一种发酵生产l-丙氨酸的高产菌株及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种发酵生产L-丙氨酸的高产菌株Lds.0108，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC?M2013361。该菌株是以德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus，GIM1.155）为出发菌株，采用低能离子注入法诱变处理细胞，并通过可逆抑制测定法筛选出的突变株，该菌株的生长温度范围为35-40℃，最佳生长温度为37℃；最适pH值为7.0；使用的斜面培养基为MRS培养基，该菌株以葡萄糖等糖类物质为底物，在厌氧条件下发酵生产L-丙氨酸，提纯过程中使用超滤膜过滤和纳滤膜过滤去除杂质，保证了产品质量，适合大规模工业化生产。
【专利说明】一种发酵生产L-丙氨酸的高产菌株及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种发酵生产L-丙氨酸的高产菌株及其制备方法，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]L-丙氨酸是组成蛋白质的氨基酸之一，虽然为人体非必须氨基酸，但却是人体血液中含量最高的氨基酸，在医药、高分子材料、食品等领域具有广泛的用途。在医药领域:L-丙氨酸作为医药中间体，是生产维生素B6及L-氨基丙醇的主要原料；与糖代谢密切相关，在转氨反应中是主要的氨基供体，具有重要的生理功能，在临床上常添加到输液中；另外，L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。在高分子材料领域:近年来发现聚乳酸中添加L-丙氨酸可有效提高聚乳酸的性能。在食品领域:L-丙氨酸具有独特的改善风味的效果，与其他氨基酸配合能加强食品和饮料的风味；添加L-丙氨酸可以明显提高食品和饮料中蛋白质的利用率；还可以改善有机酸的酸味，越来越受到人们的欢迎和重视。
[0003]目前，L-丙氨酸的主要工业化生产方法就是酶法转化，即通过富有L-天冬氨酸_β -脱羧酶活力的微生物细胞催化L-天冬氨酸而得到。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备投资小，提取工艺简单，但其主要原材料L-天冬氨酸价格较贵，造成其生产成本较高。Pascal Hols等报道了利用基因工程手段改造乳酸菌，以葡萄糖、蔗糖或乳糖等为原料发酵生产L-丙氨酸(US 6 627 420 BI )，但是基因工程方法构建菌种的过程复杂，技术要求高，而且得到的基因工程菌株很难稳定遗传和保藏。高理所等报道了利用紫外线和激光等复合诱变的方法筛选L-丙氨酸的高产菌株(安徽工程科技学院学报，2008，23(I): 19-24)，但是由于紫外线对各种微生物的诱变效应不同，加上微生物吸收射线的剂量大小很难把握，且突变后易发生光修复作用，所以紫外线诱变的效果不佳，正突变率较低，死亡率较高。
[0004]离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明，是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法。与传统的诱变源如X射线、Y射线、紫外线以及各种化学诱变剂相比，离子注入不仅有能量沉积，还有动量传递、质量沉积及电荷交换等效应。低能离子束对微生物的诱变是直接作用和间接作用的共同结果，其直接作用主要是注入离子的动量传递于细胞的表面产生的溅射作用和沉积于细胞内部产生的刻蚀损伤，而间接作用主要是注入离子的能量沉积于细胞内部产生的自由基所导致的作用。它能够引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，大幅提闻变异的频率。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种发酵生产L-丙氨酸的高产菌株，并利用该菌株来生产L-丙氨酸，使其在生产当中能够达到突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定的效果。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种高产L-丙氨酸的Zife.0108菌株，该菌株已于2013年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为:中国武汉武汉大学，保藏号为:CCTCC NO:M 2013361。
