羟苄丝肼及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的应用
【专利摘要】本发明提供羟苄丝肼及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述羟苄丝肼的化学式为：羟苄丝肼为一种现有药物，其毒理药理相对比较清晰；研发成本低，推广应用价值大；羟苄丝肼可以抑制黑素瘤、肺癌、结肠癌的肿瘤细胞的活性，特别适合结肠癌和人恶性黑素瘤的治疗。
【专利说明】
羟苄丝肼及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及羟苄丝肼及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的应用，属 于抗肿瘤药物领域。
【背景技术】
[0002] 羟苄丝肼又称三羟基丝氨酰肼、色拉肼，是一种外周多巴脱羧酶抑制剂。羟苄丝肼 药理作用与卡比多巴类似，不易透过血-脑脊液屏障，多用于帕金森病和帕金森综合征的治 疗，其有效的血药浓度为2.64~4.46μg/ml (9~15.2μΜ)。羟苄丝肼常用于震颤麻痹，多与左 旋多巴合用。口服吸收快，吸收率约58%，在肠内代谢，由尿排泄，12小时排泄约90%，一般 羟苄丝肼与左旋多巴按1:4配比应用。
[0003] 近年来，随着人们生活水平的提高，人们的生活习惯及生活环境等也发生了变化。 高脂饮食、吸烟、电离辐射、空气污染、砷和其他职业因素等导致肿瘤的发病率逐年上升，尤 其是黑色素瘤、肺癌、结肠癌近50年来的发病率和死亡率均明显增高。
[0004] 黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，恶性程度极高，占 皮肤肿瘤死亡病例的极大部分。多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，也见于软脑膜和脉络膜， 是全球性疾病，发病率逐年增加，每年有十余万新诊断病例。该肿瘤扩散迅速，危害程度高， 预后大多很差，因此早期诊断和及时正确治疗十分重要。
[0005] 肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。 近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均 占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完 全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。
[0006] 结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界 处，以40~50岁年龄组发病率最高，男女之比为2~3:1。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠 癌发病的主要原因是高脂肪食谱和纤维素摄入不足。结肠的慢性炎症使结肠癌的发生率比 一般人群高。有结肠息肉者，结肠癌发病率是无结肠息肉者的5倍。家族性多发性肠息肉瘤， 癌变的发生率更高。遗传因素可能也参与结肠癌的发病。
[0007] 鉴于以上3种肿瘤的高发病率及严重危害性，所以近年来，黑色素瘤、肺癌、结肠癌 受到了社会及人们的广泛关注，对于黑色素瘤、肺癌、结肠癌的药物治疗研究成为了一个研 究热点，及时挖掘出一个对黑色素瘤、肺癌、结肠癌有良好防治效果的药物至关重要，对于 保障患者的生命健康具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明解决的技术问题是，羟苄丝肼为一种现有的治疗震颤麻痹的药物，本发明 发现该药物可以抑制肿瘤细胞的活性，可用于制备抗肿瘤药物。
[0009] 本发明的技术方案是，提供羟苄丝肼及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物 方面的应用，所述羟苄丝肼的化学式为：
