8?羟基喹啉丙氨酸翻译系统及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种氨酰基?tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明还提供一种包含所述氨酰基?tRNA合成酶突变体的翻译系统。本发明还提供一种能够催化8?羟基喹啉生成8?羟基喹啉丙氨酸的酪氨酸酚裂解酶突变体，其含有的氨基酸序列由SEQ ID NO:5所示。
【专利说明】8-哲基喧嘟丙氨酸翻谭系统及其应用
[0001 ]本发明是于2013年3月22日提交的申请号为201310093794.6的发明专利申请的分 案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供一种氨酷基-tRNA合成酶突变体， 其为一种正交氨酷基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0:4所示的氨基酸 序列和SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明还设及一种2-氨基-3-(8-?基哇嘟-5- 基)丙酸(简称8-径基哇嘟丙氨酸，简写为HqAla)翻译系统。更具体地，本发明设及利用正交 tRNA、正交氨酷基-tRNA合成酶的配对将8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物定点特异性插 入目标蛋白质的翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入8-径基哇 嘟丙氨酸或其结构类似物的方法。本发明还设及一种酪氨酸酪裂解酶突变体，其含有的氨 基酸序列由SEQ ID NO:5所示，所述酪氨酸酪裂解酶突变体催化8-径基哇嘟生成8-径基哇 嘟丙氨酸。最后，本发明还提供一种通过遗传编码包含能够馨合金属离子的非天然氨基酸 的突变蛋白质来拓展蛋白功能的方法。
【背景技术】
[0003] 遗传编码馨合金属离子的非天然氨基酸是一种研究蛋白质传感器设计，金属酶工 程W及蛋白核磁共振的有力工具，但是，受限于非天然氨基酸合成的复杂性，使得该方法不 能被生物学家广泛地应用。本发明通过定向进化酪氨酸酪裂解酶，使其能够高效地催化一 种新型非天然氨基酸-8-径基哇嘟丙氨酸的生物合成，该非天然氨基酸可W与多种过渡金 属离子形成稳定复合物。酪氨酸酪裂解酶(Tyrosine地enol lyase，1TL)，又名0-酪氨酸 酶，W憐酸R比唉醒(pyridoxal-地osphate，PLP)为辅酶。1987年，Kazakov等发现TPL分子由4 个相同的分子量约为50kDa的亚基组成，每个亚基四聚体与4分子憐酸化唉醒(PLP)结合在 一起。TPL可W催化k酪氨酸发生0-消去反应生成苯酪、丙酬酸和氨。由于运个反应是可逆 的，将8-径基哇嘟代替苯酪后，可由8-径基哇嘟、丙酬酸钢和氯化锭可在1TL催化下生成8- 径基哇嘟丙氨酸。
[0004] 遗传编码8-径基哇嘟丙氨酸还需要一种在目标蛋白中定点特异插入非天然氨基 酸的方法，本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地 定点插入蛋白质的通用方法。运些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的 选择密码子(selector codon)从而能在体内多肤翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限 定位置。运些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酷基- tRNA合成酶(0-RS)用非天然氨基酸加载该0-tRNA。运些组分不与宿主生物体内的任何内源 性tRNA、氨酷基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应（即，它必须是正交的）。利用运 种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。
[0005] 本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻 译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号wo 2002/086075,其发 明名称为 "METHODS AND COMPOSITION FOR T肥 PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA- AMINOACYL-tRNA SYNT肥TASE PAIRS" ;W0 2002/085923,其发明名称为"IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS" ;W0 2004/094593,其发明名称为巧XPANDING T肥EUKARYOTIC GE肥TIC CODE"。定点特异性插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的 产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz，Qiem.Commun. (Camb)l: 1-11(2002); Wang和Schultz,Angewan化e Qiemie Int.Ed.44(1):34-66(2005);Xie和Schultz,Methods 36(3):227-238(2005);Xie和Schultz，Curr.0pinioninChemicalBiology9(6):548- 554(2005); Wang等，Annu. Rev. Bio地ys. Biomol. Struct. 35:225-249(2006)。虽然目前本领 域已有一套完善的系统可W定点特异性插入多种非天然氨基酸，但是由于8-?基哇嘟丙氨 酸自身结构的特点，目前仍无报道可W成功地在蛋白中插入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类 似物。同时，目前报道中成功插入的其他非天然氨基酸均与8-径基哇嘟丙氨酸结构差异较 大，导致本领域技术人员根本不会想到使用相同的系统去整合8-径基哇嘟丙氨酸或其结构 类似物。另外，正交氨酷基-tRNA合成酶的筛选工作量非常大，需要通过3轮正负筛选，即总 共6轮筛选，才从突变库(包含上百万甚至上千万个克隆）中筛选得到本发明中所述的正交 氨酷基-tRNA合成酶。同时由于筛选过程中经常会出现假阳性克隆，我们需要通过进一步的 试验依次去验证它们插入非天然氨基酸的能力，无形中又增加了许多工作量。因此，本发明 的内容具有重要的意义，也是首次在蛋白中成功地定点特异插入8-径基哇嘟丙氨酸，所产 生的突变蛋白质不仅具有馨合金属离子的能力，并且能够作为特异性金属离子传感器。
