检测人aeg-1基因表达量和相对表达量的引物对的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中检测人AEG-1基因表达量和相对表达量的引物对。
【背景技术】
[0002] 肝癌是病死率很高的消化系统肿瘤，其中9 0 %为肝细胞肝癌 化epatocellula;rca;rcinoma，HCC)。在世界范围内，其发病率呈现上升的趋势。我国是肝癌 大国，也是全球肝癌发病率最高的国家。据统计，目前我国肝癌发病人数占全球的55%，而 死亡人数约占全世界肝癌死亡人数的45%，素有"癌中之王"的称号，对我国人民健康构成 严重威胁。目前临床上主要使用AFP作为肝癌诊断的标志物，但是由于肝炎、肝硬化等影响 很容易造成误诊。因此，寻找新的肝癌诊断标志物至关重要。
[0003] 星形细胞上调基因-1 (astro巧te elevated gene-1，AEG-1)是近期发现的新型促 癌基因。AEG-1基因编码人类AEG-1蛋白，是含有582个氨基酸，分子量为64kd的蛋白。它是 RAS，C-MYC基因的下游，其过度表达可W导致下游PI3K/AKT激活NF-κΒ和WNT信号通路。AEG-1被确定参与调控肿瘤转移过程，并且其表达水平在大多数肿瘤组织偏高，主要包括结肠 癌，卵巢癌，乳腺癌，肝癌等。尤其在肝癌当中，与癌旁组织相比，AEG-1的表达明显升高。因 此，AEG-1有希望成为潜在的肝癌诊断标志物。
【发明内容】
[0004 ]本发明所要解决的技术问题是如何检测人AEG-1基因表达量或相对表达量。
[000引为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或 相对表达量的引物对。
[0006] 本发明所提供的检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的引物对，为 名称为AEG-1-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人类AEG-1基因表达量或 相对表达量的成套试剂。
[0008] 本发明所提供的检测或辅助检测人类AEG-1基因表达量或相对表达量的成套试 剂，由所述AEG-1-P与名称为GAPDH-P的与人的GAPDH基因特异结合的引物对组成。
[0009] 上述成套试剂中，所述GAP畑-P由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单 链DNA组成。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相 对表达量的试剂或试剂盒。
[0011] 本发明所提供的检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的试剂或试剂 盒，由所述AEG-1-P或所述成套试剂与XI组成，所述XI为进行定量PCR扩增所需试剂。
[0012] 上述试剂或试剂盒中，所述进行定量PCR扩增所需试剂可为qPCR MIXdqPCR MIX可 为北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司产品。
[0013] 上述试剂或试剂盒中，所述定量PCR扩增可为实时巧光定量PCR扩增。
[0014] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相 对表达量的系统。
[0015] 本发明所提供的检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的系统，由所 述AEG-1-P、所述成套试剂或所述试剂或试剂盒与Y1组成，所述Y1为进行RNA提取所需的试 剂、进行反转录所需的试剂和/或进行定量PCR扩增所需仪器。
[0016] 上述系统中，所述进行RNA提取所需的试剂可为TRIzol、氯仿、异丙醇和/或乙醇。 TRIzol可为上海捷瑞生物工程有限公司产品。
[0017] 所述进行反转录所需的试剂可为ReveWranscript qPCR RT Kit中的试剂。 ReverTranscript qPCR RT Kit为Takara公司产品。
[0018] 所述进行定量PCR扩增所需仪器可为实时巧光定量per仪（如AB 口 300或AB 口 500 (美国Applied Biosystems公司））。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系 统。
[0020] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统，包括所述AEG-1-P、 所述成套试剂、所述试剂或试剂盒或所述检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达 量的系统与基因定量数据处理系统;所述基因定量数据处理系统用于计算将来自待鉴定组 织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量，根据所述待鉴定组织和/或细胞的AEG-1 基因的表达量或相对表达量确定待鉴定组织和/或细胞是否为肿瘤组织和/或细胞。
[0021] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测AEG-1基因的表达量或相对表达量的 方法。
[0022] 本发明所提供的检测AEG-1基因的表达量或相对表达量的方法，包括W离体的待 鉴定组织和/或细胞的cDNA或RNA为模板，用所述AEG-1-P进行PCR扩增，所述PCR扩增中的退 火条件可为58°C35sec。反应条件具体可为:95°C预变性Imin; 95°C 15s，58°C35sec，40个循 环。
[0023] 所述PCR扩增时的反应体系可为25化反应体系，具体如下：2化cDNA溶液，12.化L qPCR Mix(2X)，AEG-1-F(AEG-1-F在该反应体系中的浓度为0.2μM)，AEG-1-R(AEG-1-R在该 反应体系中的浓度为0.2μΜ)，用无菌蒸馈水补至2如L。
[0024] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方 法。
[0025] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法，包括:检测来自待鉴 定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量；如果所述待鉴定组织和/或细胞的 AEG-1基因的表达量或相对表达量越高，所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织 和/或细胞的风险越大，如果所述待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达 量越低，所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越小。
[0026] 上述方法中，所述待鉴定组织和/或细胞可为肝脏组织和/或肝脏细胞。
[0027] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述AEG-1-P、所述成套试剂、所述试剂或 试剂盒或所述系统在下述1 )-5)中任一种中的应用：
[0028] 1)检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量；
[0029] 2)制备检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量产品；
[0030] 3)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞；
[0031] 4)制备鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞产品。
[0032] 上述应用中，所述肿瘤组织和/或细胞可为肝癌、结肠癌、卵巢癌或乳腺癌组织和/ 或细胞。
[0033] 实验证明，本发明的引物对能够检测AEG-1在肝癌组织中的表达含量，操作相对简 单，结果准确。
[0034] 本发明鉴于现有技术中检测肝癌样品标志物的不足，本发明设计了检测内参/目 的基因用引物，用巧光定量PCR技术检测人融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物 探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测AEG-1基因相对表 达量的试剂盒。
[003引使用本发明的试剂盒，将实时巧光PCR技术对AEG-1基因的表达水平进行检测，检 测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建 AEG-1和内参基因 GAPDH的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和AEG-1拷贝数， 相比于W往的免疫组化方法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将 反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的 条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助 于临床样品的辅助性检测。
【附图说明】
[0036] 图1为AEG-1烙解曲线。
[0037] 图2为GAPDH烙解曲线。
[003引图3为AEG-1和GAPDH的扩增曲线。其中。左侧为GAPDH扩增曲线，右侧为AEG-1扩增 曲线。
[0039] 图4为8位临床肝癌患者AEG-1的相对表达量。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0041 ]下述实施例中的实验方法，如