[0010]
[0011] 进一步地，所述肿瘤为黑素瘤、肺癌、结肠癌。
[0012] 进一步地，所述肿瘤为黑素瘤。
[0013]进一步地，所述肿瘤为结肠癌。
[0014] 进一步地，所述抗肿瘤药物由活性成分和必要的辅料组成，所述活性成分为羟苄 丝肼或/和羟苄丝肼在药学上可接受的盐。
[0015] 本发明研究发现，羟苄丝肼能够抑制各种肿瘤细胞的活性，可以抑制恶性黑色素 瘤、肺癌、结肠癌等细胞的增殖、侵袭、迀移及肿瘤的生长，特别适合用于人恶性黑素瘤、结 肠癌。
[0016] 本发明首先采用酪氨酸激酶活性抑制体外筛选试验(ELISA法)初步筛选出羟苄丝 肼对黑色素瘤、肺癌、结肠癌防治作用的分子机制，再分别采用MTS法检测羟苄丝肼对细胞 增殖的影响、Transwell实验检测羟苄丝肼对细胞侵袭的影响、划痕实验检测羟苄丝肼对细 胞迀移的影响、Western Blot检测羟苄丝肼对人恶性黑素瘤SK-mel-28细胞凋亡相关信号 通路蛋白表达的影响。结果发现，低剂量的羟苄丝肼（IOuM)能够抑制黑色素瘤、肺癌、结肠 癌细胞的增殖、侵袭及迀移，并且通过VEGFR-3、PDGFR-β、C-Ki t、ErbB2、ABL等分子机制起作 用，同时羟苄丝肼能够逆转恶性黑色素瘤的耐药性，对耐药性黑素瘤也有防治效果。
[0017] 本发明的有益效果是，羟苄丝肼为一种现有药物，其毒理药理相对比较清晰;研发 成本低，推广应用价值大;羟苄丝肼可以抑制黑素瘤、肺癌、结肠癌的肿瘤细胞的活性，特别 适合人恶性黑素瘤的治疗。
【附图说明】
[0018] 图Ia表示不同浓度的羟苄丝肼在不同时间对人恶性黑素瘤A375细胞增殖的抑制 作用；图Ib表示不同浓度的羟苄丝肼在不同时间对肺癌A549细胞增殖的抑制作用；图Ic表 示不同浓度的羟苄丝肼在不同时间对结肠癌HCT116细胞增殖的抑制作用；图Id表示不同浓 度的羟苄丝肼在不同时间对人恶性黑素瘤SK-mel-28细胞增殖的抑制作用；图Ie表示不同 浓度的羟苄丝肼在不同时间对人恶黑耐药株RA细胞增殖的抑制作用；
[0019] 图If表示不同浓度维罗非尼能够抑制人恶性黑素瘤A375细胞的增殖；图Ig表示与 图If相比较，不同浓度维罗非尼对人恶黑耐药株RA的增殖无明显抑制作用，从而进一步验 证RA的耐药性。
[0020] 图2a-2表示实验组，即低剂量的羟苄丝肼（IOuM)抑制人恶性黑素瘤A375细胞的侵 袭(处理24h)的显微镜图片；图2a-l表示为图2a-2的对照组实验，即羟苄丝肼为OuM;图2a-3 表示图2a_l和图2a_2图中细胞数量的柱状图；
[0021] 图2b-2表示实验组，即低剂量的羟苄丝肼（IOuM)抑制肺癌A549细胞的侵袭(处理 24h)的显微镜图片；图2b-l表示为图2b-2的对照组实验，即羟苄丝肼为OuM;图2b-3表示图 2b-l和图2b-2图中细胞数量的柱状图；
[0022]图2c-2表示实验组，即低剂量的羟苄丝肼（IOuM)抑制结肠癌HCTl 16细胞的侵袭 (处理24h)的显微镜图片；图2c-l表示为图2c-2的对照组实验，即羟苄丝肼为OuM;图2c-3表 示图2c-l和图2c-2图中细胞数量的柱状图；
[0023]图2d-2表示实验组，即低剂量的羟苄丝肼（IOuM)抑制人恶性黑素瘤SK-mel-28细 胞的侵袭(处理24h)的显微镜图片；图2d-2表示为图2d-l的对照组实验，即羟苄丝肼为OuM; 图2d-3表示图2d-l和图2d-2图中细胞数量的柱状图；
[0024]图2a_2d系列（注:①n = 3，各实验组与对照组比较，#*P〈0.001;②各图结晶紫染 色图片显微镜倍数为X100;③各柱形图的横坐标表示浓度，纵坐标表示细胞数量）
[0025] 图3a表示ΙΟμΜ羟苄丝肼在不同时间对A375细胞迀移的抑制作用；图3b表示ΙΟμΜ羟 苄丝肼在不同时间对Α549细胞迀移的抑制作用；图3c表示ΙΟμΜ羟苄丝肼在不同时间对 HCT116细胞迀移的抑制作用；图3d表示ΙΟμΜ羟苄丝肼在不同时间对SK-mel-28细胞迀移的 抑制作用；图3e表示ΙΟμΜ轻苄丝肼在不同时间对RA细胞迀移的抑制作用。