【发明内容】
[0006] 1、技术问题
[0007] 本发明提供一种氨酷基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酷基-tRNA合成酶， 其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0:4所示氨基酸和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的 保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的酶活 性。运种氨酷基-tRNA合成酶突变体能够用8-径基哇嘟丙氨酸(简写为HqAla)或其结构类似 物优先氨酷化与之配对的正交tRNA,从而在翻译的氨基酸序列中插入化Ala或其结构类似 物。运是本发明人首次发现的，相应地，在本发明中将其命名为正交8-径基哇嘟丙氨酸氨酷 基-tRNA合成酶化qAlaRS)。
[000引在整个本发明的说明书中，术语巧-径基哇嘟丙氨酸的结构类似物"是指选自8-径 基哇嘟丙氨酸的盐或醋、对径基苯基丙氨酸或对径基苯基丙氨酸的盐或醋的化合物。本发 明还提供一种酪氨酸酪裂解酶(Tyrosine地enol lyase,简写为TPL)突变体，所述酪氨酸 酪裂解酶突变体可W高效地催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸，其氨基酸序列为：
[0009] (1)569 10^:5所示的氨基酸序列，或
[0010] (2)将SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加 且具有与SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列相同的催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的 酶活性的由SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[001。 此外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语"能够催化8-径基哇嘟生成8- 径基哇嘟丙氨酸的酪氨酸酪裂解酶突变体"不仅包括SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列，还包 括SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化8- 径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的酶活性，所述功能衍生物是指将SEQ ID N0:5所示的氨 基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0:5所示的氨基酸 序列相同的催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的酶活性的由SEQ ID N0:5所示的氨基 酸序列衍生的氨基酸序列。
[0012] 运种能够催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的酪氨酸酪裂解酶突变体是本 发明人首次发现的。
[0013] 在上述发现的基础上，本发明提供一种利用正交tRNA、正交氨酷基-tRNA合成酶的 配对将8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入目标蛋白质的翻译系统，和利用 所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的方法。 本发明还设及用运种翻译系统和运种方法产生的含有8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物 的突变蛋白质及其应用。
[0014] 因此，本发明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酷基-tRNA合成酶的配对将8- 径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入蛋白质的翻译系统，并且提供利用该翻译 系统在目标蛋白质中定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的方法。
[0015] 本发明还提供利用本发明的翻译系统产生的含有至少一个8-径基哇嘟丙氨酸或 其结构类似物的突变蛋白质。在本发明的优选方面中，本发明人利用运种方法将8-径基哇 嘟丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，巧光 蛋白（Fluorescent Proteins,简写为FP)。然而，本领域技术人员应该理解，本发明的方法 也可W用于在巧光蛋白之外的多种蛋白中定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类 似物，并不局限于该蛋白。
[0016] 最后，本发明还提供一种通过遗传编码包含能够馨合金属离子的非天然氨基酸的 突变蛋白质来拓展蛋白功能的方法，所述非天然氨基酸能馨合多种金属离子，本发明中优 选在蛋白的氨基酸序列中引入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物。
[0017] 2、技术方案
