水稻ps1蛋白及其编码基因在调节植物衰老中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻PS1蛋白及其编码基因在调节植物衰老中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物衰老中的应用。本发明利用一个水稻早衰突变体克隆到PS1基因，PS1基因受发育年龄的调控且受脱落酸的特异诱导。转基因实验证明，PS1基因在野生型水稻中过表达可导致衰老的提前发生；而抑制水稻中PS1基因的表达可以一定程度的延迟衰老，提高籽粒千粒重，暗示PS1在提高水稻产量上具有较好的应用潜力。本发明在利用基因工程手段调控植物衰老进行高产分子育种上具有潜在的应用价值。
【专利说明】水稻PS1蛋白及其编码基因在调节植物衰老中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种水稻PSl蛋白及其编码基因在调节植物衰老中的应用。
【背景技术】
[0002]衰老是植物发育过程中必然经历的生命现象，受到精细的遗传调控，它是植物在长期进化过程中形成的适应性，对植物本身具有重要的生物学意义。植物衰老同时伴随着营养物质从衰老的器官向新生器官以及生殖器官的转移，因此也被认为是植物营养物质循环再利用的过程。尽管衰老是植物主动调控的正常生理现象，然而，在农业生产上，由于一些不利的因素，极其容易导致衰老的提前发生，造成早衰。早衰导致作物过早丧失光合功能和同化作用，从而显著减少籽粒中干物质的积累，严重影响作物的产量与品质，如许多优良的水稻品种尤其是以两优培九等为代表的超级杂交稻品种虽然具有强大的产量优势，但其生育后期普遍存在早衰引起的籽粒充实度低，空秕率高的现象，严重影响干物质的生产和积累，最终阻碍产量潜力的发挥。理论上推算，如果水稻叶片推迟I天衰老，可增产2%左右，而实际生产中可达到增产1%左右，可见早衰是制约水稻产量进一步提高的重要因素。
[0003]叶片衰老是一个复杂的遗传发育调控过程，其启动和进程受到发育年龄以及众多内外源因素的调控。然而，当前人们对于叶片衰老中基本的科学问题的理解仍然十分肤浅，对叶片衰老研究的思路和方法论仍缺乏统一的认识，对叶片衰老关键基因的克隆和研究仍然非常的滞后。因此，对作物叶片衰老展开深入系统的研究，从分子水平阐明叶片衰老的遗传机制，通过调控叶片的衰老进程来改善作物后期光合功能，使得叶片光合总量和营养物质再动员效率双双趋于最大化，既具有重要的科学意义，也是挖掘农作物产量潜力保障我国粮食安全的迫切需求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种水稻PSl蛋白及其编码基因在调节植物衰老中的应用。
[0005]本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质(PSl蛋白)或其编码基因(PSl基因)在调控植物衰老中的应用。
[0006]所述PSl蛋白或其编码基因调控植物衰老具体体现为:促进所述PSl蛋白或其编码基因的表达，则植物衰老时间提前和/或籽粒千粒重减少；抑制所述PSi蛋白或其编码基因的表达，则植物衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加。
[0007]由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质(PSl蛋白)或其编码基因(PSl基因)在选育衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0008]在实际应用中，当所选育衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加的植物品种时，需将所述PSi蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交。
[0009]本发明的再一个目的是提供一种 培育转基因植物的方法。[0010]本发明所提供的培育转基因植物的方法，可为如下A)或B)的方法:
[0011]A)具体可包括如下a)和b)的步骤:
[0012]a)在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(PSl基因)进行抑制表达，得到转基因植物；
[0013]b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加的转基因植物；
[0014]B)具体可包括如下c)和d)的步骤:
[0015]c)向目的植物中导入由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(PSl基因)，得到表达所述编码基因的转基因植物；
[0016]d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，衰老时间提前和/或籽粒千粒重减少的转基因植物。
[0017]在上述的应用或方法中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(PSl基因)是如下(I)至(4)中任一所述的DNA分子:
[0018](I)编码序列为序列表中序列I的DNA分子；
[0019](2)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0020](3)在严格条件下与(I)或(2)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0021](4)与(I) - (3)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0022]其中，序列I由1179个核苷酸组成，整个序列I即为所述PSl基因的编码序列(0RF)，编码序列表中序列2所示的蛋白质，序列2由392个氨基酸残基组成。
[0023]在所述方法A)中，所述在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，是通过将如下式(I)所示的DNA片段转入所述目的植物中实现的:
[0024]SEQ正向-X-SEQ反向(I)
[0025]所述SEQ挪是序列表中序列I的第457-730位核苷酸；