[0007]本发明还提供一种高产L-丙氨酸的Zife.0108菌株制备方法，该方法包括:以乳酸产生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种delbrueckii subsp.bulgaricus、％出发菌株，活化出发菌一低能离子注入法诱变处理细胞一可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的高产菌株。
[0008]具体来说该方法包括:
1、活化出发菌:将出发菌德氏乳杆菌保加利亚亚种在斜面培养基上42°c培养至对数生长期，用0.85 %的生理盐水制成菌悬液，ImL菌悬液含菌数约为107，镜检菌种健壮且无杂菌后，吸取0.1mL菌悬液均匀涂布于无菌空白培养皿上，无菌风吹干制成菌膜，镜检无细胞重叠后，进行下一步；
2、低能离子注入诱变法诱变处理细胞:真空条件下注入的离子为N离子，剂量为1.5X1014-5X1016 ions/cm2，能量为15_20keV，脉冲注入，每次注入5s，间隔时间15_40s，注入后用0.5-lmL无菌生理盐水洗下菌体细胞，采用的是定量诱变，经试验检测成功率在5% ；
3、可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的突变株:挑选离子注入后的单菌落进行编号，并接种到对应编号的发酵培养基中发酵培养；将所得的发酵液除去菌体后高温灭菌，加入1.5%琼脂和0.01-0.05%抑制剂，灭菌后倒平板，并涂布指示菌，置于35-40 °C培养箱中进行培养；选取指示菌生长的平板所对应的编号的突变菌株进行连续传代培养，通过稳定性试验，最终得到菌株；
本发明进一步提供一种制备L-丙氨酸的方法:利用上述的菌种来制备，
具体步骤包括:
1、扩增培养种子液:保藏号为=CCTCC M 2013361的高产菌株Zife.0108菌株来生产发酵通过斜面培养和种子罐扩培养,培养温度37°C，斜面培养时间24h，种子罐培养时间18h ；
2、厌氧发酵生产L-丙氨酸:将扩增后的种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖浓度为6-12%，发酵温度为35-40°C，培养基pH值为6.5-7.5，维持厌氧环境，待残糖浓度小于
0.1%则发酵完成，发酵时间30-52h ；
3、发酵液净化处理:先采用陶瓷超滤膜或有机管式超滤膜过滤，然后通过纳滤膜进一步过滤；
4、制得成品:纳滤液经过真空浓缩蒸发去水分，结晶析出L-丙氨酸，经离心分离，干燥得成品。
[0009]本发明的有益效果是:以德氏乳杆菌保加利亚亚种delbrueckiisubsp.bulgaricus)为出发菌株，采用低能离子注入法诱变处理细胞，并通过可逆抑制测定法筛选出生产L-丙氨酸的突变株，用该突变株以葡萄糖等糖类物质为底物，在35-40°C，pH 6.5-7.5厌氧条件下发酵生产L-丙氨酸。选择乳酸产生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种{Lactobacillus delbrueckii subsp./wJgariciAs)作为出发菌株,因为该菌种在厌氧条件下具有较高的糖酵解能力，在实际应用过程中会节约大量的动力成本，而且该菌种作为食品级菌种，其发酵产生的乳酸与丙氨酸是结构类似物，会大大提高正突变的效率；所用的原材料葡萄糖属于可再生纯天然资源，来源广泛，价格低廉，且厌氧发酵减少了动力消耗，降低了生产成本；提纯过程中使用超滤膜过滤和纳滤膜过滤去除杂质，保证了产品质量，适合大规模工业化生产；采用的低能离子注入诱变法具有突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定等优点。
【具体实施方式】
[0010]本发明的菌株是通过低能离子诱变法诱变出发菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)得到的,该菌株已于2013年8月 5 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为:湖北省武汉市洪山区八一路，保藏号为=CCTCCM 2013361。Lds.0108菌株的生长温度范围为35-40°C，最佳生长温度为37°C ;最适pH值为7.0 ;使用的斜面培养基为MRS培养基。