[0018] 本发明人经过筛选，获得一种正交氨酷基-tRNA合成酶，其为一种正交氨酷基- tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列和SEQ ID N0:4所示 的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID N0:4所示的氨基酸 序列相同的酶活性，在本发明中将其命名为正交8-径基哇嘟丙氨酸氨酷基-tRNA合成酶 化qAlaRS)。并且，本发明人利用所述正交氨酷基-tRNA合成酶，研发了一种在蛋白的氨基酸 序列中引入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的翻译系统，该翻译系统在本文中简称为8- 径基哇嘟丙氨酸翻译系统(有时也简称为"本发明的翻译系统"）。
[0019] 本领域技术人员应该理解，在本发明中，除了SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列之 夕h术语"本发明的正交氨酷基-tRNA合成酶"或"正交8-径基哇嘟丙氨酸氨酷基-tRNA合成 酶"还包括SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的保守性变体，只要所述保守性变体具有与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可;并且还包括将SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列 经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同 的酶活性的由SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0020] 具体来说，本发明提供在体内（例如在宿主细胞内）识别选择密码子（selector codon)如班巧终止密码子(TAG)从而将非天然氨基酸8-?基哇嘟丙氨酸或其结构类似物定 点特异性插入到多肤链中的8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统。所述8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统 包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA(O-tRNA)和正交氨酷基-tRNA合成酶(0- RS)配对。即，宿主细胞内源性氨酷基-tRNA合成酶不会识别0-tRNA。类似地，本发明提供的 0-RS不W显著水平或者某些情况下不W可检测水平地识别内源性tRNA。利用所述翻译系统 能够产生在翻译过程中定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的大量蛋白质。 [0021 ]在一些方面中，本发明提供8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统。所述翻译系统包含：
[0022] (a)8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物，
[0023] (b)本发明的正交氨酷-tRNA合成酶(0-RS)，和
[0024] (C)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID N0:1所示的多核巧酸序列，其中所述正交 氨酷-tRNA合成酶用8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物优先氨酷化所述0-tRNA。
[0025] 其中，术语巧-?基哇嘟丙氨酸的结构类似物"是指选自8-径基哇嘟丙氨酸的盐或 醋、对径基苯基丙氨酸或对径基苯基丙氨酸的盐或醋的化合物。
[0026] 优选地，本发明的8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其 中所述核酸含有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子，优选地为班巧密 码子。更优选地，本发明的8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统还包含编码正交氨酷基-tRNA合成酶 的核巧酸序列。
[0027] 所述系统中所用的正交氨酷基-tRNA合成酶(0-RS)即为本发明人首次发现的氨酷 基tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID N0:4所示 的氨基酸序列相同的酶活性。
[00%]本发明还设及编码所述正交氨酷-tRNA合成酶(0-RS)的核巧酸序列。在一个优选 的方面中，所述核巧酸序列为SEQ ID N0:3。
[0029] 在本发明的优选方面中，本发明提供一种8-?基哇嘟丙氨酸翻译系统，所述系统 包含：
[0030] (i)8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物；
[0031] (i i)本发明的正交氨酷基-tRNA合成酶；
[0032] (iii)正交tRNA,其包含SEQ ID N0:1所示的多核巧酸序列；其中所述正交氨酷基- tRNA合成酶用所述8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物优先氨酷化所述正交tRNA;和
[0033] (iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少 一个选择密码子。
[0034] 其中，术语巧-径基哇嘟丙氨酸的结构类似物"是指选自8-径基哇嘟丙氨酸的盐或 醋、对径基苯基丙氨酸或对径基苯基丙氨酸的盐或醋的化合物。
[0035] 优选地，所述8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统还包含编码本发明的正交氨酷基-tRNA 合成酶的核巧酸序列。在一个优选的实施方案中，所述编码本发明的正交氨酷基-tRNA合成 酶的核巧酸序列为SEQ ID NO:3所示。