[0026]所述SEQ的序列与所述序列反向互补；
[0027]所述X是所述SEQ1^1与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互补。
[0028]在本发明中，所述式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列5的第1-768 位。
[0029]序列5由768个核苷酸组成。其中，第1_274位为所述PSl基因的一个片段的正向序列(对应上述式(I)中的SEQ1^1，与序列表中序列I的第457-730位一致)，第275-487位(第281-481位为GA20-lst内含子核苷酸序列)对应上述式(I)中的X，第488-768位为所PSl基因的一个片段的反向序列(对应上述式(I)中的SEQ&@，为序列表中序列I的第457-730位的反向互补序列)。
[0030]进一步，所述式(I)所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体(PSlRNAi载体)的形式转入所述目的植物中的；所述RNA干扰表达载体(PSlRNAi载体)上启动所述式(I)所示的DNA片段转录的启动子为所述Actinl启动子(序列3)。具体的,所述RNA干扰表达载体(PSlRNAi载体)为在pCAMBIA2300-Actin载体的多克隆位点(如Sal I和Pst I)之间插入序列表中序列5所示DNA片段后得到的重组质粒。
[0031]具体而言，所述RNA干扰表达载体(PSlRNAi载体)是按照包括如下步骤方法构建得到的:
[0032](a)用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切“5’-gtca^^_ +序列I的第457-730位+ Iigfc tgac-3’”所示的DNA片段甲，胶回收酶切片段，与经过Xho I和Bgl II双酶切的pUCRNAi载体骨架片段相连(BamH I和Bgl II为同尾酶)，得到中间载体pSRi_l ；
[0033](b)用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切所述DNA片段甲，胶回收酶切片段，与经过BamH I和Sal I双酶切的中间载体pSRi_l骨架片段相连(Xho I和Sal I为同尾酶)，得到中间载体pSR1-2 ；
[0034](c)用限制性内切酶Xho I和Pst I双酶切中间载体pSR1-2，胶回收酶切片段(反向重复序列，大小约为768bp)，与经过Sal I和Pst I双酶切的pCAMBIA2300_Actin载体骨架片段相连(Xho I和Sal I为同尾酶)，得到的重组质粒即为所述RNA干扰表达载体(PSlRNAi 载体)。
[0035]在所述方法B)中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(PSl基因)是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。
[0036]所述重组表达 载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0037]在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子可为Actinl启动子、35S启动子或ADHl启动子。
[0038]所述Actinl启动子为水稻内源启动子，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述ADHl启动子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
[0039]更为具体的，所述重组表达载体为如下(I) - (III)中任一种:
[0040](I)将所述PSl基因插入到pCAMBIA-2300-Actin载体的多克隆位点Xho I和SmaI之间后得到的重组质粒(pCAMBIA2300-Actinl-PSl)。在该重组表达载体中，启动所述PSl基因转录的启动子为所述Actinl启动子。
[0041](II)将所述PSl基因插入到pSAT6-EYFP载体的多克隆位点Xho I和Sma I之间后得到的重组质粒(PSAT6-PS1-EYFP)，在该重组表达载体中，启动所述PSl基因转录的启动子为所述35s启动子。
[0042](III)将所述PSl基因插入到pGBKT7载体的多克隆位点Nde I和EcoR I之间后得到的重组质粒(PGBKT7-PSI)，在该重组表达载体中，启动所述PSl基因转录的启动子为所述ADHl启动子。
[0043]在上述方法A)或B)中，将携带有所述PSl基因的所述重组表达载体或所述RNA干扰表达载体(PSlRNAi载体)导入所述目的植物，具体可为:通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0044]在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物，如水稻、玉米、小麦等。
[0045]在本发明的一个实施例中，所述植物为水稻，具体为水稻品种日本晴。
[0046]本发明利用一个水稻早衰突变体，使用SiteFinding-PCR的技术克隆出PSl基因并进行了功能分析。荧光定量PCR分析表明，PSl基因受发育年龄的调控并特异受植物激素脱落酸(ABA)的诱导表达；PS1基因编码一个细胞核定位的转录激活类转录因子其激活活性位于该蛋白C末端。转基因实验证明，PSl基因在野生型水稻中过表达，可导致衰老的提前发生，而抑制水稻中PSl基因的表达可以一定程度的延迟衰老，提高籽粒千粒重，暗示PSl在提高水稻产量上具有较好的应用潜力。本发明利用基因工程手段调控衰老关键基因的表达水平进行分子育种提高作物产量上具有潜在的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1为突变体水稻和野生型水稻的表型比较。其中，A为野生型和突变体psl-D表型；B为野生型和突变体开花后剑叶中叶绿素含量变化比较。
[0048]图2为突变体psl-D中衰老相关基因(SAGs)的表达量的实时荧光定量PCR检测结果。