[0011]实施例1:
L-丙氨酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变株的诱变。
[0012]1、培养基组分:
1.1斜面培养基的成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，七水硫酸镁0.02%,碳酸钙2%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，柠檬酸二胺0.2%，磷酸氢二钾0.2%，七水硫酸锰0.005%,琼脂2%，氢氧化钠调pH至7.0，121°C蒸汽灭菌20min。
[0013]1.2发酵培养基的成分:葡萄糖6%，磷酸二氢钾0.2%，磷酸氢二钾1.2%，无水硫酸镁0.02%，氨水调pH至7.0，115°C蒸汽灭菌20min。
[0014]在发酵培养基配制过程中，无任何含丙氨酸的有机物掺入，为避免对下步筛选L-丙氨酸产生菌造成干扰。
[0015]2、操作步骤:
将出发菌德氏乳杆菌保加利亚亚种在斜面培养基上42°C培养18h左右，至对数生长期，用0.85%的生理盐水制成菌悬液，ImL菌悬液含菌数约为107，镜检菌种健壮且无杂菌。吸取0.1mL菌悬液均匀涂布于直径为9cm的无菌空白培养皿上，无菌风吹干制成菌膜，镜检无细胞重叠后，在真空条件下进行离子注入处理。
[0016]离子注入机由中国科学院等离子体物理研究所提供。注入的离子为N离子，离子能量15keV，注入剂量1.5 X 1O14 ions/cm2，注入时间5s，间隔时间15s。
[0017]将经过离子注入处理后的菌膜用1mL无菌生理盐水进行洗脱，然后取0.1mL洗脱液涂布于固体平板上(成分同斜面培养基)，置于37 °C培养箱中培养48h。
[0018]将长出的单菌落进行编号，用接种环将各个单菌落分别挑入到对应编号的发酵培养基中，37 1:厌氧发酵48h。发酵过程中pH值下降，流加浓度25%的氨水，维持发酵液pH值在6.5至7.5。将发酵液过滤除去菌体，其滤液经121°C蒸汽灭菌20min。
[0019]在灭菌后不含菌体的发酵液中添加1.5%的琼脂，115°C蒸汽灭菌20min后将
0.01%的抑制剂L-氨基乙基磺酸过滤除菌后加入其中，倒平板。将作为指示菌的普通变形杆菌涂布于该平板上，置于37 °C培养箱中培养48h。
[0020]若指示菌在含有抑制剂的平板上生长，说明发酵液中含有L-丙氨酸，则对应编号的菌株即为产L-丙氨酸的突变株,挑取该编号的菌株在斜面培养基上培养18h后暂存于4°C冰箱。
[0021]实施例2:
产L-丙氨酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变株的诱变。[0022]1、培养基组分:斜面培养基和发酵培养基的成分同实施例1。
[0023]2、操作步骤:按实施例1的方法将出发菌株制成菌膜，镜检无细胞重叠后，在真空条件下进行离子注入处理，注入离子为N离子，离子能量20keV，注入剂量6.0 X IO15 ions/cm2,注入时间5s,间隔时间30s。
[0024]将经过离子注入处理后的菌膜用I mL无菌生理盐水进行洗脱，然后取0.1mL洗脱液涂布于斜面培养基上，置于37 °C培养箱中培养72h。
[0025]将长出的单菌落进行编号，用接种环将各个单菌落分别挑入到对应编号的发酵培养基中，37 1:厌氧发酵48h。发酵过程中pH值下降，流加浓度25%的氨水，维持发酵液pH值在6.5至7.5。将发酵液过滤除去菌体，其滤液经121°C蒸汽灭菌20min。
[0026]在灭菌后不含菌体的发酵液中添加1.5%的琼脂，115°C蒸汽灭菌20min后将0.03%的抑制剂L-氨基乙基磺酸过滤除菌后加入其中，倒平板。将作为指示菌的普通变形杆菌涂布于该平板上，置于37 °C培养箱中培养72h。
若指示菌在含有抑制剂的平板上生长，说明发酵液中含有L-丙氨酸，则对应编号的菌株即为产L-丙氨酸的突变株,挑取该编号的菌株在斜面培养基上培养18h后暂存于4°C冰箱。
[0027]实施例3:
产L-丙氨酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变株的诱变。
