专利名称：一种计算机图像识别细胞分离方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物细胞分离技术，具体涉及其一种基于细胞颜色对细胞进行分离的技术。
背景技术：
生物细胞分离在生物学以及医学上具有广泛的应用和重要价值，如临床血液分析疾病诊断、细菌分析、单细胞基因诊断、药物注射等。目前，已有的细胞分离方法有多种，常用的细胞分离技术以流式细胞仪为主，但是流式细胞仪设备昂贵、体积庞大、需要专人操作、细胞用量大，难以在实验室和医院得到广泛应用。还有根据细胞物理或化学特性产生的其它分离方法，如离心法，利用不同细胞的密度物理特性，采用离心技术，使细胞分层，从而达到分离的目的，由于细胞种类繁多，密度特性非常接近，离心技术很难把它们彻底分离，存在分辨能力差、分离不彻底等缺点。还有 使用细胞对激光散射原理分离细胞，这种分离方法需要采集微弱的散射光作为区分不同的细胞，所以，对检测环境、设备精度要求很高，以至于设备庞大、成本高、抗干扰能力差。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提出一种计算机图像识别细胞分离方法及系统，以期达到简化分离系统，具有自动化程度高、效率高、应用面广、洁净度高，细胞污染小、设备简单，成本低廉等优点。为了实现本发明目的，本发明的思路是应用细胞染色原理，对不同细胞添加不同的染色质后，由于细胞种类不同，使得染出来的细胞具有不同的颜色，如颜色A、颜色B，颜色C，颜色D等，这就可以利用计算机图像颜色识别技术，分离出不同种类细胞。本发明提出以下技术方案
一种计算机图像识别细胞分离方法，所述方法包括以下步骤
(1)针对细胞悬液中包含的不同种类细胞，用不同的染料对细胞进行染色；
(2)将染色的细胞悬液注入细胞分离芯片中，通过鞘流方法，使细胞流在芯片的细胞溶液通道中为单细胞流动，在细胞溶液通道上设置有多个分叉通道，每一个分叉位置设置有一对微电极，在细胞悬液流动过程中，用计算机图像自动识别装置在每一个分叉通道位置实时识别流经细胞的颜色；
(3)在通道分叉位置，当计算机识别到细胞颜色不是颜色A时，便发出指令，通过信号发生器给位于该分叉通道位置的微电极对施加脉冲电压信号，使不是颜色A的细胞在电泳力作用下发生偏转，沿着分叉通道向前流动；而当计算机识别出细胞是颜色A时，计算机不发出指令，细胞沿此处的直行通道向前流动，从而分离出颜色A的细胞；
(4)按步骤(2)的过程，当细胞溶液到达下一分叉通道位置时，计算机又进行识别，当识别出细胞颜色不是颜色B时，则发出指令，对该位置的微电极对施加脉冲电压，使不是颜色B的细胞在电泳力作用下发生偏转，沿这一位置的分叉通道流出；而当计算机识别出细胞是颜色B时，计算机不发出指令，细胞沿此处的直行通道向前流动，从而分离出颜色B的细胞；
(5)以此类推，分别分离出第三种、第四种以及更多种颜色的细胞，直至将待分离细胞悬液中需要分离的不同颜色的细胞分离完全为止。本发明进一步提出了实现上述方法的计算机图像识别细胞分离系统，该系统包括计算机图像识别系统和细胞分离芯片，细胞分离芯片的细胞溶液通道上设置多条分叉通道，在每一个分叉通道的分叉位置设置微电极；所述计算机图像识别系统的图像采集装置对准细胞分离芯片，用于采集细胞图像，计算机图像识别系统内的分析软件用于识别制定区域内细胞的颜色，所述计算机图像识别系统控制细胞分离芯片的信号发生器，信号发生器与细胞分离芯片上的微电极进行电信号连接，根据计算机的指令给微电极施加电信号。本发明提出的以上方法和系统具有以下明显的优点
