一种磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法及在食用油脂加工中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种脂肪酶催化剂，尤其是设及一种磁性径基憐灰石固定化脂肪酶的 制备方法，本发明还设及所制备的固定化脂肪酶在食用油脂加工中的应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶作为催化剂，因具有高效性、专一性、反应条件溫和、环境友好等特点而被 广泛应用于医药、食品、香料、油脂、化妆品和农药等行业。然而，游离脂肪酶操作稳定性差、 易失活、不易重复使用、难W实现生产过程连续化和自动化，而且反应后混入产品中，难W 分离。所W，虽然游离脂肪酶催化技术比较成熟，但真正的产业化应用还是受到了很大的 限制。
[0003] 为了克服游离脂肪酶的缺陷，近十几年来有不少关于生物酶改良方法的报道，其 中"酶的固定化"受到越来越多的关注。将游离酶W各种方法固定在适合的载体上，提高 了酶的稳定性，简化了催化剂分离工艺，可W制备出能适应更多反应体系更广反应条件的 非均相生物催化剂。同时，运也为脂肪酶酶类催化剂的重复利用提供了可能，进一步满足 了工业生产的需要。载体的选择是固定化酶制备过程中的关键，目前用于负载脂肪酶的 载体有很多种，包含有无机化合物和有机聚合物等。卢英华等在无水乙醇、去离子水和氨 水的碱性体系中WTE0S为娃源、CTAB溶液为模板剂制备出介孔Si化载体歷SS，歷SS经 过修饰后，用于脂肪酶的交联负载，制得的成品固定化酶活性较好，且耐热、耐酸碱能力均 远强于游离酶(卢英华，何彩云，姚传义，林旺锦.固定化脂肪酶的制备方法[P].中国专 利：CN104593278A，2015-05-06)。程海明等W皮胶原为基材，与交联剂依次在酸性条件和 中偏碱性条件下进行交联后，用中性缓冲溶液冲洗除去未反应的交联剂，所得载体的游 离醒基含量为0. 5-5. 0mmol/g，比表面积为2. 0-20m7g。然后，将脂肪酶与上述修饰载体 交联后制得皮胶原固定化酶，该固定化酶活性在放置1个月后仅损失5%，稳定性良好(程 海明，宋德伟，陈敏，李志强.脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法[P].中国专利： CN104293763A，2015-01-21)。然而，当此类固定化酶应用于高粘度物料体系时，在反应结束 催化剂分离的过程中，过滤速率十分缓慢，在一定程度上制约了生产效率的提高。
[0004] 近年来，磁性纳米粒子在各种固载化催化剂的制备中受到重视，W磁性材料为载 体制备的固体催化剂在完成催化反应后均可在外界磁场的参与下快速分离和回收，从而简 化了催化剂分离工艺，大幅度提高了工业化生产效率。此外，利用外部磁场可W控制磁性固 定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械揽拌方式，提高了固定化酶的催化效率。刘薇 等用共沉淀法制备了化3〇4粒子，再经月桂酸处理后，获得平均粒径20nm、具有超顺磁性的 疏水磁性载体，将此磁性载体用于脂肪酶固定化时，固定化脂肪酶成品的稳定性显著提高， 且固定化脂肪酶回收便捷（刘薇，白妹，孙彦.磁性纳米粒子的制备及脂肪酶的固定 化[J].过程工程学报，2004，04期：362-366)sReetz等W-系列疏水单体为原料，采 用溶胶-凝胶工艺，制备了氧化铁多孔磁性凝胶固定化酶，酶的固定化率较高（88% )。与 自由脂肪酶相比，在异辛烧中其催化月桂酸与正辛醇醋化反应的活性增加了 1-2倍（Reetz ΜΤ,ZontaA,VijayakrishnanV,etal.Entrapmentoflipasesinhydrophobic m曰gnetite-cont曰iningsol-gelmaterials:magneticseparationofheterogeneous biocatalysts1 [J].JournalofMolecularCatalysisAChemical, 1998, 134:251 -258)。然而，磁性粒子比表面积较小，可负载的脂肪酶数量有限。此外，由于彼此之间的磁吸 引力，磁性粒子在参与反应时容易产生磁凝聚效应，使其比表面积大幅度下降，降低了物料 与酶活性中屯、接触的概率，从而制约了酶催化活性的表现。
[0005] 磁性粒子的包覆技术是一种新兴的载体处理手段，将一些化学惰性较好的材料附 着在磁性粒子表面可W阻碍其发生磁凝聚，运种核-壳型磁性载体很好的克服了"磁性粒 子分散性较差"的问题。安红等使用凝胶包覆法制备的磁性核壳结构化3〇4@mcm-41载体，饱 和磁强度达46. 65emu/g，很好的保持了磁性纳米粒子的磁分离优势。通过化学吸附的方法 可W将约14%的膜蛋白酶固定在化304@MCM-41上，与游离酶相比，固定化膜蛋白酶的热稳定 性、抑值适应性明显改善，且分散性良好(安红，宋伟明，高树刚.膜蛋白酶在磁性核壳 介孔分子筛上的固定化研究[J].食品科学，2012，23期：266-269)。此类核-壳型磁性 载体通常W致密的二氧化娃作为包覆层，与磁性纳米粒子相比，其比表面积有一定增加，但 脂肪酶的负载量依然较少。此外，脂肪酶作为一种生物物质对此类载体的适应性有限，故催 化活性较低。
