一种用于检测间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的引物及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的引物，包括Nanog?F ATGCCTGGTGAACCCGAC和Nanog?R AGGACTGGATGTTCTGGGT，以及β?actin?F CACGAAACTACCTTCAACTCC和β?actin?R CATACTCCTGCTTGCTGATC。检测方法包括以下步骤：(1)提取间充质干细胞，并传代培养；(2)提取各代次间充质干细胞的总RNA，进行RT?PCR扩增；(3)使用所述引物对扩增基因进行实时荧光定量PCR扩增。该引物特异性好、准确性高、灵敏度高，检测方法简单，可检测出基因表达量的微小变化。
【专利说明】
一种用于检测间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的 引物及检测方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测间充质干细胞传代过程中 Nanog基因表达量的引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 2003年，Chambers等和Mitsui等几乎同时报道了一种在囊胚内细胞群（inner cell mass，ICM)、原始生殖细胞以及胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)表达的新 转录因子，命名为他11呢。似11吨基因属于4阶?类，疆家族基因，在人定位于12号染色体12?13 ~31，其cDNA由2184个核苷酸租成，包涵1个开放阅读框，编码305个氨基酸组成的多肽。
[0003] Nanog基因的发现是在研究维持ESCs亚全能性和胚胎发育的相关基因方面取得的 最大进展，除了有助于ESCs自我更新和维持其未分化状态，还能够促进细胞增殖。去除 Nanog基因将会导致ESCs向原始内胚层样细胞的分化，说明Nanog是组织ESCs分化为原始内 胚层的关键因子。有研究认为Nanog基因也是"逆转因"（reversine)物质，可以把普通细胞 转变为胚胎细胞，再指导新细胞生长出人类需要的各种人体组织，来代替已失去功能的组 织器官，这也是再生医学时代到来的原因之一。
[0004] 也有人应用Northern Blot和逆转录-聚合酶链反应检测小鼠肾脏中Nanog基因的 曾龄变化，发现肾乳头区细胞表达较高，并且有年龄依赖性行为。Izadpanah等在研究成年 恒河猴间充质干细胞是否具有多项分化潜能时，发现有Nanog的表达。同时，研究发现在睾 丸原位癌和睾丸原位癌来源的睾丸肿瘤中有大量Nanog表达，并具有统计学意义，而在正常 睾丸中没有检测到该基因蛋白质水平的表达。这说明Nanog可能是某些肿瘤标志之一，并在 一定程度上解释了这些肿瘤细胞可以无休止增殖的原因。因此，通过检测间充质干细胞中 Nanog基因的表达变化对再生医学的应用、细胞治疗和基因治疗领域都具有重要意义。本领 域迫切需要特异性好、灵敏都高的检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量变 化的方法。而在很多基因表达量研究中，大多采用Northern印迹法或者RT-PCR后进行电泳 的方法来检测基因的表达量，但是Northern印迹法检测效率不高，灵敏度也低，无法检出微 小的基因表达量变化，RT-PCR电泳的方法由于产物量因为酶体系的影响而产生的波动在呈 指数增长的PCR中会被转化成产物量间很大的差异，所以准确性不是很好。
【发明内容】
[0005] 针对于现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测间充质干细胞传代 过程中Nanog基因表达量的引物及检测方法，可有效解决现有技术中的检测效率不高、灵敏 度较低、准确性不好的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] 一种用于检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的引物，包括Nanog 基因的上游引物5 ' -ATGCCTGGTGAACCCGAC-3 ' 和下游引物5 ' -AGGACTGGATGTTCTGGGT-3 '，以 及β-ac t in内参基因的上游引物5 ' -CACGAAACTACCTTCAACTCC-3 '和下游引物5 ' -CATACTCCTGCTTGCTGATC-3 '。
[0008] 使用上述引物检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的方法，包括 以下步骤：
[0009] (1)提取间充质干细胞，进行传代培养；
[0010] ⑵提取各代次间充质干细胞的总RNA，然后进行RT-PCR扩增；
[0011] (3)使用上述引物对扩增基因进行实时荧光定量PCR扩增，确定Nanog基因表达 量。
[0012] 进一步地，RT-PCR反应体系为:Total RNA 0.1 ng-5yg、浓度为100μΜ的Oligo dT 引物lyL，补充水至 12yL，然后再添加5XReaction Buffer 4yL、20U/yL的RiboLock RNase inhibitor lyL、10mM dNTP MIX 2yL和200UAiL的RevertAid M-Mul V RT lyL〇
[0013] 进一步地，RT-PCR扩增条件为：42°C 60min，然后70°C 5min。
[0014] 进一步地，实时焚光定量PCR反应体系为:Fast SYBR Green Master mix 10yL、上 游引物lyL、下游引物lyL、cDNA 2yL，然后添加水至20yL。
