一种鉴定tigar基因的表达量的方法及其专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定TIGAR基因的表达量的方法及其专用引物。本发明提供的引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。所述特异引物对可用于鉴定TIGAR基因、鉴定猪肉食品中TIGAR基因的表达量、辅助鉴定猪肉品质。本发明提供了特异引物对，采用SYBR?GreenⅠ荧光定量PCR方法对TIGAR基因表达情况进行研究，建立了TIGAR基因表达标准曲线且线性关系良好。本发明提供给的引物对和方法具有灵敏度高、特异性强、准确可靠等优点，可用于检测猪TIGAR基因表达情况。
【专利说明】—种鉴定TIGAR基因的表达量的方法及其专用引物
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种鉴定TIGAR基因的表达量的方法及其专用引物。
【背景技术】
[0002]PSE肉是一种苍白、柔软、有汁液渗出的劣质肉，每年由其引起的肉品劣变给畜禽产业造成了巨大的经济损失。PSE肉的形成主要取决于屠宰后无氧糖酵解的速度，无氧糖酵解的速度越快，越易产生PSE肉。
[0003]近来,英国Beatson癌症研究所和西班牙研究人员在抗肿瘤研究过程中发现一种叫做 TIGAR (TP53_induced glycolysis and apoptosis regulator, TP53 诱导的糖酵解和凋亡调节因子)的P53诱导基因。TIGAR蛋白可调节有氧呼吸和糖酵解平衡。TIGAR蛋白具有果糖-2，6- 二磷酸酶(FBPase-2)活性，TIGAR表达使果糖_2，6- 二磷酸去磷酸化变成果糖-6-磷酸，降低了其在细胞中的含量，而果糖_2，6- 二磷酸是糖酵解关键酶磷酸果糖激酶(PFK-1)的强力激活因子，果糖_2，6- 二磷酸水平的降低会抑制磷酸果糖激酶的活性，使糖酵解反应速率下降，导致糖酵解一系列酶和产物的变化，PH下降速度减慢，抑制PSE肉的发生。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种鉴定TIGAR基因的表达量的方法及其专用引物。
[0005]本发明提供的专用引物为一对特异引物(又称特异引物对)，由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。
[0006]本发明还保护所述特异引物对在鉴定TIGAR基因中的应用。
[0007]本发明还保护所述特异引物对在鉴定生鲜猪肉中TIGAR基因的表达量中的应用。
[0008]本发明还保护所述特异引物对在辅助鉴定猪肉品质中的应用。
[0009]本发明还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c):(a)鉴定TIGAR基因；(b)鉴定生鲜猪肉中TIGAR基因的表达量；(c)辅助鉴定猪肉品质。
[0010]本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c):(a)鉴定TIGAR基因；(b)鉴定生鲜猪肉中TIGAR基因的表达量；(c)辅助鉴定猪肉品质。所述试剂盒还可包括用于鉴定内参基因的引物对，所述内参基因具体可为β-actin基因。所述用于鉴定内参基因的引物对具体可为序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成的引物对。所述试剂盒中还可包括具有所述特异引物对的靶序列的标准品质粒。所述标准品质粒具体可为将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入骨架载体得到的重组质粒。所述骨架载体具体可为PMD-18T载体。所述试剂盒还可包括记载有标准曲线方程的载体；所述标准曲线方程可为:y=-3.03561gx+ll.402，R2=0.9995，y为循环阈值，x为体系中TIGAR基因片段的拷贝数。
[0011]本发明还保护一种 鉴定猪肉中TIGAR基因的表达量的方法，包括如下步骤:[0012](I)提取待测猪肉的总RNA并反转录为cDNA ；
[0013](2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用所述特异引物对进行实时荧光PCR ；
[0014](3)根据所述实时荧光PCR的结果获得TIGAR基因的表达量。
[0015]所述实时荧光PCR的反应条件具体可为:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s、40个循环。
