可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明是关于一种可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物及其制备方法与 应用，尤其关于该微生物在生产例如有机酸与醇的有机化合物的应用。该微生物的一具体 态样为酪下酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum)菌株口RI02001，其寄存于德国国家菌 种保藏中屯、值SMZ)，寄存编号为DSM32077。
【背景技术】
[0002] 自20世纪初W来，工业上便广泛使用细菌、酵母菌、霉菌等微生物W进行发酵反 应，将生质原料转化为较具经济效益的有机化合物，例如有机酸W及醇类。其中，在生成有 机化合物的微生物发酵方法中，W丙酬-下醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，AB巧发 酵程序最广为使用。于A邸发酵路径中，通过微生物，可W将含有醋类的原料（玉米、馨类、 糖蜜等）转化为丙酬酸（pyruvate)，再进一步将丙酬酸转化为乙酷-辅酶A(acet^-CoA)， W生成例如下酸、下醇或乙醇等较具经济效益的有机化合物。
[0003] 然而，上述将丙酬酸转化为乙酷-辅酶A的过程会伴随着例如二氧化碳的碳氧化 物的释放，造成从原料到产物之间不必要的碳源损失（carbonloss)。已知，若利用自然界 的野生型菌株进行ABE发酵程序，将原料转化为产物的碳转化率最高仅约67 %，导致有机 化合物的产率不佳，造成不必要的成本及资源浪费。因此，如何提高从原料到产物的碳转 化率，乃本领域亟待解决的一大课题。一解决此一课题的手段为，进一步选育及改良用于 发酵反应的微生物菌种，W突破微生物遗传特性的限制，进一步重建代谢途径、抑制代谢叉 路、或增强主要产物合成方向的代谢通量，从而提高从原料到产物之间的碳转化率。
[0004] 本发明即是针对前述需求所为的研发成果，本案发明人经戮力研究而完成一种可 用W制备可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物的方法，由此方法所提供的微生物， 除可进行发酵反应W生成有机化合物，更可固定发酵反应中所释放的碳氧化物，将其重新 纳入发酵反应的步骤中，从而更有效利用碳源、减少不必要的碳源损失，甚至可达到接近零 碳损失的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的一目的，在于提供一种制备可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物 的方法，其包含：
[0006] (a)提供一第一亲代菌株，其具有固定碳氧化物的能力；
[0007] 化）提供一第二亲代菌株，其具有进行发酵反应的能力；
[0008] (C)将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体（protoplast) 及第二原生质体；
[0009] (d)使该第一原生质体及第二原生质体进行融合，W提供一融合菌株；W及
[0010] (e)培养该融合菌株并进行筛选，W获得一标的菌株（targetstrain)。
[0011] 本发明的另一目的，在于提供一种W上述方法所获得的标的菌株。
[0012] 本发明的又一目的，在于提供一种使用上述标的菌株于生成有机化合物的方法， 其包含于一厌氧氛围下，将该标的菌株与一含醋基质混合，W进行发酵反应。较佳地，该方 法更包含于发酵反应中使用一共基质（co-substrate)。
[0013] 本发明的再一目的，在于提供一种酪下酸梭菌（Clostridiumtyrobutyri州m)菌 株口RI02001，其寄存于德国国家菌种保藏中屯、值SMZ)，寄存编号为DSM32077。
[0014] 本发明的再一目的，在于提供一种制备上述的酪下酸梭菌菌株ITRI02001的方 法，其包含：
[0015] (a)提供一第一亲代菌株，其为将达梭菌（Clostridiumljungd址lii)且具有固 定碳氧化物的能力；
[0016] 化）提供一第二亲代菌株，其为酪下酸梭菌（Clostridiumtyrobutyri州m)且具 有进行发酵反应的能力；
[0017] (C)将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体及第二原生质 体；
[0018] (d)使该第一原生质体与第二原生质体进行融合，W提供一融合菌株；W及
[0019] (e)培养该融合菌株并进行筛选，W获得酪下酸梭菌菌株ITRI02001，其寄存于德 国国家菌种保藏中屯、值SMZ)，寄存编号为DSM32077。