[0028]1、培养基组分:斜面培养基和发酵培养基的成分同实施例1。
[0029]2、操作步骤:按实施例1的方法将出发菌株制成菌膜，镜检无细胞重叠后，在真空条件下进行离子注入处理，注入离子为N离子，离子能量20keV，注入剂量5.0 X IO16 ions/cm2,注入时间5s,间隔时间40s。
[0030]将经过离子注入处理后的菌膜用0.5 mL无菌生理盐水进行洗脱，然后取0.1mL洗脱液涂布于斜面培养基上，置于37 °C培养箱中培养96h。
[0031]将长出的单菌落进行编号，用接种环将各个单菌落分别挑入到对应编号的发酵培养基中，37 1:厌氧发酵48h。发酵过程中pH值下降，流加浓度25%的氨水，维持发酵液pH值在6.5至7.5。将发酵液过滤除去菌体，其滤液经121°C蒸汽灭菌20min。
[0032]在灭菌后不含菌体的发酵液中添加1.5%的琼脂，115°C蒸汽灭菌20min后将0.05%的抑制剂L-氨基乙基磺酸过滤除菌后加入其中，倒平板。将作为指示菌的普通变形杆菌涂布于该平板上，置于37 °C培养箱中培养96h。
[0033]若指示菌在含有抑制剂的平板上生长，说明发酵液中含有L-丙氨酸，则对应编号的菌株即为产L-丙氨酸的突变株,挑取该编号的菌株在斜面培养基上培养18h后暂存于4°C冰箱。
[0034]重复实施例1-3，将得到的突变株进行连续传代培养、发酵试验，最终获得I株产L-丙氨酸浓度较高、遗传稳定性较好的的突变株，编号为Ζ?.0108，其保藏号为:CCTCC M2013361。
[0035]实施例4:
利用突变株0108在100L发酵罐中发酵生产L-丙氨酸。
[0036]1、培养基组分:
1.1斜面培养基的成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，七水硫酸镁0.02%,碳酸钙2%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，柠檬酸二胺0.2%，磷酸氢二钾0.2%，七水硫酸锰0.005%,琼脂2%，氢氧化钠调pH至7.0，121°C蒸汽灭菌20min。
[0037] 1.2种子培养基的成分:蛋白胨0.8%，酵母膏0.5%，甘油0.5%，磷酸二氢钾0.2%，磷酸氢二钾1.2%，无水硫酸镁0.02%,氢氧化钠调pH至7.0，121°C蒸汽灭菌20min。
[0038]1.3发酵培养基的成分:葡萄糖6%，磷酸二氢钾0.2%，磷酸氢二钾1.2%，无水硫酸镁0.02%,氢氧化钠调pH至7.0，115 °C蒸汽灭菌20min。
[0039]2、操作步骤:将突变株Zife.0108移种到斜面培养基上，在37°C下培养24h。将斜面上的菌株用无菌水制成菌悬液。
[0040]按0.5%的接种量接入摇瓶种子培养基中，1000mL三角烧瓶装液量300mL，培养温度37°C，在转速120rpm的摇床上培养18h。
[0041]将培养好的种子液按0.5%的接种量接入100L发酵罐中，发酵温度培35°C，转速200rpm,罐压0.05Mpa,发酵过程中pH值下降，流加浓度25%的氨水，维持发酵液pH值在6.5至7.5。整个发酵过程不需要通入空气，维持厌氧状态。
[0042]发酵30h，发酵液PH值不再降低，氨水消耗速度为零，测残糖浓度小于0.05%,停止发酵，高效液相检测发酵液中L-丙氨酸浓度为5.63%。
[0043]上述发酵液通过孔径20纳米管式有机膜膜超滤，除去菌体细胞等大分子物质，用20L纯水透析洗涤过滤母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超滤清液中。
上述超滤清液通过600分子量纳滤膜过滤，脱去色素，进一步除去较大分子量杂质、磷酸盐、二价金属离子等。钠滤母液充分透析洗涤，得纳滤液总共约185L。
[0044]利用真空旋转薄膜蒸发仪器对上述纳滤液蒸馏浓缩结晶，浓缩液冷却到20°C以下充分结晶，抽滤得母液20L，干燥晶体，得L-丙氨酸3980.6g，经检验产品含量达到99.2%，比旋光度14.7，质量符合GB 25543-2010。
[0045]实施例5:
利用突变株0108在10立方米发酵罐中发酵生产L-丙氨酸。
[0046]1、培养基组分:
1.1斜面培养基的成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，七水硫酸镁0.02%,碳酸钙2%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，柠檬酸二胺0.2%，磷酸氢二钾0.2%，七水硫酸锰0.005%,琼脂2%，氢氧化钠调pH至7.0，121°C蒸汽灭菌20min。