[0026] 图4表示Western Blot检测羟苄丝肼对SK-mel-28细胞凋亡相关信号通路蛋白的 表达。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0028] 实验材料
[0029] 细胞系：人恶性黑素瘤A375、SK-mel-28、SK-mel-5细胞株;肺癌A549细胞株;结肠 癌HCTl 16细胞株;恶黑耐药株RA。
[0030] 羟苄丝肼（编号B101489,纯度彡98%)购自上海阿拉丁生物科技股份有限公司， PBS溶解至相应浓度母液于-20 °C保存。高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰酶均购自美国 Hyclone公司，抗PARP购自Cell Signaling Technology。抗GAPDH抗体购自 Santa公司。基质 胶Matrigel购自美国BD公司。C〇2培养箱购自美国Thermo公司。倒置显微镜购自日本 Olympus公司。台式离心机购自美国BECKMAN公司。
[0031] 实验方法
[0032] 1、细胞培养:A375、SK-mel-28、SK-mel-5、A549、HCT116 均用含 10 % 胎牛血清的 DMEM，耐药株RA用含2μΜ维罗非尼、10 %胎牛血清的DMEM，常规37 °C、5 %C02培养箱中培养， 取对数生长期细胞进行试验。
[0033] 2、MTS法检测羟苄丝肼对细胞增殖的影响：分试验组和对照组，每组设5个复孔。试 验组加入羟苄丝肼原液（IOmM)，终浓度分别为10μΜ、20μΜ、50μΜ，对照组加等量的I3BS。分别 于24、48、72h加入MTS并于培养箱孵育2h，然后酶标仪检测490nm波长下的各孔吸光度值 (OD)0
[0034] 3、Transwe 11实验检测轻节丝肼对细胞侵袭的影响：用24孔Transwe 11小室，按说 明书方法进行。每组设3个复孔。实验组细胞分别加入含ΙΟμΜ羟苄丝肼的培养液，对照组加 等量PBS。下室按600μ1/孔加入趋化液(DMEM+20%FBS)。置于培养箱中孵育24h。倒置显微镜 下观察穿膜细胞数。于100倍光镜下分别选取5个视野(上、下、左、右和中间）照相，计数。
[0035] 4、划痕实验检测羟苄丝肼对细胞迀移的影响：分别将各细胞(5X 105/ml)接种到6 孔板，每孔500μ1，于培养箱中孵育。待细胞生长至70~80%，用200微升的枪头垂直孔板轻 轻直线刮除细胞，PBS缓冲液冲洗2次，除去所刮除细胞及细胞碎片。实验组分别加入含ΙΟμΜ 羟苄丝肼的培养液，对照组加等量PBS。倒置显微镜下观察，100倍光镜下照相。继续于培养 箱孵育24h、48h，倒置显微镜下观察，100倍光镜下照相，计数各组划痕部位迀移来的细胞 数。
[0036] 5、Western Blot分析：分别用ΙΟμΜ轻苄丝肼处理SK-mel-28细胞6h、12h、24h、48h， 对照组加等量的I3BS。收集细胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30min，提取蛋白，后用Western Blot检测蛋白表达情况。
[0037] 6、统计学处理:数据以x±s表示，采用SPSS17.0软件进行统计学分析，组间比较用 t检验。各组与对照组比较，P〈0.05为差异统计学意义。
[0038] 实验结果
[0039] -、酪氨酸激酶活性抑制体外筛选试验(ELI SA法)初步筛选出羟苄丝肼对黑色素 瘤、肺癌、结肠癌防治作用的分子机制
[0040] 表1表示酪氨酸激酶活性抑制体外筛选试验(ELISA法)初步筛选出羟苄丝肼对黑 色素瘤、肺癌、结肠癌防治作用的分子机制。当抑制率多50%时表示药物有效，从表1中可以 看出低剂量的羟苄丝肼（IOuM)能够抑制酪氨酸激酶VEGFR-3、roGFR-f3、C-Kit、ErbB2、ABI^ 活性。
[0041 ]表1酪氨酸激酶活性抑制体外筛选试验
[0045] 注：SUl1248，BIBW2992，Dasatinib，AEW541，PD173074，Ibrutinib，PF562271， ABT860等为各激酶的抑制剂。