[0036] 该翻译系统中的各种组分可W衍生自各种物种来源，例如，该翻译系统中的各组 分衍生自詹氏甲烧球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA(O-tRNA)为古菌来 源的反密码子突变为与班巧密码互补的酪氨酸tRNA。在一些实施方式中，0-tRNA是班巧抑 制型tRNA。在一些实施方式中，0-tRNA包含SEQ ID N0:1所示的多核巧酸序列，优选地，0- tRNA的序列如SEQ ID N0:1所示。在一个实施方式中，用于该系统的正交氨酷基-tRNA合成 酶可W包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列及该序列的保守变体。在优选的实施方案中，用 于该系统的正交氨酷基-tRNA合成酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:4所示。
[0037] 在一些方面中，本发明的8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核 酸，其中所述核酸具有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子。在优选方 面中，所述正交tRNA是班巧抑制型tRNA，并且所述选择密码子是班巧密码子。
[0038] 在一些方面中，本发明提供包含编码本发明的正交氨酷基-tRNA合成酶的核巧酸 序列和相对应的正交tRNA序列的宿主细胞。所用的宿主细胞不作具体限定，只要正交氨酷 基-tRNA合成酶和正交tRNA在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。例如，所述宿 主细胞可W是真细菌细胞，优选大肠杆菌。
[0039] 本发明还提供产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨酸的突 变蛋白质的方法。所述方法利用上述8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统。所述方法通常包括下述 步骤：
[0040] (a)提供含有W下组分的8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统的步骤：
[0041] (i)8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物；
[0042] (ii)本发明的正交氨酷基-tRNA合成酶(0-RS);
[0043] (iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID N0:1所示的多核巧酸序列，其中所述0- RS用8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物优先氨酷化所述0-tRNA;和
[0044] (iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有0-tRNA特异性识别的至少一个选 择密码子(任选地为班巧密码子）；
[0045] (b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酷基-tRNA合成酶的核巧酸序列W及 编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入8-径基 哇嘟丙氨酸或其结构类似物，在所述目标蛋白质的翻译过程中，8-径基哇嘟丙氨酸或其结 构类似物氨酷化的正交RNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子W及8-径基哇 嘟丙氨酸或其结构类似物，从而介导8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入所 述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含有8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类 似物的突变蛋白质。
[0046] 其中，术语巧-径基哇嘟丙氨酸的结构类似物"是指选自8-径基哇嘟丙氨酸的盐或 醋、对径基苯基丙氨酸或对径基苯基丙氨酸的盐或醋的化合物。
[0047] 本领域技术人员应该理解，适当的重组载体的构建和宿主细胞的筛选可W通过常 规分子克隆技术和筛选技术实现。
[0048] 本领域技术人员应该理解，在步骤(b)中，将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨 酷基-tRNA合成酶的核巧酸序列W及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的 宿主细胞中可W通过多种方式进行，例如，将所述正交tRNA序列、编码所述正交氨酷基- tRNA合成酶的核巧酸序列W及编码所述目标蛋白质的核酸序列分别可操作性地连接到适 当的载体中，再W任意次序或=者共同转化到适当的宿主细胞中；或者，也可W将所述正交 tRNA序列和编码所述正交氨酷基-tRNA合成酶的核巧酸序列可操作性地连接到一个适当的 载体中（两种序列之间有或无适当的接头连接），将编码所述目标蛋白质的核酸序列可操作 性地连接到另一种不同的适当的载体中，然后将构建好的两种重组载体共同转化到适当的 宿主细胞中；或者，也可W将所述正交tRNA序列和编码所述目标蛋白质的核酸序列可操作 性地连接到一个适当的载体中（两种序列之间有或无适当的接头连接），将编码所述正交氨 酷基-tRNA合成酶的核巧酸序列可操作性地连接到另一种不同的适当的载体中，然后将构 建好的两种重组载体共同转化到适当的宿主细胞中。或者，也可W将正交tRNA序列和编码 所述正交氨酷基-tRNA合成酶的核巧酸序列W及编码目标蛋白质的核酸序列W任意适当的 顺序可操作性地连接在一起，然后克隆到一个载体上，最后转化到适当的宿主细胞中。上述 克隆方案都是可行的，本领域技术人员可W根据实验的需要容易地进行适当的选择。
[0049] 另外，本领域技术人员还应该理解，为了避免宿主细胞对外源重组载体的"踢除" 效应，往往选择用带有不同抗生素标记的载体来构建需要共同转化到同一宿主细胞中的核 酸序列片段。对于适当的载体的选择、重组载体的构建、宿主细胞的转化或转染等等，都是 本领域的常规技术，例如，可W参见美国冷泉港实验室出版的分子克隆手册。