[0047]1.2种子培养基的成分:蛋白胨0.8%，酵母膏0.5%，甘油0.5%，磷酸二氢钾0.2%，磷酸氢二钾1.2%，无水硫酸镁0.02%,氢氧化钠调pH至7.0，121°C蒸汽灭菌20min。
[0048]1.3发酵培养基的成分:葡萄糖9%，磷酸二氢钾0.2%，磷酸氢二钾1.2%，无水硫酸镁0.02%，氢氧化钠调pH至7.0，115 °C蒸汽灭菌20min。
[0049]2、操作步骤:将突变株Zife.0108分别移种到斜面培养基上，在37 °C下培养24h。将斜面上的菌株用无菌水制成菌悬液。
[0050]按0.5%的接种量接入摇瓶种子培养基中，1000mL三角烧瓶装液量300mL，37°C，在转速120rpm的摇床上培养18h。
[0051]将培养好的摇瓶种子液按0.5%的接种量接入500L种子罐中，培养37°C，转速200rpm，罐压 0.05Mpa，厌氧培养 18h。
[0052]上述种子罐种子液，移种至有效容积为10立方米的发酵罐，发酵温度37°C，转速IOOrpm,罐压0.05Mpa发酵过程pH值下降，流加液氨，维持发酵液pH值在6.5至7.5。整个发酵过程不需要通入空气，维持厌氧状态。
[0053]发酵40h，发酵液PH值不再降低，液氨消耗速度为零，测残糖浓度小于0.04%,停止发酵，高效液相检测发酵液中L-丙氨酸浓度为7.52%。
[0054]上述发酵液通过孔径50纳米陶瓷膜超滤，除去菌体细胞等大分子物质，纯水透析洗涤过滤母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超滤清液中。
上述超滤清液通过800分子量纳滤膜过滤，脱去色素，进一步除去较大分子量杂质、磷酸盐、二价金属离子等。钠滤母液充分透析洗涤，得纳滤液总共约14.5立方。
[0055]利用单效真空蒸发器对上述纳滤液蒸馏浓缩结晶，浓缩液冷却到20°C以下充分结晶，抽滤离心母液3.2立方米。干燥晶体，得L-丙氨酸506kg，经检验产品含量达到99.5%，比旋光度14.5，质量符合GB 25543-2010。
[0056]实施例6:利用突变株Ζ?.0108在100立方米发酵罐中发酵生产L-丙氨酸。
[0057]1、培养基组分:
1.1斜面培养基的成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，七水硫酸镁0.02%,碳酸钙2%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，柠檬酸二胺0.2%，磷酸氢二钾0.2%，七水硫酸锰0.005%,琼脂2%，氢氧化钠调pH至7.0，121°C蒸汽灭菌20min。
[0058]1.2种子培养基的成分:蛋白胨0.8%，酵母膏0.5%，甘油0.5%，磷酸二氢钾0.2%，磷酸氢二钾1.2%，无水硫酸镁0.02%,氢氧化钠调pH至7.0，121°C蒸汽灭菌20min。
[0059]1.3发酵培养基的成分:葡萄糖12%，磷酸二氢钾0.2%，磷酸氢二钾1.2%，无水硫酸镁0.02%,氢氧化钠调pH至7.0，115 °C蒸汽灭菌20min。
[0060]2、操作步骤:将突变株Zife.0108分别移种到斜面培养基上，在37 °C下培养24h。将斜面上的菌株用无菌水制成菌悬液。
[0061]按0.5%的接种量接入摇瓶种子培养基中，1000mL三角烧瓶装液量300mL，37°C，在转速120rpm的摇床上培养18h。
[0062]将培养好的摇瓶种子液按0.5%的接种量接入500L种子罐中，培养37°C，转速200rpm，罐压 0.05Mpa，厌氧培养 18h。
[0063]将培养好的种子液移种至种至5000L种子罐中继续扩增培养，培养37°C，转速IOOrpm,罐压 0.05Mpa,厌氧培养 18h。
[0064]上述扩增培养的种子液，移种至有效容积为100立方米的发酵罐，发酵温度40°C，转速56rpm,罐压0.05Mpa,发酵过程pH值下降,流加液氨,维持发酵液pH值在6.5至7.5。整个发酵过程不需要通入空气，维持厌氧状态。
[0065]发酵52h，发酵液PH值不再降低，液氨消耗速度为零，测残糖浓度小于0.05%，停止发酵，高效液相检测发酵液中L-丙氨酸浓度为10.68%。
