专利名称：一种采用混合培养微生物利用甘油发酵生产乙醇的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及ー种采用混合培养微生物利用甘油发酵生产こ醇的方法。
背景技术：
目前石化能源日益枯竭，人们致カ于开发各种新能源，其中生物能源备受人们青睐，其中，こ醇和生物柴油是其中两种较为突出的生物能源。こ醇的发酵生产一般是利用淀粉质原料，需消耗大量的谷物，与民争食；此外，こ醇发酵还可以以农作物秸杆为原料，虽然原料很充足，但是纤维素酶水解效率低，导致生产成本过高。生物柴油是目前备受重视的可再生生物能源产品，主要是通过酯交换法进行生产，生产过程中有大量粗甘油废液产生，如何利用这些甘油废液，是这ー产业面临的新问题。由甘油代谢途径可知，甘油可转化为1，3-丙ニ醇、丁醇、こ醇、有机酸等。目前国内外有大量研究利用甘油为原料发酵生产1，3-丙ニ醇、丁醇、こ醇等，利用甘油发酵生产こ醇，已有的研究多为连续发酵，こ醇产量较低。以甘油为原料进行发酵，甘油虽可作为培养基中的碳源，但高浓度的甘油对微生物的生长十分不利，要提高こ醇的产量，这个问题必须解决。本专利以浸麻芽孢杆菌和红曲菌为出发菌株，以甘油为原始材料，对影响こ醇产量的甘油初始浓度、补料中甘油浓度、补料时间间隔、发酵时间、装液量进行了研究。
发明内容
本发明提供了一种采用浸麻芽孢杆菌和红曲菌利用甘油混合发酵生产こ醇的方法，本专利以浸麻芽孢杆菌和红曲菌为出发菌株，以甘油为原始材料，对影响こ醇产量的甘油初始浓度、补料中甘油浓度、补料时间间隔、发酵时间、装液量进行了研究。I. 一种采用混合培养微生物利用甘油发酵生产こ醇的方法，其特征在于往I L三角瓶中装入一定量的发酵培养基，将红曲种子液接入培养基中，接种量5%，320C、180 rpm/min震荡培养48 h ;按10%接种量将浸麻芽孢杆菌接入红曲发酵液中，41 °C静止培养；每隔一定时间补入100 mL含有一定浓度的甘油的新鲜红曲发酵液,发酵一定时间。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵培养基(g/L):—定量的甘油，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸镁I. 5，磷酸氢ニ钾5，磷酸ニ氢钾5，硫酸铵1，pH4. 5。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于最佳甘油初始浓度为20 g/L。4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于最佳装液量500 mL/Ι L三角瓶。5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于红曲种子液的制作方法为用无菌水从活化好的斜面上刮洗制成孢子菌悬液，按5%接种量接入红曲种子培养基中，32°C、180rpm/min震荡培养48 h。6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在干，红曲种子培养基(g/L):甘油50，蛋白胨5，酵母粉5，氯化钠2. 5，硫酸镁I. 5，磷酸氢ニ钾5，磷酸ニ氢钾2，硫酸锌2，pH4. 5。7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于浸麻芽孢杆菌种子液的制作方法为用无菌水从活化好的斜面上刮洗制成孢子菌悬液，按10%接种量接入浸麻芽孢杆菌种子培养基中，41 °C静置培养36 ho8.根据权利要求7所述的方法，其特征在干，浸麻芽孢杆菌种子培养基(g/L):甘油8，葡萄糖12，蛋白胨5，酵母粉5，pH9. O。9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于最佳补料时间间隔为60 h。10.根据权利要求I所述的方法，补料中甘油最佳浓度为20 g/L。11.根据权利要求I所述的方法，最佳发酵时长为360 h。
图I甘油初始浓度对こ醇产量的影响。
图2补料中甘油浓度对こ醇产量的影响。图3补料时间间隔对こ醇产量的影响。图4不同装液量对こ醇产量的影响。图5发酵时间对こ醇产量的影响。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。实施例I
本实施案例说明不同甘油初始浓度对こ醇产量的影响，在I L三角瓶中装入400 mL培养基，培养基为蛋白胨2，酵母粉2，硫酸镁I. 5，磷酸氢ニ钾5，磷酸ニ氢钾5，硫酸铵1，PH4. 5，甘油浓度分别为20 g/L,40 g/L、60 g/L、80 g/L。将制作好的红曲种子液接入发酵培养基中，接种量为5%，32°C、180 rpm/min震荡培养48 h ;按10%接种量将制作好的浸麻芽孢杆菌接入红曲发酵液中，41 °C静止培养；每隔60 h补入100 mL含有20 g/L甘油的新鲜红曲发酵液，发酵300 h。发酵结束后，利用气象色谱检测发酵液中的こ醇浓度。得到结果如图I所示。有图I可以看出，不同的甘油浓度导致发酵过程中こ醇的产量有较大差异，发酵液中甘油的初始浓度越大，こ醇的产量越低，当甘油浓度为20 g/L吋，こ醇产量最大，最大值为11. 5 g/L，故确定最佳甘油初始浓度为20 g/L。实施例2