(1)自动化程度高。由于是计算机自动识别，自动控制细胞分离，无需人工干预，能从细胞注入到自动分离过程全自动化；
(2)效率高。计算机高速识别与控制，能够快速识别和分离不同种类细胞，有利于保持细胞活性；另一方面，随着芯片分离通道数量的增加，可以同时对多种不同的细胞进行一次性分离，大大提高混有多种细胞的一次性分离效率；
(3 )应用面广。所有细胞均能实现染色和电泳，所以，凡是不同种类细胞混杂在一起均可以采用该发明技术予以分离；
(4)洁净度高，细胞污染小。由于采用微芯片系统，细胞在封闭的狭小空间受微电极周围电场控制，芯片消毒方便，工作环境洁净度高，细胞受到污染小；
(5)设备简单，成本低廉。系统组成简单，分离芯片、信号发生器等设备造价低廉，制造技术要求不高。
图I是实现本发明的系统原理 图2是细胞分离芯片的局部示意图。
具体实施例方式以下结合附图进一步说明本发明
本方法是应用生物学上细胞染色原理，对不同细胞添加不同的染料后，由于细胞种类不同，使得染出来的细胞具有不同的颜色，利用计算机图像颜色识别技术，达到分离不同种类细胞的目的。参见图1，计算机图像识别细胞分离系统包括计算机图像识别系统和细胞分离芯片2。如图2所示，细胞分离芯片利用鞘流方法，使细胞在芯片的细胞溶液通道内为单 细胞流动，并采用在细胞溶液通道上顺序设置多条分叉通道的形式，在每一个分叉通道的分叉位置的通道两侧设置微电极A1-K1、A2-K2。计算机图像识别系统的图像采集装置1(包括显微镜和CCD摄像头)对准细胞分离芯片2，用于采集细胞图像，计算机4内的图像识别分析软件用于根据图像分析出细胞的颜色，计算机图像识别系统的计算机4与细胞分离芯片的信号发生器3连接，信号发生器3与细胞分离芯片2上的介电电泳电极Al-Kl、A2-K2进行电信号连接，根据计算机4的指令给电极施加电信号。细胞分离的方法如下
I、细胞染色
以分离人外周血淋巴细胞为例。我们知道，在人外周血中，主要存在有诸如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞等各类淋巴细胞。这些细胞的分类主要由它们的表面抗原决定的，如成熟T细胞表达⑶3抗原，B细胞则是⑶19阳性细胞，剩余部分多数为NK细胞(外周血中一般认为⑶3-/⑶56+细胞为NK细胞，所以如果需要鉴定分离真正的NK细胞，还需要鉴定CD56抗原)。(I)初级分选。把准备好的FITCX激发光488nm，发射光525nm，绿光)标记的⑶3抗体(⑶3-FITC， 绿色)和PE (激发光488nm，发射光575nm，橙色光)标记的⑶19 (⑶19-PE，橙色)抗体与外周血混合后，根据细胞表面自身抗原的特异性，这些抗原就会识别并结合相应的抗体，从而间接的给细胞进行标记染色，如B细胞结合CD19-PE，显橙色。把细胞悬液匀速流经细胞分离芯片。当成熟T细胞(此时已携带绿光)经过信号发生器时，就会直接进入绿色通道。而携带红光标记的B细胞经过时，就会发生偏转，进入另外一个通道。同理，当B细胞进入另外通道的下一个信号检测器时，就会被正确识别。最后，不经标记的细胞就是以NK细胞为主的群体。(2)次级分选。以分选T细胞亚群为例。