图像识别法细胞计数器校准方法
【专利摘要】本发明公开了一种图像识别法细胞计数器校准方法，校准方法中使用专用的透明材质的仿细胞计数板作为细胞计数器的校准品，其仿细胞计数板是采用石英光掩模技术制备、具有能使细胞计数器识别的与真核细胞的直径和活率相似的仿细胞的仿细胞计数板。本图像识别法细胞计数器校准方法解决了目前使用细胞计数板法人工计数来间接验证细胞计数器测量的准确性的无奈。仿细胞计数板能真实反映真核细胞的大小、浓度和活率等信息，能评价细胞计数器在不同条件下测量的精密度。具有重要的校准价值，能广泛的应用于细胞、胚胎、生殖等生命科学研究和临床应用领域。
【专利说明】图像识别法细胞计数器校准方法
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种生物医学仪器校准方法，尤其涉及一种用于检测活细胞数量的图像识别细胞计器校准方法。
【背景技术】
[0002]细胞计数器作为一种计量设备，需要定期进行校准以保证测量的精密度。目前细胞计数器的校准无标准品，通常是由使用单位利用自制的活细胞制品监测，但由于细胞的种类、培养条件、存活率、悬液浓度制备及保存时间等条件限制，更为重要的是自制细胞数量和活性随时间的不确定性使得目前尚不能很好的使用一种活细胞建立标准的生物学模型用于校准细胞计数器；目前细胞计数器每次校准需要制备样品用细胞计数板法人工计数进行间接验证细胞计数器测量的准确性，但无法评价细胞计数器测定不同大小细胞和细胞活率时的精密度，同时也无法评价细胞计数器系统内误差和偏差，所以国内外的细胞计数器的准确性和精密性可能存在较大的偏差。
[0003]故制作标准的可重复性的“细胞”模型，并将其用于细胞计数器的校准就显得尤为重要。
【发明内容】
[0004]为了解决目前细胞计数器无标准的可重复的“细胞”模型用于校准即无法评价细胞计数器测量不同大小细胞、不同细胞浓度和细胞活率时的精密度和无法评价细胞计数器系统内误差的问题，本发明的目的是提供一种采用仿细胞校准板进行细胞计数器校准的图像识别法细胞计器校准方法，该方法具评价细胞计数器在不同细胞浓度和细胞活率时的准确性并评价细胞计数器的系统误差功能，同时具有时操作简便、易行。
.[0005]本发明的技术方案是以下述方式实现的:
一种图像识别法细胞计数器校准方法，校准方法中使用专用的透明材质的仿细胞计数板作为细胞计数器的校准品，其仿细胞计数板是采用石英光掩模技术制备、具有能使细胞计数器识别的与真核细胞的直径和活率相似的仿细胞的仿细胞计数板。
[0006]仿细胞计数板为玻璃或透明塑料材质，其上有两个相同检测区域，每个检测区域面积至少为3mmX3mm ;仿细胞计数板上、检测区域有两类圆:一类为透明圆环代表仿活细胞；另一类为不透明实心圆代表仿死细胞。
[0007]仿细胞计数板的检测区域按ImmX Imm分成9个大区域，大区域之间的刻线宽度为9um,线深度为4um。
[0008]每个大区域中按0.25mmX0.25mm分成16个中区域，中区域之间的刻线宽度为6um,线深度为4um，16个中区域里有8个带细胞图案区域和8个空白区域、带细胞图案区与空白区域交替排列。
[0009]每个带细胞图案的区域按0.125mmX0.125mm分成4个小区域，区域之间线宽为4um,线深度为4um。[0010]每个带细胞图案的区域按从左到右、从上到下顺序原则标注汉字“一”?“十”序号分别标注十行横向排列的活的或死的仿细胞和十行纵向排列的活的或死的仿细胞。
[0011]每个小区域中心间隔25umX25um,两类仿细胞按直径为5um、10um、15um、20um、25um的两类圆从小到大，顺序从左到右、从上到下原则排列。
[0012]4个小区域细胞图案分成两个仿活细胞图案区域和两个仿死细胞图案区域,两个仿活细胞图案区域中心对称，两个仿死细胞图案区域中心对称，每个仿活细胞图案区域有I个直径为25um仿活细胞、3个直径为20um仿活细胞、5个直径为15um仿活细胞、7个直径为IOum仿活细胞、9个5um直径为仿活细胞；每个仿死细胞图案区域的仿死细胞数量和直径与每个仿活细胞图案区域活细胞数量和直径相同。
[0013]图像识别法细胞计数器结构包括光源、计数片、调焦物镜、感光芯片、数据线、控制器、图像识软件、显示器。
[0014]细胞计数器和仿细胞计数板精密度评价为:
日内精密度:同一个仿细胞计数板连测5次，计算RSD (相对标准方差)，RSD应达到5%——10%则为合格；