[0015] 进一步地，实时荧光定量PCR扩增反应条件为:95°C预变性5min，95°C变性15s，60 °C退火60s，共39个循环，最后72°C延伸lmin。
[0016] 进一步地，间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或胎盘间充质 干细胞。
[0017]本发明提供的一种用于检测间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的引物及 检测方法，具有以下有益效果：
[0018] (1)本发明提供了用于检测Nanog基因表达量的引物以及管家基因 β-actin的引 物，引物特异性好，准确性好，实现了Nanog基因表达量的检测，提高了检测的准确性。
[0019] ⑵本发明还提供了一种间充质干细胞传代过程中Nanog基因表达量的检测方法， 采用此方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可以为间充质干细胞的标志基因 研究、肿瘤标志基因的研究及再生医学中间充质干细胞的应用提供帮助。
【附图说明】
[0020] 图1为脂肪间充质干细胞？1、？3、？5、？7和？10代中似11呢基因的实时荧光定量?〇? 扩增图；
[0021] 图2为胎盘间充质干细胞P7代中Nanog基因的溶解曲线；
[0022]图3为胎盘间充质干细胞？1、？3、？5、？7和？10代中他11吨基因的溶解曲线；
[0023]图4为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和胎盘间充质干细胞传代过程中 Nanog基因表达量的计算结果图。
【具体实施方式】 [0024] 实施例1
[0025] 一种间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法，包括以下步骤：
[0026] (1)提取间充质干细胞
[0027] UC-MSCs:在生物安全柜中将脐带用生理盐水冲洗干净后，剥离羊膜上皮，去除脐 动脉和脐静脉，然后将脐带胶质剪碎后加入30mL Π 型胶原酶，置于37°C，200r/min下持续 消化6h，100目筛网过滤收集细胞，然后于1200r/min离心10min，弃上清，用D-Hank' s液轻柔 冲洗细胞3次，无血清培养基(hyclone公司）重悬细胞，在37°C、体积分数为5%的C02恒温培 养箱内培养6-7d后全量换液，弃掉未贴壁细胞，根据粘附性差异使UC-MSCs与其他组织细胞 分离，分离后细胞经过表面标志物鉴定，从而确定为UC-MSCs，然后使用胰蛋白酶将其消化 后，在细胞瓶内接种1X10 6个细胞，添加20mL无血清培养基进行培养，每隔3-4d换液1次进 行传代培养；
[0028] AD-MSCs:取成人吸脂术后的脂肪组织，磷酸盐缓冲液(PBS)反复浸泡冲洗3次去除 血液，加入等体积0.1 % I型胶原酶，于37°C水浴震荡消化lh，低糖DMEM(GibC〇)终止消化， 2000r/min离心5min，弃上清，再用低糖DMEM重悬沉淀，200目滤网过滤，向沉淀中再加入 3mL低糖DMEM，吹打均匀后移入培养瓶，于37°C、体积分数为5 %的⑶2恒温培养箱内培养24h 后，首次换液，去除残余的红细胞及未贴壁细胞，根据黏附性差异使AD-MSCs与其他组织细 胞分离，分离后细胞经过表面标志物鉴定，从而确定为AD-MSCs，然后使用胰蛋白酶将其消 化后，在细胞瓶内接种1 X 1〇6细胞，添加20mL无血清培养基培养，以后每隔3~4d换液1次进 行传代培养；
[0029] PMSCs:在无菌条件下剪取胎盘绒毛膜组织，冲洗，去除血迹，将其剪成碎片后加入 30mL II型胶原酶，置于恒温振荡仪内持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞，室温下1200r/ min离心10min后，弃上清，用D-Hank's液轻柔冲洗细胞3次，用无血清培养基(hyclone公司） 重悬细胞，在37 °C、体积分数为5 %的C02恒温培养箱内培养6~7d后全量换液，弃未贴壁细 胞，根据黏附性差异使PMSCs与其他组织细胞分离，分离后细胞经过表面标志物鉴定，从而 确定为PMSCs，然后使用胰蛋白酶将其消化后，在细胞瓶内接种1 X 106细胞，利用无血清培 养基培养，以后每隔3~4d换液1次进行传代培养；
[0030] (2)待细胞融合度为80%时，用胰蛋白酶消化处理，然后2000r/min离心3min，收集 细胞，PBS溶液冲洗3次后，再用TRIzol处理提取RNA，RT-PCR采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(购自Thermo Scientific公司，货号K1622)进行扩增，反应体系如表1 所示，Oligo(dT)引物浓度为100yM，RT-PCR反应条件包括：阶段l:42°C60min;阶段2:70°C 5min;Nanog基因表达量的扩增片段见见SEQID-1;
[0031] 表1RT-PCR反应体系 [0032]
[0033]
[0034] (3)实时荧光定量PCR扩增，采用ViiA?7软件对检测结果进行分析，确定Nanog基因 表达量；引物见表2:
[0035] 表2所用引物
[0036]
[0037] 实时焚光定量PCR(real_time PCR)米用Fast SYBR Green Master mix(购自 Applied Biosystem公司，货号4385612)进行扩增，反应体系如表3所示，引物浓度为5pmol/ μL，反应条件为:95°C预变性5min，95°C变性15s，60°C退火60s，共39个循环，最后72°C延伸 lmin〇
[0038] 表3real_time PCR反应体系
[0041]使用ViiA?7软件中-Δ ACT相对定量分析方法分析：
