一种dpyd*2基因多态性的引物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种DPYD*2基因多态性的引物及其检测 方法。
【背景技术】
[0002]二氢啼啶脱氢酶（dihydropyrimidinedehydrogenase，DPD)编码基因是位于 1 号 人类染色体的短臂上（lq22)，基因全长约150kb，含有3kb的编码序列，其由23个外显子构 成，长度从69bp到1404bp，基因中内含子由长短不等的序列组成。二氢嘧啶脱氢酶是作用于 5-FU药物代谢途径的关键酶之一，是分解代谢的限速酶，其含量的高低决定了5-FU药物的 代谢速度，进而影响体内药物的毒性和疗效。
[0003] 5-Fu及其前体药物卡培他滨广泛用于肿瘤化疗，80%以上的5-Fu及其前体药物是 通过DH)代谢降解为无活性代谢物二氢氟尿嘧啶(FUH2)而失活。不同个体间DPD酶活性存在 明显差别，导致药物清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应存在明显的个体差异性。
[0004] DPYD突变会影响Dro酶活性的改变，DPYD*2 (IVS14+1G>A)是最常见的突变之一， 与Dro酶活性相关。DPYD *2在西欧人群中突变频率较高，约占0.005~3.5%，在中国北方汉族 人群及中国重庆地区人群的研究中均未发现该类型的突变。因此，检测DPYD基因多态性可 以对肿瘤患者进行药物敏感指导，提高治疗效果，降低药物的毒副作用。
[0005] 中国专利CN102146440B公开了一种甄别DPYD基因*9A突变位点的PCR检测试剂盒， 所述试剂盒主要包括特异性引物、EvaGreen荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶。该实时荧光PCR检测方法可以实现二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点快速、准 确、特异分析。但是，但其高居不下的假阳性率为实际应用所诟病，而且该检测方法还存在 检测通量少，每次只能检测一种突变类型的缺陷，不能满足实际应用的需要。
[0006] 中国专利CN102952866B公开了一种DPYD基因多态性检测特异性引物和液相芯片， 该液相芯片包括野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由5 '端的tag序列和3 '端针对目 的基因多态性位点的特异性引物序列组成。该液相芯片可用于并行或单项检测DPYD基因三 种常见基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突变型。但是，上述检测方法操作复杂，不利 于大规模的推广和应用。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种DPYD*2基因多态性的引物及其 检测方法，该引物主要用于检测DPYD基因的DPYD*2 (c. 1905+1G>A/C)位点，具有特异性强、 检测灵敏度高、准确性好等优点，为DPYD*2基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。
[0008]本发明提供了一种DPYD*2基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物;所述PCR扩增引物为:针对DPYD*2的上游引物5 ' -ATCAGTGAGAAAACGGCTGC-3'（SEQID N0.1)和下游引物5'-TAAACATTCACCAACTTATGCCA-3'（SEQIDN0.2);所述SNaPshotPCR引 物为：针对DPYD*2的SNaPshotPCR引物5'-GCTGACTTTCCAGACAAC-3'（SEQIDN0.3)。
[0009]另外，本发明还提供了一种DPYD*2基因多态性的检测方法，包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物 进行SNaPshotPCR扩增，并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0010]进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
[0011] 进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C3min;阶段2: 98°C10s;阶段3:58°C30s;阶段4:72°Clmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保温。
[0012]进一步地，所述步骤S3中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C10s;阶 段2:55°C5s;阶段3:60°C30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保温。
[0013]进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0014]除此之外，本发明提供的所述的DPYD*2基因多态性的引物在制备检测DPYD*2基因 多态性试剂中的用途。
[0015]与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：本发明提供的DPYD*2基 因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了DPYD*2基因多 态性的检测，可以对肿瘤患者进行有效的药物敏感指导，提高药物的清除率、肿瘤的反应性 及患者的毒性反应，为实现肿瘤患者个体化治疗提供了依据，更有利于肿瘤患者的康复。
【附图说明】
[0016]图1为本发明提供的DPYD*2基因引物的扩增片段； 图2为本发明提供的DPYD*2基因SNaPshotPCR引物的检测结果图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0018]实施例一、引物 本发明提供的DPYD*2基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物，所 述PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC 数据库比对，无已知SNP位点。
[0019]表1本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下： 1)DPYD*2基因特异引物于UCSC中进行Blast，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检 测位点，无其它同源基因，DPYD*2基因扩增片段位于chrl: 97915559-97915683,长度为 125bp，扩增序列图如图1。
[0020] 2)使用表1中SNaPshotPCR引物，SNaPsh