[0050] 在所述方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变使野生型 氨酷基-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋发生突变，选择用所述非天然氨基酸（即8-径基哇嘟 丙氨酸或其结构类似物)优先氨酷化所述0-tRNA的氨酷基-tRNA合成酶突变体（即，本发明 所用的正交氨酷基-tRNA合成酶）。所述选择步骤包括定点诱变后从得到的氨酷基-tRNA合 成酶分子库进行所述0-RS的正选择和负选择(参见下述实施例2)。在一些实施方式中，提供 翻译系统的步骤还包括提供0-tRNA的序列，0-tRNA为古菌来源的反密码子突变为与班巧密 码互补的酪氨酸tRNA,例如，所述0-tRNA是班巧抑制型tRNA,或者0-tRNA包含SEQ ID NO: 1 所示的多核巧酸序列。在运些方法中，提供翻译系统的步骤还包括提供含有所述翻译系统 所用的班巧选择密码子的编码目标蛋白质的核酸。
[0051] 还可在宿主细胞内实施产生含有8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的突变蛋白 质的方法。在运些情况中，提供的宿主细胞包含本发明的8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统（即， 包含编码本发明的0-RS的核巧酸序列、0-tRNA序列和含有至少一个选择密码子的编码目标 蛋白质的核酸），而在适宜的培养条件下（例如，在培养基中添加8-径基哇嘟丙氨酸或其结 构类似物等)培养该宿主细胞可导致在所述目标蛋白质中定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨 酸或其结构类似物。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞(例如，大肠杆 菌)。
[0052] 本发明还提供生产含有8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的巧光蛋白突变体的 方法，其利用上述产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类 似物的突变蛋白质的方法，其中所用的编码巧光蛋白突变体的核酸序列在适当的位置包含 所述正交tRNA特异性识别的选择密码子，在巧光蛋白的翻译期间，8-径基哇嘟丙氨酸或其 结构类似物定点插入到所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生含有8-径基哇嘟丙氨 酸或其结构类似物的巧光蛋白突变体。
[0053] 优选地，本发明还提供生产含有8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的绿色巧光蛋 白突变体的方法，所述方法利用上述8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统进行，所述方法通常包括 下述步骤：
[0054] (a)提供含有W下组分的8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统的步骤：
[0055] (i)8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物；
[0056] (ii)正交氨酷基-tRNA合成酶(0-RS);
[0化7] (iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID N0:1所示的多核巧酸序列，其中所述0- RS用所述8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物优先氨酷化所述0-tRNA;和 [005引（iv)编码所述绿色巧光蛋白的核酸，例如，但不限于，SEQ ID N0:6,其中所述核酸 含有所述0-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为班巧密码子）；
[0059] (b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酷基-tRNA合成酶的核巧酸序列W及 编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入8-径基 哇嘟丙氨酸或其结构类似物，在所述目标蛋白质（即绿色巧光蛋白）的翻译过程中，8-径基 哇嘟丙氨酸或其结构类似物氨酷化的正交RNA识别编码绿色巧光蛋白的mRNA上的选择密码 子W及8-径基哇嘟丙氨酸，从而介导8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物定点插入所述目标 蛋白质的特定位置(即，所述选择密码子对应的氨基酸位置）。
[0060] 其中，术语巧-径基哇嘟丙氨酸的结构类似物"是指选自8-径基哇嘟丙氨酸的盐或 醋、对径基苯基丙氨酸或对径基苯基丙氨酸的盐或醋的化合物。
[0061] 本发明还提供利用本发明的8-径基哇嘟丙氨酸翻译系统产生的含有8-径基哇嘟 丙氨酸或其结构类似物的巧光蛋白突变体，所述巧光蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:7。
[0062] 另外，本发明人进一步研究了在氨基酸序列中引入了8-?基哇嘟丙氨酸或其结构 类似物的蛋白突变体的应用，研究结果发现，超容易折叠绿色巧光蛋白突变体sfGFP-151- HqAla具有很强的铜离子结合能力，对铜离子的亲和力为O.lfM，可W用于馨合去除铜离子； 并且sfGFP-66-町Ala还在N末端和C末端分别加入一段六肤的接头GGTGGS后形成的突变蛋 白cpsf GFP-66-HqAla可W作为特异性锋离子传感器。
[0063] 本发明还设及一种通过遗传编码包含8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的突变 蛋白质来拓展蛋白功能的方法，所述方法包括:利用本发明所述的8-径基哇嘟丙氨酸翻译 系统或所述的产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨酸的突变蛋白质 的方法来生产包含8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的突变蛋白质，所产生的突变蛋白质 具有馨合金属离子的能力，并且能够作为特异性金属离子传感器。