[0066]上述发酵液通过孔径50纳米陶瓷膜超滤，除去菌体细胞等大分子物质，纯水透析洗涤过滤母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超滤清液中。
上述超滤清液通过1000分子量纳滤膜过滤，脱去色素，进一步除去较大分子量杂质、磷酸盐、二价金属离子等。纳滤母液充分透析洗涤，得纳滤液总共约124.5立方。
[0067]利用三效真空蒸发器对上述纳滤液蒸馏浓缩结晶，浓缩液冷却到20°C以下充分结晶，抽滤离心母液12.2立方米。干燥晶体，得L-丙氨酸7476kg，经检验产品含量达到99.5%,比旋光度14.5，质 量符合GB 25543-2010。
【权利要求】
1.一种发酵生产L-丙氨酸的高产菌株Ζ?.0108菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为:CCTCC NO: M 2013361。
2.一种如权利要求1所述的高产菌株制备方法，其特征在于，所述的方法包括:以乳酸产生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种delbrueckii subsp.bulgaricus)为货发菌株，活化出发菌一低能离子注入法诱变处理细胞一可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的高产菌株。
3.根据权利要求2所述的高产菌株对制备方法，其特征在于，所述的活化出发菌，包括:将出发菌德氏乳杆菌保加利亚亚种在斜面培养基上42°C培养至对数生长期，用0.85 %的生理盐水制成菌悬液，ImL菌悬液含菌数约为107，镜检菌种健壮且无杂菌后，吸取0.1mL菌悬液均匀涂布于无菌空白培养皿上，无菌风吹干制成菌膜，镜检无细胞重叠后，进行下一步。
4.根据权利要求2所述的高产菌株对制备方法，其特征在于，所述的低能离子注入诱变法诱变处理细胞:真空条件下注入的离子为N离子，剂量为1.5X1014-5X1016 ions/cm2,能量为15-20keV，脉冲注入，每次注入5s，间隔时间15_40s，注入后用0.5_lmL无菌生理盐水洗下菌体细胞。
5.根据权利要求2所述的高产菌株对制备方法，其特征在于，所述的可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的突变株:挑选离子注入后的单菌落进行编号，并接种到对应编号的发酵培养基中发酵培养；将所得的发酵液除去菌体后高温灭菌，加入1.5%琼脂和0.01-0.05%抑制剂，灭菌后倒平板，并涂布指示菌，置于35-40 °C培养箱中进行培养；选取指示菌生长的平板所对应的编号的突变菌株进行连续传代培养，通过稳定性试验，最终得到I株编号为Lds.0108的L-丙氨酸高产菌株。
6.一种发酵生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的保藏号为:CCTCC NO: M 2013361的德氏乳杆菌突变株Lds.0108来生产发酵。
7.根据权利要求6所述的一种发酵生产L-丙氨酸的制备方法，具体步骤包括: (1)、扩增培养种子液:保藏号为:CCTCCNO: M 2013361的德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108来生产发酵通过斜面培养和种子罐扩培养，培养温度37°C，斜面培养时间24h，种子罐培养时间18h ； (2)、厌氧发酵生产L-丙氨酸:将扩增后的种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖浓度为6-12%，发酵温度为35-40°C，培养基pH值为6.5-7.5，维持厌氧环境，待残糖浓度小于·0.1%则发酵完成，发酵时间30-52h ； (3)、发酵液净化处理:先采用陶瓷超滤膜或有机管式超滤膜过滤，然后通过纳滤膜进一步过滤； (4)、制得成品:纳滤液经过真空浓缩蒸发去水分，结晶析出L-丙氨酸，经离心分离，干燥得成品。
【文档编号】C12N15/01GK103602609SQ201310399567
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】黄建坡, 苗位云, 孟凡会, 刘焕书, 朱传厚, 韩秀丽, 郭志远, 徐龙 申请人:淮北新旗氨基酸有限公司