[0042] (1)内参基因 CT值归一目标基因的CT值：
[0043] Δ CT(test)=CT(target,test)-CT(ref,test)
[0044] Δ CT(calibrator)= CT(target,calibrator)-CT(ref,calibrator)
[0045] (2)校准样本的Δ CT值归一试验样本的Δ CT值：
[0046] Δ Δ CT= Δ CT(test)-Δ CT(calibrator)
[0047] (3)计算表达水平比率：
[0048] 2-ΛΛα =表达量的比值
[0049] 脂肪间充质干细胞？1、？3、？5、？7和？10代中似11呢基因的实时荧光定量?0財广增图， 如图1所示，与阈值相交处，从左至右依次为AD-MSCs Ρ7代、Ρ 10代、Ρ 5代、Ρ 1代、Ρ 3代，交 点处样本孔与复孔间扩增曲线重合，重复性很好。
[0050]本检测方法的特异性定义为Tm值的单一性，Tm值与PCR扩增产物的序列有关，对于 某一 PCR扩增产物，其值是固定的。结果如图2和3溶解曲线所示，图中溶解曲线Tm值非常单 一，无任何杂峰出现，且样本孔与复孔间曲线重合，证明本检测中采用的引物及方法的特异 性非常好，也具有很好的重复性。
[0051 ]本检测方法的灵敏度及准确性定义为对cDNA模板进行独立重复检测得到同一结 果的能力，结果如图4所示，对三种间充质干细胞(脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或 胎盘间充质干细胞)体外传代培养过程中Nanog基因表达量变化的检测结果，每种细胞检测 独立重复3次，数据以mean 土 S. D.形式表示，图中结果显示三次独立重复实验得到的数据差 异性很小，且直观的看到了各代次细胞间表达量的微小变化，证明本检测采用的引物及方 法灵敏度和准确性都非常好。
[0052]文中缩写表示的含义：
[0053] 脐带间充质干细胞（umbilical cord derived mesenchymal stem cells，UC_ MSCs)；
[0054] 脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells，AD_MSCs);
[0055] 胎盘间充质干细胞（placenta derived mesenchymal stem cells，PMSCs)。
[0056] 本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的检测方法，解决 了Nanog基因在间充质干细胞中表达情况的监测问题，发挥了real-time PCR对初始模板量 精确、灵敏、特异性的检测，对间充质干细胞的标志基因研究、肿瘤标志基因的研究及再生 医学中间充质干细胞的应用有重要意义。
【主权项】
1. 一种用于检测间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的引物，其特征在于， 包括Nanog基因的上游引物5'-ATGCCTGGTGAACCCGAC-3'和下游引物5'-AGGACTGGATGTTCTGGGT-3 '，以及β-actin内参基因的上游引物5 '-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3 ' 和下游引物5 ' -CATACTCCTGCTTGCTGATC-3 '。2. -种间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1) 提取间充质干细胞，进行传代培养； (2) 提取各代次间充质干细胞的总RNA，然后进行RT-PCR扩增； (3) 使用所述引物对扩增基因进行实时荧光定量PCR扩增，确定Nanog基因表达量。3. 根据权利要求2所述的间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法， 其特征在于，RT-PCR反应体系为:Total RNA 0.1ng-5yg、浓度为100μΜ的Oligo dT引物lyL， 补充水至 12yL，然后再添加5XReaction Buffer 4yL、20U/yL的RiboLock RNase inhibitor IyUlOmM dNTP MIX 2yL和200UAiL的RevertAid M-Mul V RT IyL04. 根据权利要求2所述的间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法， 其特征在于，RT-PCR扩增条件为:42 °C 60min，然后70 °C 5min。5. 根据权利要求2所述的间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法， 其特征在于，实时荧光定量PCR反应体系为:Fast SYBR Green Master mix IOyU上游引物 lyL、下游引物IyUcDNA 2yL，然后添加水至20yL。6. 根据权利要求2所述的间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的检测方法， 其特征在于，实时荧光定量PCR扩增反应条件为:95°C预变性5min，95°C变性15s，60°C退火 60s，共39个循环，最后72 °C延伸Imin。7. 根据权利要求2-6任一项所述的间充质干细胞体外传代过程中Nanog基因表达量的 检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或胎盘 间充质干细胞。
【文档编号】C12N15/11GK105886621SQ201610272333
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】刘宇, 张蓉, 马明, 李晓瑞, 林秀芳
【申请人】成都中创清科医学检验所有限公司