日间精密度:同一个仿细胞计数板不同日各测3次，计算RSD，RSD在5 — 15%以内则为合格；
批内精密度:是同一次测定的精密度，通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7 —10份，每种浓度的样品所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定，计算每种浓度样品的RSD值，且所得RSD应在5%——10%则为合格；
批间精密度:是不同次测定的精密度，通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7 - 10份，按所拟定的 分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的RSD值，RSD应控制在5 - 15%以内。
[0015]本发明的原理是:依据人工可制备物理和光学特性与真核细胞相近的仿细胞计数板间接反映细胞计数器精密度的原理。仿细胞计数板的特征是:仿细胞图案直径大小、仿细胞细胞图案的明暗程度与真核生物细胞的直径大小和死活状态相仿。仿细胞图案疏密相间，模拟真实细胞的实际浓度情况。
[0016]本发明的积极效果是:
仿细胞计数板的可重复性的“细胞”模型各种参数已知可控，并且能直接在细胞计数器上使用，通过绘制不同细胞浓度和细胞活率时的标准曲线及计算相对标准差，用以评价细胞计数器的精密度；解决了目前使用细胞计数板法人工计数来间接验证细胞计数器测量的准确性的无奈。仿细胞计数板能真实反映真核细胞的大小、浓度和活率等信息，能评价细胞计数器在不同条件下测量的精密度。具有重要的校准价值，能广泛的应用于细胞、胚胎、生殖等生命科学研究和临床应用领域。
[0017]说明书附图:
图1为仿细胞计数板外观结构示意图。
[0018]图2为仿细胞计数板每个检测区域的放大示意图。
[0019]图3为仿细胞计数板带细胞图案中区域放大示意图。
【具体实施方式】[0020]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
实施例一
由图1可以看出:本发明选择仿细胞计数板I作为细胞计数器的校准品，仿细胞计数板I透明，有两个相同检测区域2以便两端均可插入计数器内进行校准检测，每个检测区域面积至少为3_X3mm;仿细胞计数板上检测区域内设有两类圆，一类为透明圆环5，圆环的刻线不透明，圆环线中间部分及内圆中心透明，代表仿活细胞；另一类为不透明实心圆6，代表仿死细胞；
由图2可以看出:为了方便肉眼观察，仿细胞计数板的检测区域按ImmX Imm分成9个大区域，大区域之间的线宽为9um，线深度为4um ；
由图2还可以看出:为了方便肉眼观察，每个大区域中按0.25mmX0.25mm分成16个中区域，中区域之间线宽为6um，线深度为4um，16个中区域里有8个带细胞图案区域3和8个空白区域4 ；
由图3可以看出:为了方便肉眼观察和数数，同时为避引起图像识别软件误判，每个带细胞图案的中区域按从左到右、从上到下顺序原则标注汉字的“一”至“十”序号分别标注十行横向排列的活的或死的仿细胞和十行纵向排列的活的或死的仿细胞。
[0021]由图3还可以看出:每个带细胞图案的中区域按0.125mmX0.125mm分成4个小区域，区域之间线宽为4um，线深度为4um ；
由图3还可以看出:带细胞图案的小区域以中心间隔25umX25um,两类仿细胞按直径为5um、10um、15um、20um、25um的两类圆从小到大,顺序从左到右、从上到下原则排列。
.[0022]由图3还可以看出:4个小区域细胞图案分成两个仿活细胞图案区域和两个仿死细胞图案区域，两个仿活细胞图案区域中心对称，两个仿死细胞图案区域中心对称，每个仿活细胞图案区域有I个直径为25um仿活细胞、3个直径为20um仿活细胞、5个直径为15um仿活细胞、7个直径为IOum仿活细胞、9个5um直径为仿活细胞；每个仿死细胞图案区域的仿死细胞数量和直径与每个仿活细胞图案区域活细胞数量和直径相同。
[0023]检测时:
采用的细胞计数器结构包括光源、计数片、调焦物镜、感光芯片、数据线、控制器、图像识软件、显示器。
[0024]其操作步骤如下:
1、将仿细胞计数板放入超声波清洗器中反复清洗5遍，每次换用新鲜制备的超纯水，超纯水电导率:18.2MQ ；