[0049]图3为PSl基因克隆及T-DNA插入位点上下游100kbp范围内基因表达量的实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为利用SiteFinding-PCR方法克隆PSl基因；B为T-DNA插入位点上下游IOOkbp范围内11个基因表达量的实时荧光定量PCR检测结果。
[0050]图4为PSl基因在不同器官和组织中实时荧光定量PCR检测结果。其中，A为其中为PSl基因在根、茎、叶、叶鞘、幼穗和胚乳中的表达情况；B为PSl基因在种子不同发育时期的表达情况(Yl:l-2cm幼穗；Y2:10-15cm幼穗);C为PSl基因在同一叶片不同发育时期的表达情况(YL:幼叶，约为完全伸展叶大小的一半；NS:发育完成但尚未衰老的叶片；ES:早衰的叶片，黄花面积< 10% ;LS:衰老中后期叶片，黄花面积> 50%) ;D为PSl基因在同一株系不同位置叶片的表达情况(F:剑叶；L2:倒二叶；L3:倒三叶；L4:倒四叶；L5:倒五叶)；E为PSl基因在同一叶片不同部位的表达情况。
[0051]图5为PSl蛋白亚细胞定位结果。
[0052]图6为PSl基因转录激活分析结果。其中，BD表示转pGBKT7空载的阴性对照；BD-P表示转pGBKT7-GAL4的阳性对照；BD_PS1表示转pGBKT7_PSl载体；BD_PS1 Λ N表示转 pGBKT7-PSl-N 载体；BD_PS1 Δ C 表示转 pGBKT7_PSl_C 载体。
[0053]图7为PSl基因的表达水平受脱落酸的正调控。其中，A为PSl基因在不同激素及非生物逆境条件下的实时荧光定量PCR检测结果；B为PSl基因在ABA处理不同时间实时荧光定量PCR检测结果。
[0054]图8为过表达PSl转基因水稻中PSl基因表达水平鉴定及表型。其中，A为野生型水稻中过表达PSl基因株系OEl、0E2和0E3的表型；B为过表达水稻株系OEl、0E2和0E3中PSl基因表达量的实时荧光定量PCR检测结果。
[0055]图9为过表达PSl转基因水稻的籽粒千粒重测定结果。
[0056]图10为PSl基因的RNAi水稻中PSl基因表达水平鉴定及表型。其中，A为野生型水稻中抑制PSl基因株系Ril和Ri2的表型；B为抑制PSl基因株系Ril和Ri2中PSl基因表达量的实时荧光定量PCR检测结果。
[0057]图11为PSl基因的RNAi水稻的籽粒千粒重测定结果。
【具体实施方式】
[0058]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0059]下述实施例中所用的材料 、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060]水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴(Nipponbare):记载于 “Sun，C.H.，Fang，J.，Zhao, T.L.，Xuj B.，Zhang, F.T.，Liuj L.C.，Tang, J.Y.，Zhang, G.F.，Deng, X.J.，Chen, F.，Qian, Q.，Caoj X.F.and Chuj C.C.(2012) The histone methyl transferaseSDG724mediates H3K36me2/3deposition at MADS50and RFTland promotes flowering inrice.Plant Cell, 24，3235-3247.” 一文。
[0061]pCAMBIA2300_Actin 载体:记载于 “Wang，K.J.，Tang, D.，Wang, M.，Lu, J.F.，Yuj H.X.，Liuj J.F.，Qian, B.X.，Gong, Z.Y.，Wang, X.，Chen, J.M.，Guj Μ.H.and Cheng, Z.K.(2009)MER3is required for normal meiotic crossover formation, but not for presynapticalignment in rice.J Cell Sci，122，2055-2063.” 一文。
[0062]pUCRNAi 载体:记载于 “Wang，K.J.，Tang, D.，Wang, M_，Lu, J.F.，Yuj Η.X.，Liuj J.F.，Qian, B.X.，Gong, Z.Y.，Wang, X.，Chen, J.M.，Guj Μ.H.and Cheng, Z.K.(2009)MER3isrequired for normal meiotic crossover formation,but not for presynapticalignment in rice.J Cell Sci，122，2055-2063.” 一文。
[0063]农杆菌AGLl:记载于 “Sun，C.Η.，Liuj L C.，Tang, J.Y.，Linj A.H.，Zhang, F.T., Fang, J., Zhang, G.F.and Chuj C.C.(2011) RLINlj encoding a putativecoproporphyrinogen III oxidase, is involved in lesion initiation in rice.J GenetGenomics, 38，29-37.” 一文。
[0064]表达载体pSAT6-GFP:记载于 “Tong H.N.，Liuj L C.，Jinj Y.，Duj L，Yin, Y.H.，Qian，Q.，Zhu，L.H.，Chu，C.C.(2012) DWARF AND LOW-TILLERING Acts as a DirectDownstream Target of a GSK3/SHAGGY_Like Kinase to Mediate BrassinosteroidResponses in Rice.Plant Cell，24，2526-2577.” 一文。
[0065]实施例1、与植物衰老相关的PSl蛋白及其编码基因的获得[0066]—、突变体的获得及其表型