因为成熟T细胞只能表达⑶4或⑶8分子，所以在⑶3+的成熟T细胞中又可按照⑶4、⑶8抗原差异分为辅助性T细胞(Th)和杀伤性T细胞(Ts)两个亚型。以PE-Cy5(激发光488nm，发射光670nm，呈红光)标记的CD4抗体(记为CD4_PE_Cy5，红色)。同理，PE标记的⑶8抗体记为⑶8-PE(橙色)。注意，因为此时再分选的⑶3+细胞已带FITC标记的绿色荧光，不能再用FITC标记的抗体进行标记。根据细胞表面自身抗原的特异性，这些抗原就会识别并结合相应的抗体，从而间接的给细胞进行标记染色。当这些不同荧光标记的抗体加入到上述分离好的CD3+细胞悬液后，混匀，流经细胞分离芯片。在⑶3+细胞中，再根据⑶4和⑶8的表达差异分选Th细胞(⑶3+/⑶4+，此时细胞呈红绿色)和Ts细胞(CD3+/CD8+，黄绿色)；当细胞经过信号检测器时，就会识别红色与橙色，进行筛选。同理，在⑶3-细胞中，又可以根据⑶16和⑶56的差异进一步分选。⑶16表达于大多NK细胞上，但也表达于中性粒细胞上。这种抗原在NK细胞的表达比较弱并在NK细胞活化时丢失。⑶56表达于大多数的(但并不是全部)NK细胞上，也表达于一些T淋巴细胞上。与⑶3联合使用，可以区分⑶3+/⑶56+ T淋巴细胞和⑶3-/⑶56+NK细胞。联合使用三种单抗能最完全的鉴定所有的NK细胞。NK细胞或表达⑶16，或表达⑶56，但它们不表达CD30CD16和CD56联合使用，根据荧光强度可将NK细胞从双阴性细胞中区分出来。这样运用该组试剂，NK细胞可形成独立的群体与其他细胞相区分。2、将细胞悬液注入细胞分离芯片中，细胞悬液从第I区域处流入，当细胞悬液要进入到第II区域时(即图中虚线内所示的图像识别区域)，即将要进入到第一个分叉通道位置时，计算机的图像采集装置I采集细胞图像，由图像识别分析软件根据图像分析出细胞的颜色，当识别出细胞为非绿色时，计算机发出指令，使信号发生器给Al-Kl这对电极施加脉冲电压信号，细胞在电泳力作用下发生偏转，沿着第一个分叉通道CH2向前流动；当计算机识别出进入此处的细胞是绿色时，计算机不发出指令，信号发生器不给Al-Kl施加电压信号，绿色细胞通过第一个直行通道CHl沿直线方向向前流动，从而分离出绿色细胞。3、同上述原理，当细胞溶液进入第III区域时(即图中虚线内所示的第二个图像识别区域)，计算机识别出细胞颜色非红色时，则发出指令给信号发生器，对A2-K2施加脉冲电压，使非红色细胞在电泳力作用下发生偏转，沿下一个分叉通道CH3流出。否则，计算机不发出指令，红色细胞通过第二个直行通道CH4沿直线方向向前流出，即分离出红色细胞。
以此类推，可以实现不同颜色的细胞分离。本发明的细胞分离芯片的结构包括PDMS通道层和底部电极层。PDMS通道层可以采用微加工技术制作而成，PDMS通道层和底部电极层采用显微配准方式进行配准键合，PDMS通道层在配准前可进行等离子表面处理，以提高PDMS通道层和底部电极层的键合牢固度。
芯片的PDMS通道层的具体加工工艺流程可采用如下形式
A.选取硅片或玻璃片为基底；
B.悬涂SU-8光刻胶于基底表面；
C.经前烘、光刻、后烘、显影、硬烘形成通道所需的阳模；
D.将所得阳模固定于一培养皿上；
E.倒入混合好的PDMS混合胶，静止后抽真空；
F.置于加热台上75°C固化；
G.揭下固化后PDMS，根据底层结构形状剪裁，并去除进样口、出样口的胶即可。细胞分离芯片的底部电极层采用腐蚀等方式制作，具体加工工艺流程如下
A.选取表面氧化硅片或石英玻璃片为基底；