[0064] 最后，本发明人经过筛选，还获得了一种能够催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙 氨酸的酪氨酸酪裂解酶(简写为TPL)突变体，其氨基酸序列为：
[0065] (1)569 10^:5所示的氨基酸序列，或
[0066] (2)将SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加 且具有与SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列相同的催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的 酶活性的由SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0067] 优选地，所述酪氨酸酪裂解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:5。分子模型表 明，与野生型酪氨酸酪裂解酶(氨基酸序列为SEQ ID NO: 11)相比较，该突变体的288位和 448位氨基酸分别突变为丝氨酸和半脫氨酸后显著地扩大了酶口袋，使酶和底物可W更好 地作用，从而高效地催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸。酶催化反应液经过HPLC纯化 后产率可达到40%，最终获得较高产量的8-径基哇嘟丙氨酸。
[0068] 此外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语"能够催化8-径基哇嘟生成8- 径基哇嘟丙氨酸的酪氨酸酪裂解酶突变体"不仅包括SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列，还包 括SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化8- 径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的酶活性，所述功能衍生物是指将SEQ ID N0:5所示的氨 基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0:5所示的氨基酸 序列相同的催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的酶活性的由SEQ ID N0:5所示的氨基 酸序列衍生的氨基酸序列。
[0069] 本发明还设及编码所述酪氨酸酪裂解酶突变体的核巧酸序列。
[0070] 本发明还设及一种制备8-径基哇嘟丙氨酸的方法，所述方法包括用上述酪氨酸酪 裂解酶突变体催化8-径基哇嘟，生成所述的8-径基哇嘟丙氨酸。
[0071] 综上所述，本发明提供下述：
[0072] 1.一种正交氨酷基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID N0:4所示氨 基酸序列和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有 与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
[0073] 2. -种翻译系统，所述系统包含：
[0074] (i)8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物；
[0075] (ii)第1项所述的正交氨酷基-tRNA合成酶；
[0076] (iii)正交tRNA,其包含SEQ ID N0:1所示的多核巧酸序列；其中所述正交氨酷基- tRNA合成酶用所述8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物优先氨酷化所述正交tRNA;和
[0077] (iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少 一个选择密码子，
[0078] 其中所述8-径基哇嘟丙氨酸的结构类似物选自8-径基哇嘟丙氨酸的盐或醋、对径 基苯基丙氨酸或对径基苯基丙氨酸的盐或醋。
[0079] 3.如第2项所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是班巧抑制型tRNA,所述 选择密码子是班巧密码子。
[0080] 4.如第2项所述的翻译系统，其中所述翻译系统还包含编码正交氨酷基-tRNA合成 酶的核巧酸序列。
[0081] 5.-种宿主细胞，其包含编码第1项所述的正交氨酷基-tRNA合成酶的核巧酸序列 和相对应的正交tRNA序列，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。
[0082] 6.-种产生在至少一个所选位置定点特异性插入8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类 似物的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
[0083] (a)提供第2项所述的翻译系统，该系统包含：
[0084] (i)8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物；
[0085] (ii)第1项所述的正交氨酷基-tRNA合成酶；
[0086] (iii)正交tRNA,其包含SEQ ID N0:1所示的多核巧酸序列；其中所述正交氨酷基- tRNA合成酶用所述8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物优先氨酷化所述正交tRNA;和
[0087] (iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA 特异性识别的至少一个选择密码子;和