[0046] 其中，筛选方法:酶联免疫吸附测定(ELISA);酪氨酸激酶:酶谱;作用时间：Ih;结 果评定:无效：1〇μΜ〈50 %，有效：ΙΟμΜ彡50 %。
[0047]二、MTS检测不同浓度羟苄丝肼对各细胞增殖的抑制作用
[0048] 羟苄丝肼能够抑制人恶性黑素瘤Α375、SK-mel-28细胞，肺癌Α549细胞，结肠癌 HCT116细胞及恶黑耐药株RA细胞的增殖（图Ia-图Ie)。羟苄丝肼分别在ΙΟμΜ~50μΜ浓度范 围内对六375、31(1161-28、六549、!1(：1'116、1^细胞活性抑制作用呈量效关系，在0~7211内呈时 效关系。与对照组相比，差异有统计学意义(Ρ〈〇.05)。
[0049] 图13-图]^中，各浓度组与对照组比较，*表示？〈0.05，**表示？〈0.01，***表示卩〈 O-OOl0
[0050]三、Transwell实验检测羟苄丝肼对各细胞侵袭的影响
[0051 ] 如图2a_图2d所示，从柱形图上可以看出，相对于对照组(OuM)，经浓度为ΙΟμΜ轻苄 丝肼处理Α375、SK-mel-28、A549、HCT116细胞24h，实验组细胞侵袭数量低于对照组，差异有 统计学意义(#扑〈0.001)，说明一定浓度的羟苄丝肼能抑制4375、31(1161-28^549、!1(：1'116 细胞侵袭（图2a-图2d)。各柱形图显示，其中，抑制结肠癌HCT116细胞的效果最好，其次为人 恶性黑素瘤A375细胞。
[0052] 四、划痕实验检测羟苄丝肼对各细胞迀移的影响
[0053] 经终浓度为ΙΟμΜ羟苄丝肼分别处理六375、31(1161-28、4549、!1(：1'116、1^细胞2411、 48h后，实验组细胞迀移能力低于对照组，差异有统计学意义(*Ρ〈0.05)，说明一定浓度的羟 苄丝肼能抑制Α375、SK-mel-28、Α549、HCT116、RA细胞迀移（图3a-图3e)。
[0054] 五、Western Blot检测轻节丝肼对SK-mel-28细胞凋亡相关信号通路蛋白的表达 [0055]用1(^]\1轻苄丝肼处理51(1161-28细胞611、1211、2411、4811，168七6?181(^结果显示51(-mel-28细胞PARP在48h时出现切割，GATOH为内参照（图4)。即低剂量的羟苄丝肼（IOuM)可以 上调PARP的裂解片段表达，引起细胞凋亡的发生。
【主权项】
1. ?节丝阱及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述径节丝阱的 化学式为：2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑素瘤、肺癌、结肠癌。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑素瘤。4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为人恶性黑素瘤。5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌。6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物由活性成分和必要的辅料组 成，所述活性成分为径节丝阱或/和径节丝阱在药学上可接受的盐。
【文档编号】A61P35/04GK106074474SQ201610422044
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610422044.2, CN 106074474 A, CN 106074474A, CN 201610422044, CN-A-106074474, CN106074474 A, CN106074474A, CN201610422044, CN201610422044.2
【发明人】陈翔, 彭聪, 黄遵南, 周优优
【申请人】中南大学湘雅医院