[0067]从水稻突变体库(来自中国科学院遗传与发育生物学研究所)中发现一个早衰的突变体。和野生型相比，此突变体表型出明显早衰表型，该突变的表型如图1中A所示。其中，WT为野生型水稻，psl-D为上述筛选得到的突变体水稻。此突变体水稻幼苗期和野生型几乎没有差异。随着发育的进行，进入分蘖期以后老叶片出现衰老加速的现象，和野生型相比年龄越大的叶片黄花早衰越严重，叶绿素含量也相对越低。进入灌浆期以后，衰老的表型进一步加剧。以剑叶为例，如图1中B所示，其叶绿素含量在开花后10天开始出现显著性的差异，25天左右差异达到最大值，突变体叶绿素含量仅为野生型60%左右，最终导致整株死亡的时间较野生型提前了 7-10天。
[0068]利用荧光定量PCR方法分析水稻中已报道衰老基因及Marker基因的表达情况。取野生型和突变体水稻相同部位完全展开叶片，采用Trizol试剂法(Invitrogen)提取其总RNA，采用购自Promega公司的MMLV逆转录酶并参照相应的使用方法进行反转录，然后利用实时荧光定量PCR技术，根据厂家(Bio-Rad公司)提供的使用方法，在PCR体系中加入SYBR green I荧光染料，在荧光定量PCR仪C1000? Thermal Cycler(CFX96real-time system, Bio-Rad, USA)上检测衰老相关基因(Senescence-associatedgenes, SAGs)的表达情况，SAGs基因信息参见如下文献:Yamatani H., Sato Y., MasudaY.,Kato Y., Morita R.,Fukunaga K., Nagamura Y., Nishimura M., Sakamoto ff., TanakaA., and Kusaba M(2013)NYC4, the rice orthologs of Arabidopsis THF1, is involved inthe degradation of chlorophyll-protein complexes during leaf senescence, PlantJ74(4):652-662,引物序列如下列表1。以水稻ACTINl基因为内参，实验设三次重复。
[0069]其中，扩增内参ACTINl的引物序列为:
[0070]ACTINl 上游引物:5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’ ；
[0071]ACTINl 下游引物 :5’ -GTACCCTCATCAGGCATCTG-3’。
[0072]数据处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ACt=Ct(SAGs)-Ct(ACTINl),以2_Δα值衡量基因转录水平，对突变体及野生型水稻中SAGs基因的表达进行分析比较。结果如图2所示，所检测衰老相关基因呈现显著性的上调表达。
[0073]以上结果表明，所获水稻突变体是一个典型的早衰突变体。
[0074]表1SAGs基因的引物序列
[0075]
【权利要求】
1.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物衰老中的应用。
2.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在选育衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加的植物品种中的应用。
3.培育转基因植物的方法，为如下A)或B)的方法: A)包括如下a)和b)的步骤: a)在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物； b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，衰老时间延迟和/或籽粒千粒重增加的转基因植物； B)包括如下c)和d)的步骤: c)向目的植物中导入由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物； d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，衰老时间提前和/或籽粒千粒重减少的转基因植物。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下(I)至(4)中任一所述的DNA分子:. (1)编码序列为序列表中序列I的DNA分子； (2)序列表中序列I所不的DNA分子； (3)在严格条件下与(I)或(2)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； (4)与(I)-(3)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述方法A)中，所述在目的植物中对由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，是通过将如下式(I)所示的DNA片段转入所述目的植物中实现的: SEQ正向-X-SEQ反向(I) 所述SEQ丨自是序列表中序列I的第457-730位核苷酸； 所述SEQ的序列与所述序列反向互补； 所述X是所述SEQ1^1与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互补。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列5的第1-768位。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述方法B)中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为Actinl启动子、35S启动子或ADHl启动子。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物。
10.根据权利要求9所述的.应用或方法，其特征在于:所述单子叶植物为水稻。
【文档编号】C12N15/84GK103468714SQ201310400013
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】储成才, 梁成真, 王义琴, 唐九友 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所