[0088] (b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酷基-tRNA合成酶的核巧酸序列W及 编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入8-径基 哇嘟丙氨酸或其结构类似物，在所述目标蛋白质的翻译期间，8-径基哇嘟丙氨酸或其结构 类似物氨酷化的正交tRNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子W及8-?基哇 嘟丙氨酸，从而介导8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物定点特异性插入所述选择密码子对 应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的所述目标蛋 白质，
[0089] 其中所述8-径基哇嘟丙氨酸的结构类似物选自8-径基哇嘟丙氨酸的盐或醋、对径 基苯基丙氨酸或对径基苯基丙氨酸的盐或醋。
[0090] 7. -种通过遗传编码包含8-径基哇嘟丙氨酸或其结构类似物的突变蛋白质来拓 展蛋白功能的方法，所述方法包括:利用第6项所述的方法生产包含8-径基哇嘟丙氨酸或其 结构类似物的突变蛋白质，所产生的突变蛋白质具有馨合金属离子的能力，并且能够作为 特异性金属离子传感器。
[0091] 8.-种酪氨酸酪裂解酶突变体，所述酪氨酸酪裂解酶突变体催化8-径基哇嘟生成 8-美圣基哇嘟丙氨酸，其氨基酸序列为：
[0092] (1)沈Q ID NO:5所示的氨基酸序列，或
[0093] (2)将SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加 且具有与SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列相同的催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的 酶活性的由SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0094] 9.编码第8项的酪氨酸酪裂解酶突变体的核巧酸序列。
[00M] 10. -种制备8-径基哇嘟丙氨酸的方法，所述方法包括用第8项的酪氨酸酪裂解酶 突变体催化8-径基哇嘟，生成所述的8-径基哇嘟丙氨酸。
[0096] 3、有益效果
[0097] 本发明旨在通过遗传编码馨合金属离子的非天然氨基酸来拓展蛋白功能，其中馨 合金属离子的非天然氨基酸优选为8-径基哇嘟丙氨酸，目标蛋白优选为巧光蛋白。通过在 超容易折叠绿色巧光蛋白sfGFP，超容易折叠黄色巧光蛋白sfYFP，光转换单体澄色巧光蛋 白PsmOrange和深红色巧光蛋白eqFP650中定点特异地插入8-径基哇嘟丙氨酸后，运几种突 变蛋白的激发/发射波长均出现了不同程度的移动，发射波长均红移30nm左右，尤其是 eqFP650突变体，激发和发射波长分别为622和680nm，运是迄今为止报道的类似绿色巧光蛋 白中远红外区的最大发射波长。运些蛋白突变体均能作为体内成像研究的标记物，增加探 测的灵敏度，进行深层组织成像或者作为巧光能量共振转移传感器。同时，本发明中的 sfGFP-151-町Ala突变体（即，将野生型绿色巧光蛋白sfGFP第151位的氨基酸突变为8-径基 哇嘟丙氨酸化qAla))相比于GFP-151-pyTyr(即，将野生型绿色巧光蛋白GFP第151位的氨基 酸突变为化挫酪氨酸(P^yr)，参见申请号为201210285659.7，发明名称为"3-化挫基酪氨 酸翻译系统及其应用"的专利申请）拥有更强的铜离子结合能力，其对铜离子的亲和力是 GFP-lSl-p^yr的九百万倍，证明8-径基哇嘟丙氨酸比3-化挫酪氨酸更适宜做光诱导电子 传递探针从而研究蛋白中的电子传递。通过进一步的遗传进化，突变体cpsfGFP-66-町Ala 还可W作为锋离子传感器，而锋离子在细胞中发挥着至关重要的作用，敏感特异的锋离子 感应器使得我们能够更深入地研究各种调控机理，如酶催化反应，细胞代谢，基因表达和神 经传递等。
[0098] 另外，由于野生型酪氨酸酪裂解酶无法催化生成8-径基哇嘟丙氨酸，我们通过进 化酪氨酸酪裂解酶巧化），使其可W直接催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸，得到一种 酪氨酸酪裂解酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID N0:5,使用该酪氨酸酪裂解酶突变体只需 一步反应就可W达到40 %的产率，最终能够较容易地获得大量定点插入8-径基哇嘟丙氨酸 的突变蛋白质。与传统的化学法合成相比，该种微生物酶法生物合成非天然氨基酸具有工 艺简单、产量稳定等优点，同时，避免了化学合成过程中所设及到的重金属催化，致癌溶剂 及强酸强碱，并且不需要经过后续复杂的过柱纯化步骤就能够得到大量的目标产物。
【附图说明】
[0099] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0100] 图1是T化突变体(SEQ ID N0:5)催化合成8-径基哇嘟丙氨酸的反应式；
[0101 ]图2是薄层层析法筛选WL突变体；
[0102] 图3是HqAla的HPLC纯化图谱；
[0103] 图4是HqAla的质谱图；
[0104] 图5是正交tRNA、野生型酪氨酷tRNA合成酶、本发明的正交氨酷基-tRNA合成酶、酪 氨酸酪裂解酶(TPL)突变体、巧光蛋白突变体的序列；
[0105]图 6是 sfGFP-66-HqAla 的 SDS-PAGE 电泳图；
[0106] 图 7是 sfGFP-66-HqAla的质谱图；
[0107] 图8是sfGFP-66-HqAla的高分辨率晶体结构图；
[010引 图9:图9A是sfGFP-66-町Ala，sfYFP-66-町Ala，Psm0range-72-町Ala和eqFP650- 67-町Ala的吸收和发射光谱图；图9B是野生型sfGFP，sfYFP，Psm0range，eqFP650和突变体 sfGFP-66-町 Ala，sfYFP-66-町 Ala，Psm0range-72-町 Ala 和 eqFP650-67-町 Ala 的发色团化 学结构示意图；
[0109] 图10:图10A是化M cpsfGFP-66-町Ala加入不同金属离子后的巧光强度；图10B是 表达cpsfGFP-66-町Ala的大肠杆菌细胞分别在加入锋离子前（左上图是共聚焦巧光图，右 上图是可见光图）和加入锋离子后（左下图是共聚焦巧光图，右下图是可见光图）的巧光成 像图；图10C是sfGFP-66-HqAla的结构图；图10D是cpsfGFP-66-HqAla的结构图。