2、在超净台中使用无水乙醇或清水清洗仿细胞计数板，上下两面各清洗五遍；
3、使用洗耳球吹干，待用；
4、打开细胞计数器电源，仪器自检结束，插入待用的仿细胞计数板；
5、通过调焦旋钮将图像调整至清晰；
6、按计数键计数(按日内/日间精密度和批内/间精密度要求测量不同的校准板相应的次数);
7、结果显不并存储；
8、细胞计数器和仿细胞计数板精密度评价:
日内精密度:同一个仿细胞计数板连测五次，计算相对标准方差(RSD)，RSD应达到5%—10%，则计数器为合格，否则为不合格；
日间精密度:同一个仿细胞计数板不同日各测三次，计算RSD，RSD控制在5 — 15%以内计数器为合格产品。
[0025]批内精密度:是同一次测定的精密度，通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7 — 10份，每种浓度的样品所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。计算每种浓度样品的RSD值，且所得RSD应争取在5%——10%以内计数器为合格。
[0026]批间精密度:是不同次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7 - 10份，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的RSD值，RSD应控制在5 - 1 5%以内，计数器为合格产品。
【权利要求】
1.一种图像识别法细胞计数器校准方法，校准方法中使用专用的透明材质的仿细胞计数板(I)作为细胞计数器的校准品，其特征在于:仿细胞计数板(I)是采用石英光掩模技术制备、具有能使细胞计数器识别的与真核细胞的直径和活率相似的仿细胞的仿细胞计数板。
2.根据权利要求1所述的图像识别法细胞计数器校准方法，其特征在于:仿细胞计数板为玻璃或透明塑料材质，其上有两个相同检测区域(2)，每个检测区域面积至少为3mmX 3mm;仿细胞计数板上、检测区域有两类圆:一类为透明圆环(5)代表仿活细胞；另一类为不透明实心圆(6)代表仿死细胞。
3.根据权利要求2所述的图像识别法细胞计数器校准方法，其特征在于:仿细胞计数板的检测区域按ImmXlmm分成9个大区域,大区域之间的刻线宽度为9um,线深度为4um。
4.根据权利要求3所述的图像识别法细胞计数器校准方法，其特征在于:每个大区域中按0.25mmX0.25mm分成16个中区域，中区域之间的刻线宽度为6um，线深度为4um，16个中区域里有8个带细胞图案区·域(3)和8个空白区域(4)、带细胞图案区域与空白区域交替排列。
5.根据权利要求4所述的图像识别法细胞计数器校准方法，其特征在于:每个带细胞图案的区域按0.125mmX0.125mm分成4个小区域，区域之间线宽为4um,线深度为4um。
6.根据权利要求5所述的图像识别法细胞计数器校准方法，其特征在于:每个带细胞图案的区域按从左到右、从上到下顺序原则标注汉字“一”?“十”序号分别标注十行横向排列的活的或死的仿细胞和十行纵向排列的活的或死的仿细胞。
7.根据权利要求6所述的图像识别法细胞计数器校准方法，其特征在于:每个小区域中心间隔25umX25um,两类仿细胞按直径为5um、10um、15um、20um、25um的两类圆从小到大，顺序从左到右、从上到下原则排列。
8.根据权利要求7所述的图像识别法细胞计数器校准方法，其特征在于:4个小区域细胞图案分成两个仿活细胞图案区域和两个仿死细胞图案区域，两个仿活细胞图案区域中心对称，两个仿死细胞图案区域中心对称，每个仿活细胞图案区域有I个直径为25um仿活细胞、3个直径为20um仿活细胞、5个直径为15um仿活细胞、7个直径为IOum仿活细胞、9个5um直径为仿活细胞；每个仿死细胞图案区域的仿死细胞数量和直径与每个仿活细胞图案区域活细胞数量和直径相同。
9.根据权利要求1——8任一所述的图像识别法细胞计数器校准方法，其特征在于:图像识别法细胞计数器结构包括光源、计数片、调焦物镜、感光芯片、数据线、控制器、图像识软件、显示器。
【文档编号】C12M1/34GK103436439SQ201310399802
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】朱耀辉, 余海滨, 赵光, 李静, 杨红 申请人:朱耀辉, 赵光, 余海滨, 李静, 杨红