[0016]以上任一所述的TIGAR基因具体可为如下(I )、(II)或(III):( I )序列表中序列6所不的DNA分子；(II)在严格条件下与(I )限定的DNA序列杂交且编码与PSE肉相关的蛋白的DNA分子；(III)与(I )限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与PSE肉相关的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6 X SSC, 0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS 和 I XSSC,0.1%SDS 各洗膜一次。
[0017]鉴于TIGAR基因对降低糖酵解水平，抑制PSE肉的发生具有一定作用，并且目前对宰后不同品种、不同时间的两基因表达情况国内外研究甚少。本发明提供了特异引物对，采用SYBR Green I荧光定量PCR方法对TIGAR基因表达情况进行研究，建立了 TIGAR基因表达标准曲线且线性关系良好。本发明提供给的引物对和方法具有灵敏度高、特异性强、准确可靠等优点，可用于检测猪TIGAR基因表达情况。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为实施例2中的扩增曲线。
[0019]图2为实施例2中的溶解曲线。
[0020]图3为实施例3中采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性的电泳图。
[0021]图4为实施例3中通过检测`β -actin基因鉴定cDNA的质量的电泳图。
[0022]图5为实施例3中检测TIGAR基因的扩增曲线。
[0023]图6为实施例3中检测TIGAR基因的溶解曲线。
[0024]图7为实施例3中检测TIGAR基因的标准曲线。
[0025]图8为实施例3中检测内参基因的扩增曲线。
[0026]图9为实施例3中检测内参基因的溶解曲线。
[0027]图10为实施例3中检测内参基因的标准曲线。
[0028]图11为实施例4的结果。
【具体实施方式】
[0029]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0030]pMD-18T载体:大连宝生物工程有限公司；Takara Code:6011oE.coll JM109感受态细胞:大连宝生物工程有限公司；Takara Code:D9052S。IOObp DNA Ladder Marker:大连宝生物工程有限公司；Takara Code:3422A。SYBRPremix Ex TaqI1:大连宝生物工程有限公司；Takara Code:RR820Q。2 XPower Taq PCR MasterMix:百泰克生物技术有限公司，货号PR1701。Universal DNA纯化回收试剂盒:天根生化科技有限公司，货号DP214-02。高纯度质粒小提中量试剂盒:天根生化科技有限公司，货号DP107-02。[0031]实施例1、特异引物对的设计
[0032]设计一对用于鉴定TIGAR基因的引物如下(靶序列为169bp):
[0033]Fl (序列 I):5，-CAggTgAAAATgCgTggAAA-3，；
[0034]Rl (序列 2):5，-CTgAATTAAACgTggAggCACA-3，。 [0035]设计一对用于鉴定β -actin基因的引物对如下(靶序列为216bp):
[0036]F2 (序列 3):5，_TgCgggACATCAAggAgAAg_3，；
[0037]R2 (序列 4):5，-AgTTgAAggTggTCTCgTgg-3，。
[0038]实施例2、引物对的灵敏度和特异性
[0039]1、合成序列表的序列5所示的双链DNA分子，将其插入pMD_18T载体，得到重组质粒。
[0040]2、将质粒浓度为3.4X IO9拷贝数/μ I的重组质粒溶液用超纯水进行梯度稀释，然后将各个稀释液作为模板，分别进行实时荧光PCR。
[0041]实时荧光PCR 体系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F1,0.8μ I Rl,0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0042]实时荧光PCR采用AB7500Real Time荧光定量PCR仪进行，反应条件为:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40个循环；最后加入仪器自带溶解曲线程序。
[0043]每种稀释液进行三次重复实验。
[0044]扩增曲线见图1。图1中，自左至右的扩增曲线依次为采用质粒浓度为3.4X108、