本实施案例说明补料中不同甘油浓度对こ醇产量的影响，在I L三角瓶中装入400 mL培养基，培养基为甘油20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸镁I. 5，磷酸氢ニ钾5，磷酸ニ氢钾5，硫酸铵1，ρΗ4. 5。将制作好的红曲种子液接入发酵培养基中，接种量为5%，32°C、180 rpm/min震荡培养48 h ;按10%接种量将制作好的浸麻芽孢杆菌接入红曲发酵液中，41 °C静止培养；每隔60 h补入100 mL含有20 g/L,40 g/L、60 g/L、80 g/L甘油的新鲜红曲发酵液，发酵300 h。发酵结束后，利用气象色谱检测发酵液中的こ醇浓度。得到结果如图2所示。有图2可以看出，补料中不同的甘油浓度导致发酵过程中こ醇的产量有较大差异，补料中甘油的初始浓度越大，こ醇的产量越低，当甘油浓度为20 g/L时，こ醇产量最大，最大值为12. I g/L,故确定最佳甘油初始浓度为20 g/L。实施例3本实施案例说明补料中不同补料时间间隔对こ醇产量的影响，在I L三角瓶中装入400mL培养基，培养基为甘油20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸镁I. 5，磷酸氢ニ钾5，磷酸ニ氢钾5，硫酸铵1，PH4. 5。将制作好的红曲种子液接入发酵培养基中，接种量为5%，32°C、180 rpm/min震荡培养48 h ;按10%接种量将制作好的浸麻芽孢杆菌接入红曲发酵液中，41°C静止培养；每隔一定时间补入100 mL含有20 g/L甘油的新鲜红曲发酵液，时间间隔分别为30 h、40 h、50 h、60 h、70 h，发酵300 h。发酵结束后，利用气象色谱检测发酵液中的こ醇浓度。得到结果如图3所示。由图3可知，补料时间间隔短，导致发酵液中甘油浓度较大，高浓度的甘油可抑制微生物的生长，导致こ醇产量较低；当补料时间间隔为60 h吋，こ醇产量最大；当补料间隔过长时，发酵液中甘油浓度较小，影响こ醇产量。所以确定最佳补料时间间隔为60 h。实施例4
本实施案例说明不同装液量对こ醇产量的影响，在I L三角瓶中装入300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700mL培养基，培养基为甘油20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸镁I. 5，磷酸氢ニ 钾5，磷酸ニ氢钾5，硫酸铵1，ρΗ4. 5。将制作好的红曲种子液接入发酵培养基中，接种量为5%, 320C ,180 rpm/min震荡培养48 h ;按10%接种量将制作好的浸麻芽孢杆菌接入红曲发酵液中，41°C静止培养；每隔60 h补入100 mL含有20 g/L甘油的新鲜红曲发酵液，发酵300 h。发酵结束后，利用气象色谱检测发酵液中的こ醇浓度。得到结果如图4所示。由图4可知，不同装液量导致发酵液中溶氧不同，导致微生物生长及こ醇产量不同。当装液量为500 mL吋，こ醇产量最大，所以确定最佳装液量为500 mL。实施例5
本实施案例说明不同发酵时间对こ醇产量的影响，在I L三角瓶中装入500 mL培养基，培养基为甘油20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸镁I. 5，磷酸氢ニ钾5，磷酸ニ氢钾5，硫酸铵1，ρΗ4. 5。将制作好的红曲种子液接入发酵培养基中，接种量为5%，32°C、180 rpm/min震荡培养48 h ;按10%接种量将制作好的浸麻芽孢杆菌接入红曲发酵液中，41°C静止培养；每隔60 h补入100 mL含有20 g/L甘油的新鮮红曲发酵液进行分批发酵，分别利用气象色谱检测发酵180 h、240 h、300 h、360 h、420 h时发酵液中的こ醇浓度，得到结果如图5所示。由图5可知，随着发酵的进行，こ醇产量逐渐增加，但360 h后こ醇产量变化不大，故选择发酵360 h为最佳发酵时间。
权利要求
1.一种采用混合培养微生物利用甘油发酵生产乙醇的方法，其特征在于往I L三角瓶中装入一定量的发酵培养基，将红曲种子液接入培养基中，接种量5%，320C、180 rpm/min震荡培养48 h ;按10%接种量将浸麻芽孢杆菌接入红曲发酵液中，41°C静止培养；每隔一定时间补入100 mL含有一定浓度的甘油的新鲜红曲发酵液，发酵一定时间。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵培养基一定量的甘油，蛋白胨2g/L，酵母粉2 §/1，硫酸镁1.5 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸铵I g/L，pH4. 5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于甘油初始浓度为20g/L。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于装液量500mL/1 L三角瓶。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于红曲种子液的制作方法为用无菌水从活化好的斜面上刮洗制成孢子菌悬液，按5%接种量接入红曲种子培养基中，32°C、180 rpm/min震荡培养48 h。
6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于，红曲种子培养基甘油50g/L，蛋白胨5 g/L,酵母粉5 g/L,氯化钠2. 5 g/L,硫酸镁I. 5 g/L,磷酸氢二钾5 g/L,磷酸二氢钾2 g/L，硫酸锌 2 g/L，pH4.5。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于浸麻芽孢杆菌种子液的制作方法为用无菌水从活化好的斜面上刮洗制成孢子菌悬液，按10%接种量接入浸麻芽孢杆菌种子培养基中，41 °C静置培养36 h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，浸麻芽孢杆菌种子培养基甘油8g/L，葡萄糖12 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，pH9.0。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于补料时间间隔为60h。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于补料中甘油浓度为20g/L。
全文摘要
本发明提供了一种采用浸麻芽孢杆菌和红曲菌利用甘油混合发酵生产乙醇的方法，本发明以浸麻芽孢杆菌和红曲菌为出发菌株，以甘油为原始材料，对影响乙醇产量的甘油初始浓度、补料中甘油浓度、补料时间间隔、发酵时间、装液量进行了研究。
文档编号C12R1/645GK102703563SQ20121021224
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者周雪琴 申请人:太仓市周氏化学品有限公司