[0006] 随着近年来食品工业的快速发展，功能性油脂和特殊使用性能的油脂制品需求量 越来越大(如人造奶油、起酥油、煎炸油和结构脂等)。油脂醋醋交换和油脂氨化是食用油脂 加工的重要化学反应。然而，由于氨化油脂中的反式脂肪酸会显著增加食用者罹患屯、脑血 管疾病的风险，它的使用逐渐受到了限制。油脂醋-醋交换不产生反式脂肪酸，不丧失必需 脂肪酸，而且能改善油脂的食用性能，生产出的油脂制品具有起酥性、可塑性、延展性和风 味好的特点。此外，通过油脂醋-醋交换，结合新脂肪酸，改变脂肪酸的位置分布，从而赋予 其烙化、消化、吸收和代谢功能，增加了其在食品营养和治疗方面的功能。油脂醋-醋交换 反应中的催化剂发挥着重要作用，所W研究开发新型油脂醋醋交换固定化酶催化剂，对于 食用油脂加工具有重要作用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对上述现有技术所存在的缺陷，提供一种比表面积大，与产 物分离速度快、催化活性高的磁性径基憐灰石固定化脂肪酶的制备方法，本发明还提供所 制备的固定化脂肪酶在食用油脂加工中的应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的磁性径基憐灰石固定化脂肪酶的制备方法包括下述步骤： 第一步，磁性径基憐灰石的制备 将一定量的FeCls·6&0和化2SO4· 7&0放入烧杯中，加入脱氧水，机械揽拌使 化CI3· 6&0与化2SO4· 7&0完全溶解；然后缓慢滴加25%的畑3 · &0溶液于混合溶液中， 25°C恒溫揽拌均匀；然后分别缓慢滴加化(N03)2 ·他2〇溶液和（NH4)2HP04溶液于上述反应 体系中，继续揽拌均匀后升溫至9(TC，待其充分反应后将所得产物冷却至室溫，陈化过夜， 对产物进行磁分离并用去离子水洗至中性，干燥后在200°C条件下般烧化，得到磁性径基 憐灰石载体； 第二步，载体的功能化修饰 将第一步制备的磁性径基憐灰石载体放入干燥的圆底烧瓶中与甲苯溶液混合均匀，然 后缓慢滴加3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷于该反应体系中，在甲苯的回流溫度下充分反应；反应 结束后用磁铁对产品进行分离，分离出的产品用甲苯洗涂后真空干燥，得到氨基修饰的磁 性径基憐灰石载体； 第Ξ步，脂肪酶的固定化 取氨基修饰后的磁性径基憐灰石载体放入干燥的圆底烧瓶中，加入10%的戊二醒溶 液，25~45°C条件下在恒溫振荡器中振荡反应；反应完成后加入0. 025~0. 125mol/L的酶溶 液，继续振荡反应6~14小时；待反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用抑6. 0~8. 0的憐酸 缓冲溶液洗涂，冷冻干燥后得到磁性径基憐灰石固定化脂肪酶成品。
[0009] 所述第Ξ步中加入的酶溶液是在抑值6. 0~8. 0、0. 2mol/L的憐酸缓冲溶液中按 0. 025~0. 125g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成。
[0010] 所述第Ξ步脂肪酶固定化时的最佳条件为：憐酸缓冲溶液抑为7. 0,添加AY脂肪 酶的比例为0. 1〇肖/1^，振荡反应溫度为30°C，振荡反应时间lOh。
[0011] 本发明制备的磁性径基憐灰石固定化脂肪酶在食用油脂加工中作为醋醋交换催 化剂应用。
[0012] 径基憐灰石是人体骨骼组织的主要无机组成成分，由于其具有较大的比表面积、 较好的化学惰性、无毒副作用等突出优点而受到较多关注，常常被作为药物载体广泛的应 用于生物医学领域。
[0013] 本发明的优点在于采用径基憐灰石包覆磁性纳米粒子，由于径基憐灰石具有大量 孔道，孔道内壁上有大量径基，运种构造便于载体的进一步修饰W及活性物质的固载，从而 大幅度提高了磁性粒子的比表面积，增加了脂肪酶的负载量，更好的体现了固定化脂肪酶 的催化作用。同时，本发明利用径基憐灰石所具有良好的生物相容性，更好的发挥了固定化 脂肪酶的催化活性。
[0014] 本发明的优点具体体现在： 1、磁性载体采用径基憐灰石作为包覆层，增加了固载酶的生物相容性，提高了脂肪酶 对载体的适应性。
[0015] 2、制备过程中，在对磁性载体进行修饰和对脂肪酶进行固载时，保留了大量介孔 孔道结构和较高的比表面积，提高了催化活性位点的分散度，从而增加了催化效率。
[0016] 3、通过键合交联法将脂肪酶束缚在孔道结构中，有效地防止了活性组分流失，提 高了催化剂的稳定性。
[0017] 4、在催化反应中，可使用变换外界磁场的方法来增加催化剂与物料的接触传质速 率与均匀度。
[0018] 5、对反应容器无腐蚀性，对环境无污染。
[0019] 6、该催化剂可采用外界磁场干预的方法从反应产物中快速的分离，比均相反应工 艺有较大优势，提高了生产效率。与非磁性固定化酶相比，该固定化酶更容易分离，在某些 环境(如高粘度底物体系）中其优势更大。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明磁性径基憐灰石固定化脂肪酶的制备流程图。
[002。 图2是本发明中磁性径基憐灰石（HAP-丫-Fe203)的透射电镜图。
[0022] 图3是本发明磁性径基憐灰石固定化脂肪酶成品的透射电镜图。
[002引图4是本发明中磁性径基憐灰石（HAP-丫-Fe203)的氮气吸附和脱附曲线。
[0024]图5是本发明磁性径基憐灰石固定化脂肪酶成品的氮气吸附和脱附曲线。
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