3.4Χ107、3.‘ΧΙΟ6』.‘ΧΙΟ5』.‘ΧΙΟ4』.‘ΧΙΟ3』.4Χ102、3.4Χ101 拷贝数 /μ I 的稀释液作为模板得到的扩增曲线。实时荧光PCR体系中TIGAR基因片段的拷贝数为10以上时，均可观察到扩增曲线，即采用Fl和Rl组成的引物对通过实时荧光PCR鉴定目的基因，灵敏度为10个拷贝的目的基因/每个反应体系。
[0045]当PCR体系中含IO1-1O8数量级拷贝的TIGAR基因片段时，Ct值与拷贝数的对数呈线性关系，根据各个稀释液进行实时荧光PCR的结果制作标准曲线并得到标准曲线方程如下:y=-3.03561gx+ll.402，R2=0.9995，y为循环阈值，x为体系中TIGAR基因片段的拷贝数。
[0046]溶解曲线见图2，可见只有单一峰，说明实时荧光PCR得到了单一产物，特异性强。将Fl和Rl在NCBI上进行比对可知，此引物对在猪的全基因序列中只能扩增TIGAR基因序列，因此在严格控制污染前提下，只扩增猪cDNA库时不会产生其它非特异性扩增。
[0047]实施例3、引物对的应用
[0048]1、取两头屠宰30min后的大白猪的半膜肌，提取总RNA。采用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，总RNA的0D26(i/28(i在1.7-2.0之间。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，见图3 (I和2分别对应两头大白猪)，28S和18S条带清晰可见，无明显降解。
[0049]2、将步骤I提取的总RNA反转录为cDNA。通过检测β -actin基因(内参基因)鉴定cDNA的质量，1.5%的琼脂糖凝胶电泳图见图4 (I和2分别对应两头大白猪)，显示内参基因的扩增条带，浓度较统一，质量较好。
[0050]PCR 体系:12.5 μ 12 X Power Taq PCR MasterMix, cDNAl.5 μ I，F21.5 μ I，R21.5 μ 1，加DEPC处理水补充至体积为25 μ I。
[0051]PCR 反应条件:95°C预变性 5min ;95°C变性 30s、55.5°0退火3()8、721:延伸 30s，28个循环；72°C延伸IOmin。
[0052]3、将步骤2得到的cDNA用超纯水稀释至5倍体积、10倍体积、100倍体积、1000倍体积，得到各个稀释液(依次命名为5倍稀释液、10倍稀释液、100倍稀释液或1000倍稀释液)。
[0053]4、将步骤3得到的各个稀释液作为模板，分别进行实时荧光PCR，检测TIGAR基因。
[0054]实时荧光PCR 体系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F1,0.8μ I Rl,0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0055]实时荧光PCR采用AB7500Real Time荧光定量PCR仪进行，反应条件为:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40个循环；最后加入仪器自带溶解曲线程序。
[0056]每种稀释液进行三次重复实验。
[0057]扩增曲线见图5 (自左至右的扩增曲线依次为5倍稀释液、10倍稀释液、100倍稀释液或1000倍稀释液作为模板得到的扩增曲线)。溶解曲线见图6。标准曲线见图7。在5、10、100或1000稀释倍数下，线性关系良好，R2=0.999385，标准曲线方程为:Y=-3.4692201gX+34.441328，其中Y为循环阈值，X为体系中TIGAR基因片段的拷贝数，可计算得到扩增效率为94.2%。
[0058]5、将步骤3得到的各个稀释液作为模板，分别进行实时荧光PCR，检测β -actin基因(内参基因)。
[0059]实时荧光PCR 体系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F2,0.8μ I R2,
0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0060]实时荧光PCR采用AB7500Real Time荧光定量PCR仪进行，反应条件为:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40个循环；最后加入仪器自带溶解曲线程序。
[0061 ] 每种稀释液进行三次重复实验。
[0062]扩增曲线见图8 (自左至右的扩增曲线依次为5倍稀释液、10倍稀释液、100倍稀释液或1000倍稀释液作为模板得到的扩增曲线)。溶解曲线见图9。标准曲线见图10。标准曲线方程为:Y=-3.2778851gX+23.205946，其中Y为循环阈值，X为体系中β-actin基因片段的拷贝数，R2=0.998073，线性关系较好，可计算得到扩增效率为101.8%。
