5;4°C保 温。
[00 巧]
在SNaPshotPCR产物中加入1. 0yLSAP酶，按照W下程序进行反应；37 °C， 60min;75°C，15min;4°C，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用 GE肥MAP阳RIDV4. 1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图3所示。
[0026] 实施例S检测ERCC1基因多态性的方法的特异性 本检测方法的特异性定义为阴性符合率。本检测将ERCC1_C118TC/C基因型的检出定 义为阴性结果。采用本发明提供的SNaPshot法对19例样品进行检测，同时采用ARMS法进 行验证。SNaPshot法的检测结果与ARMS法的结果相符，如表4所示。本检测方法的特异性 为 100〇/〇。
[0027]
实施例四检测ERCC1基因多态性的方法的灵敏度和准确性 本检测方法的灵敏度定义为阳性符合率。采用本发明提供的SNaPshot法对19例样品 进行检测，同时采用ARMS法进行验证。SNaPshot测序法的检测结果与ARMS法的结果相符， 如表5所示。本检测方法的灵敏度和准确度高。
[0028]
实施例五检测ERCCl基因多态性的方法的精密度 本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。本检测进行了 人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验，结果如表6所示，所有结果均 显示一致，本检测精密度为100%。
[0029]
因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决 了邸CCl进行准确分型鉴定的问题，发挥PCR-SNaPshotPCR对所述基因位点基因分型结果 精确、高通量操作的特点，有助于预测销类药物化疗的预后，减少不良反应，在帮助指导用 药和个性化治疗方面具有重要意义。
[0030] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于该些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种检测ERCCl基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物 和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对ERCC1_C118T的上游引物 5' -TCCAGAACACTGGGACATGA-3' 和下游引物 5' -TCCCTAITGATGGCTTCTGC-3' ；所述 SNaPshot PCR 引物包括：针对 ERCC1_C118T 的 SNaPshot PCR 引物 5' -TITITITTAGGGGCAATCCCGTACTG AAGTTCGTGCGCAA-3'。2. -种检测ERCCl基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：A)提取DNA样品； B)采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行纯化；C)采用权 利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行纯化；D)毛 细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。3. 根据权利要求2所述的检测ERCCl基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤A)中 的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。4. 根据权利要求2所述的检测ERCCl基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤B)中 的PCR扩增反应条件包括：阶段1:98°C 3min;阶段2:98°C IOs;阶段3:58°C 30s;阶段4: 72°〇11^11;阶段5:返回到阶段2,29个循环；阶段6 :721：51^11;阶段7:251：保温。5. 根据权利要求2所述的检测ERCCl基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤C) 中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段I :96°C IOs ;阶段2 :55°C 5s ;阶段3 :60°C 30s ;阶段4 :返回到阶段1，25个循环；阶段5 :4°C保温。6. 根据权利要求2所述的检测ERCCl基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤D)中， 采用GENEMAPPERID V4. 1软件对检测结果进行分析。7. 根据权利要求1所述的检测ERCCl基因多态性的引物在制备检测ERCCl基因多态性 试剂中的用途。
【专利摘要】本发明提供一种检测ERCC1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的引物可以实现ERCC1基因多态性的特异性检测，准确性好。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104988146
【申请号】CN201510384854
【发明人】赵薇薇, 胡昌明, 燕启江, 郭周萍
【申请人】广州金域医学检验中心有限公司, 广州医科大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月30日