[0020] 本发明的又再一目的，在于提供一种使用上述的酪下酸梭菌菌株ITRI02001于 生成有机化合物的方法，其包含于一厌氧氛围下，将该酪下酸梭菌菌株ITRI02001与一含 醋基质混合，W进行发酵反应。较佳地，该方法更包含于发酵反应中使用一共基质。
[0021] 本发明的详细技术内容及部分具体实施态样，将描述于W下内容中，W供本发明 所属领域具通常知识者据W明了本发明之特征。
【附图说明】
[002引图1所示为将酪下酸梭菌菌株BCRC14535W及一根据本发明的微生物，分别培养 于CGM培养基、mPETC培养基、及mRCM培养基Ξ种不同培养基的产气情形；
[0023] 图2A显示，于一厌氧氛围下，将酪下酸梭菌菌株BCRC14535与本发明的酪下酸梭 菌菌株ITRI02001，培养于mRCM培养基（含10公克/升之葡萄糖）中，并于不同时间点所 测得的ODe。。数值的曲线图；
[0024] 图2B显示，于一厌氧氛围下，将酪下酸梭菌菌株BCRC14535与本发明的酪下酸梭 菌菌株ITRI02001，培养于mRCM培养基（含10公克/升之葡萄糖）中W进行发酵反应，并 测量不同时间点所生成的下酸产量的曲线图；W及
[00巧]图3显示本发明的酪下酸梭菌菌株ITRI02001于不同的酸性环境（P册.0、p册.5、P册.0)下培养的乙酸代谢率的直条图。
【具体实施方式】
[0026] W下将描述根据本发明的部分具体实施态样；但是，在不背离本发明精神下，本发 明尚可W多种不同形式的态样来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述 者。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中（尤其是在后述专利申请范围中）所使用 的"一"、"该"及类似用语应理解为包含单数及复数形式。另，本文所使用的"约"、"大约" 或"近乎"等词，实质上代表与所述的数值相差在20%W内者，较佳在10%W内者，且更佳 在5%W内者。此外，于本发明中，所谓的"微生物"是指肉眼无法看见的生物体（例如：细 菌、真菌），其可包括于自然界中自然存在的野生型（wil化ype)，W及因任何因素（天然或 人为）所产生的突变型（mutant)。所谓"碳氧化物"是指一氧化碳、二氧化碳、或其组合。 另，除非明确限定，否则于本说明书中所述的醋类与有机化合物，包含其所有异构物型式， 包括，但不限于镜像异构物（enantiomer)、非镜像异构物（diastereomer)及构形异构物 (conformationalisomer)。
[0027] 于本说明书中，所谓"碳转化率"是指在发酵反应中，所生成的有机化合物的总碳 数与所消耗碳源的总碳数的比值，W如下式1进行计算。
[0028]式1
[0029] 本发明是提供一种制备可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物的方法，其包 含：
[0030] (a)提供一第一亲代菌株，其具有固定碳氧化物的能力；
[0031] 化）提供一第二亲代菌株，其具有进行发酵反应的能力；
[0032] (C)将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体及第二原生质 体；
[0033] (d)使该第一原生质体及第二原生质体进行融合，W提供一融合菌株；W及
[0034] (e)培养该融合菌株并进行筛选，W获得一标的菌株。
[0035]根据本发明方法，作为步骤（a)的第一亲代菌株可W是任何具有固定碳氧化物能 力的微生物。所谓"固定碳氧化物"是指借助生物化学反应将碳氧化物转化为有机化合物 的过程，举例言之，已知自然界中有许多微生物可利用Wood-Uungd址l(WL)路径来固定其 生存环境中的碳氧化物，并将碳氧化物转化成乙酷-辅酶A。
[003引可利用WoodLjungdahl肥)路径W固定碳氧化物的菌株包捉但不限于，将达梭菌 的ostridi皿lju唯础。i)、自产乙酉對《菌的ostridi皿autoethanogenuni)、食氧化碳梭菌的ostridi皿 carboxidivorans)、困难梭菌（Clos仕idi皿difficile)、醋酸梭菌（Clos仕idi皿aceticuni)、热乙酸莫 尔氏菌dfcarellatheramcetica，原为热乙酸梭菌（Clostridi皿theramceticmi))、嗜热自营甲烧杆 菌（|16化孤013301611皿化61111081111)仕0口]11〇1]1)、自营脱硫杆菌（〇0細版133〇1611皿81111)仕〇口]11〇1]1)、斯蒂 克兰德氏梭菌的ostridi皿sticklandii)、嗜热自营梭菌的ostridi皿therarautotropMcuiii)、蚁酸酉昔 酉刻刻菌的ostridi皿formicoaceticuni)、大梭菌的ostridi皿皿gnmi)、甲醇酉昔酸杆菌（Acetobacterium carbinolic如、凯伍醋酸杆菌(Acetobacteri皿kivui)、伍氏醋酸杆菌（Acetobacteriumwoodii)、瘤胃 聚乙酸菌（Acetitomcul皿ruminis)、潮湿厌氧醋菌（Acetoanaerobiumnoterae)、W及拜氏醋酸杆菌 (Acetobacteriumbakii) 〇