[0063]根据步骤4和步骤5的结果可知:各基因扩增曲线反应良好；溶解曲线只有一个峰，说明反应特异性好；各标准曲线线性关系良好，目标基因与内参基因扩增效率基本一致。
[0064]实施例4、引物对的应用
[0065]采用与实施例3相同的方法，对屠宰后30min、2h、4h、8h的猪半膜肌中的TIGAR基因的相对表达量进行测定，观察宰后不同品种(长白猪和东北花猪)、不同时间猪TIGAR基因变化趋势。长白猪体质较弱，抗逆性差，应激敏感较强，故用以作为较易产生PSE肉品种进行研究。东北花猪是以本地民猪为母本与克米洛夫猪杂交而成的我国特有品种，其生长较快，饲料转化率高，适应性强，胴体瘦肉率较低，较不易产生应激，故作为较不易产生PSE肉品种与长白进行TIGAR mRNA宰后不同时间表达量的比较研究。
[0066]共进行4次平行试验，以长白猪宰后30min的TIGAR基因表达量作为参照，其它各品种、各宰后时间相对于参照的相对表达量见表1。经SAS9.1.3分析，结论如下:各品种宰后30min与宰后2、4、8h有显著差异，30min表达量显著高于2、4、8h (P〈0.05);东北花猪与长白猪间TIGAR基因表达量有显著差异，且东北花猪宰后各时间点的表达量均显著高于长白猪(P〈0.05)。
[0067]表1不同品种的猪宰后不同时间TIGAR基因的相对表达量
[0068]
[0069]注:大写字母不同表示差异极显著(P〈0.01)，小写字母不同表示差异显著(Ρ〈0.05)。
[0070]对TIGAR mRNA作图并进行多重比较，见图11。图11中:每两个相邻柱子为一组，每组中左边的柱子为长白猪，右边的柱子为东北花猪；大写字母不同表示差异极显著(P〈0.01)，小写字母不同表示差异显著(P〈0.05)。经SAS9.1.3分析，结论如下:东北花猪TIGAR基因表达量显著高于长白猪(P〈0.05);长白猪宰后30min与宰后2h有显著差异，2h与4h、8h有显著差异(P〈0.05);东北花猪宰后30min与长白猪Oh有极显著差异(P〈0.01)，长白猪宰后30min与东北花猪宰后8h有极显著差异(P〈0.01),其余宰后时间无显著性差异；东北花猪宰后30min与长白猪宰后30min、2h有显著差异(P〈0.05)，长白猪宰后30min、2h与长白猪宰后4、8h及东北花猪宰后8h有显著差异(P〈0.05)。
【权利要求】
1.引物对，由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。
2.权利要求1所述引物对在鉴定TIGAR基因中的应用。
3.权利要求1所述引物对在鉴定生鲜猪肉中TIGAR基因的表达量中的应用。
4.权利要求1所述引物对在辅助鉴定猪肉品质中的应用。
5.权利要求1所述引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c): Ca)鉴定TIGAR基因；(b)鉴定生鲜猪肉中TIGAR基因的表达量；(c)辅助鉴定猪肉品质。
6.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物对；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c):(a)鉴定TIGAR基因；(b)鉴定生鲜猪肉中TIGAR基因的表达量；(c)辅助鉴定猪肉品质。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括具有所述引物对的靶序列的标准品质粒。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括用于鉴定内参基因的引物对。
9.一种鉴定猪肉中TIGAR基因的表达量的方法，包括如下步骤: (1)提取待测猪肉的总R NA并反转录为cDNA；(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用权利要求1所述引物对进行实时荧光PCR； (3)根据所述实时荧光PCR的结果获得待测猪肉中TIGAR基因的表达量。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于:所述实时荧光PCR的反应条件为:950C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40 个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK103484540SQ201310400073
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】汤晓艳, 康大成, 王敏, 李朋颖, 颜成英 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所