B.溅射金或钼在基底表面形成导电层，为提高金钼与基底的粘附性，可先溅射铬或钛在基底层表面；
C.悬涂AZ4620等光刻胶于导电层表面；
D.光刻显影获得微电极相同的图形；
E.采用湿法腐蚀方法去除光刻胶图像之外的导电层；
F.利用丙酮去除光刻胶，获得微电极结构。
权利要求
1.一种计算机图像识别细胞分离方法，其是应用细胞染色原理，针对不同待分离目标细胞选取添加不同的染料，由于细胞种类不同，使得染出来的细胞呈现不同的颜色，利用计算机图像颜色识别技术，辨别不同颜色的细胞，并结合电泳分离技术达到分离不同种类细胞的目的；所述方法包括以下步骤 (1)针对细胞悬液中包含的不同种类细胞，用不同的染料对细胞进行染色； (2)将染色的细胞悬液一起注入细胞分离芯片中，通过鞘流方法，使细胞流在芯片的细胞溶液通道中形成单细胞流动；细胞溶液通道上设置有多个分叉通道，每一个分叉位置设置有一对微电极，在细胞悬液流动过程中，用计算机图像自动识别装置在每一个分叉通道位置前实时识别流经细胞的颜色； (3)在通道分叉位置，当计算机识别到流经该位置的细胞不是颜色A时，便发出指令，通过信号发生器给位于该分叉通道位置的微电极对施加脉冲电压信号，使不是颜色A的细胞在电泳力作用下发生偏转，沿着分叉通道向前流动；而当计算机识别出细胞是颜色A时， 计算机不发出指令，细胞沿此处的直行通道向前流动，从而分离出颜色A的细胞； (4)按步骤(2)的过程，当细胞溶液到达下一分叉通道位置前，计算机又进行识别，当识别出细胞颜色不是颜色B时，则发出指令，对该位置的微电极对施加脉冲电压，使不是颜色B的细胞在电泳力作用下发生偏转，沿这一位置的分叉通道流出；而当计算机识别出细胞是颜色B时，计算机不发出指令，细胞沿此处的直行通道向前流动，从而分离出颜色B的细胞； (5)以此类推，分别分离出第三种、第四种以及更多种颜色的细胞，直至将待分离细胞悬液中需要分离的不同颜色的细胞分离完全为止。
2.一种实现权利要求I所述方法的计算机图像识别细胞分离系统，其包括计算机图像识别系统和细胞分离芯片，其特征在于所述细胞分离芯片中有细胞溶液通道，在细胞溶液通道上设置多条分叉通道，在每一个分叉通道的分叉位置对应设置微电极；所述计算机图像识别系统的图像采集装置对准细胞分离芯片，用于采集细胞图像，计算机图像识别系统内的分析软件用于根据图像分析出细胞的颜色，所述计算机图像识别系统连接并控制细胞分离芯片的信号发生器，信号发生器与细胞分离芯片上的微电极进行电信号连接，根据计算机的指令给电极施加电信号，实现待分离细胞的偏转操作。
3.根据权利要求2所述的计算机图像识别细胞分离系统，其特征在于所述微电极设 置在分叉位置的通道两侧。
全文摘要
一种计算机图像识别细胞分离方法及系统，其是应用细胞染色原理，针对不同待分离目标细胞选取添加不同的染料，由于细胞种类不同，使得染出来的细胞呈现不同的颜色，利用计算机图像颜色识别技术，辨别不同颜色的细胞，并结合电泳分离技术，达到分离不同种类细胞的目的。本发明具有具有自动化程度高、效率高、应用面广、洁净度高，细胞污染小、设备简单，成本低廉等优点。
文档编号C12M1/00GK102703373SQ20121021233
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者曹毅, 杨军, 胡宁, 蒋丽华, 郑小林 申请人:重庆城市管理职业学院