[0037] 可于本发明方法的步骤（a)中使用前述可利用Woo化jungd址1 (WL)路径W固定碳 氧化物的菌株W作为第一亲代菌株。于本发明一具体实施态样中，于步骤（a)中使用将达 梭菌（Clostridiumljungd址lii)作为第一亲代菌株。
[0038] 根据本发明方法，作为步骤化）的第二亲代菌株可W是任何具有进行发酵反应 能力的微生物。所谓"发酵反应"是指微生物代谢一或多种物质w产生有机化合物的过 程。举例言之，适用为本发明方法步骤化）的第二亲代菌株的例子包括，但不限于，梭菌属 (Clostridiumsp.)菌株、安爱罗斯代普布替雷熙克菌（Anaerostipesbutyraticus)、粪厌 氧棒状菌（Anaerostipescaccae)、安爱罗斯代普菌属（Anaerostipessp·)、穗状下酸弧菌 化utyriviLbriocrossotus)、溶纤维下酸弧菌化utyriviLbriofibrisolvens)、亨氏下酸弧 菌化utyriviLbriohungatei)、瘤胃溶纤维下酸弧菌化utyriviLbrioproteoclasticus)、 梭菌属（Clostridialessp.)、粪球菌ART55/1(CoprococcusART55/1)、夷巧粪球菌 (Coprococcuscatus)、陪伴粪球菌（Coprococcuscomes)、一至文粪球菌（Coprococcus eutac化s)、两形真杆菌巧ubacteriumbiforme)、溶纤维真杆菌巧ubacterium cellulosolvens)、细长真杆菌(Eubacteriumdolichum)、庞大真杆菌(Eubacterium hadrum)、霍氏真杆菌巧ubacteriumhallii)、L2-7 真杆菌巧ubacteriumL2-7)、粘 液真杆菌巧ubacteriumlimosum)、氧化还原真杆菌巧ubacteriumoxidoreducens)、 细枝真杆菌巧ubacteriumramulus)、直肠真杆菌巧ubacteriumrectale)、口臭真 杆菌巧ubacteriumsaburreum)、A2-194 真杆菌巧ubacteriumA2-194)、凸腹真杆 菌(Eubacteriumventriosum)、毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)、毛螺科菌 属（Xachnospiraceaesp·)、莫亚控产日引噪菌（Moiyellaindoligenes)、少食八迭球菌 (Parasporobacteriumpaucivorans)、瘤胃{段了酉堇弧菌(Pseudobutyrivibrioruminis)、 伪下酸撒控尼罗控菌巧seudobutyriviLbriox^danivorans)、盲肠罗斯氏菌（Roseburia cecicola)、粪便罗斯拜瑞氏菌（Roseburiafaecis)、罗斯拜瑞氏菌（Roseburia hominis)、罗斯氏肠菌（Roseburiaintestinalis)、罗斯氏尹琳妮佛伦菌（Roseburia inulinivorans)、抱子细菌树紫苑菌（Sporobacteriumolearium)、安黑罗克斯阿克踏利斯 菌（AnerococcusOctavius)、不解糖嗜膝菌巧eptoniphilusasaccharolyticus)、蛋白膝 菌巧eptoniphilus)、杜尔丹尼菌（duerdenii)、蛋白膝哈雷菌巧eptoniphilusharei)、 蛋白膝泪菌巧eptoniphiluslacrimalis)、日引噪嗜膝菌巧eptoniphilusindolicus)、弗 消化链球菌艾弗嗜膝菌巧eptoniphilusivorii)、嗜膝菌属巧eptoniphilussp·)、赛 德口特己克特海卓斯班卓依克菌（Sedimentibacterhydroxybenzoicus)、优杆欧都例牡 藤菌（Anaerovoraxodorimutans)、产线銀沟菌（Filifa