【具体实施方式】
[0110] W下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明 的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0111] 本领域技术人员应该理解，除非特别说明，下述实施例中所用的化学试剂均为可 通过商业途径购得的分析纯级别的试剂。
[0112] 实施例1:8-径基哇嘟丙氨酸化qAla)的生物催化合成（图1-图4)
[0113] 本发明采用生物酶催化的方法，利用从弗氏巧樣酸细菌(ATCC 8090,购自美国典 型培养物保藏中屯、(ATCC))中克隆出的酪氨酸酪裂解酶(1TL)催化8-径基哇嘟合成8-径基 哇嘟丙氨酸，催化反应式见图1。
[0114] 但是实验结果表明，野生型酪氨酸酪裂解酶(T化，氨基酸序列为SEQ ID NO: 11)无 法催化生成8-径基哇嘟丙氨酸。因此，本发明人分析了 T化的晶体结构图，挑选出448位苯丙 氨酸、36位苯丙氨酸和288位甲硫氨酸，引入NNK突变(N=A+T+C+G;K = T+G)，构建成祀t-TPL 突变库来进行WL的定向进化。从突变库挑选出1024个单克隆，用96孔板培养过夜后，加入 溶菌酶裂解细胞，然后加入8-?基哇嘟、氯化锭和丙酬酸钢，37°C解育也用巧立酬薄层色 谱法检测氨基酸的形成。结果表明（图2)，其中一个克隆成功地催化形成了8-径基哇嘟丙氨 酸。测序结果显示，该酪氨酸酪裂解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:5,与野生型TPL (氨基酸序列为SEQ ID N0:11)相比，该突变体的288位由甲硫氨酸突变成了丝氨酸，448位 由苯丙氨酸突变为了半脫氨酸。使用该酪氨酸酪裂解酶突变体只需一步反应就可W达到 40%的产率，最终能够较容易地获得大量定点插入8-径基哇嘟丙氨酸的突变蛋白质。
[0115] 我们将筛选得到的TPL突变体进行放大培养，然后收菌，离屯、，超声破碎，采用儀柱 纯化，得到突变蛋白酶。取30mM乙酸锭、20mM 8-径基哇嘟(购自北京百灵威公司）、60mM丙酬 酸钢、5mM琉基乙醇、50咖憐酸化唉醒和lOmg突变蛋白酶，定容至1L，pH 8.0，然后室溫避光 揽拌7天。收集水相，通过HPLC分离纯化得到白色粉末（图3 )，产率40 %。产物经过质谱检测， 发现其分子量为235Da(图4)，与8-径基哇嘟丙氨酸的理论分子量235Da吻合。
[0116] W上合成反应所需化学试剂如无特别说明，均购自Sigma公司，均为分析纯W上级 别。
[0117] 另外，本领域技术人员应该理解，在本发明中，术语"能够催化8-径基哇嘟生成8- 径基哇嘟丙氨酸的酪氨酸酪裂解酶突变体"不仅包括SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列，还包 括SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化8- 径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的酶活性，所述功能衍生物是将SEQ ID N0:5所示的氨基 酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0:5所示的氨基酸序 列相同的催化8-径基哇嘟生成8-径基哇嘟丙氨酸的酶活性的由SEQ ID N0:5所示的氨基酸 序列衍生的氨基酸序列。
[0118] 实施例2:进化HqAla特异性氨酷基-tRNA合成酶
[0119] 为了在基因中位点特异性插入HqAla，需要在所用的E.coli宿主细胞中引入氨酷 基-tRNA合成酶/tRNA正交对，运个正交对来源于詹氏甲烧球菌（Methanococcus jannaschii)班巧抑制酪氨酷tRNA(MjtRNAGUATyt)/酪氨酷tRNA合成酶(MjTyrRS，野生型，其 氨基酸序列为SEQ ID N0:2)对。MjTyrRS突变库构建在卡纳霉素抗性pBK质粒（购自美国 scripps研究所化ter G. Schultz实验室）中，位于该质粒上E. coli谷氨酷胺合成酶的启动 子和终止子之间。所使用的合成酶突变库为pBk-lib-jwl库，该突变库的构建方法为：在 MjTyrRS 基因上挑选 6 个位点巧7扣2，1^61165，？116108,6111109,439158，和1^611162)引入順1(突 变(N=A+T+C+G;K = T+G)，另外 6 个位点（11663,41曰67，化370^7'114，116159，化1164)或随 机突变为Gly 或保持不变（参见Xie，J. ;Liu，W.S. ;Schultz，P.G.Angew.Chem.， Int.Ed.2007,46,9239-9242；Wang,JY.；Zhang W.；Song WJ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010, 132,14812-14818)。
[0120] 通过正负筛选来进化特异性识别化Ala的氨酷基-tRNA合成酶。正筛选质粒包含 MjtRMcuATyt，TAG突变的氯霉素乙酷转移酶基因，启动表达绿色巧光蛋白的班巧突变的 T7RNA聚合酶，四环素抗性基因。负筛选质粒包含MjtRNAcuATyt，在阿拉伯糖操纵子下的班巧 突变芽抱杆菌RNA酶基因，W及氨节青霉素抗性基因。进行3轮正负筛选:包含有正筛选质粒 的E. coli DH10B细胞作为正筛选寄主细胞。细胞电转pbk-1 ib-jwl库，S0C培养基(2% (W/V) 膜蛋白腺，0.5%(胖八)酵母粉，0.05%(胖八)化(：1，2.5111]\11((：1，10111]\11旨(：12,20111]\1葡萄糖)在 37°C培养1小时。之后换用极限培养基（G顧L极限培养基的配方：M9盐/甘油：764g 化2HP04.7此0或者30g 化2HP〇4，15g KH2P〇4,2.5g 化Cl，5g NH4Cl，50ml甘油，高压灭菌，pH 7.0;1M MgS〇4:高压灭菌；50mM化CI2:高压灭菌；25mM FeCl2:过滤灭菌;0.3M亮氨酸:溶解 于0.3M化0H中，过滤灭菌；1L液体GMML培养基：200ml M9盐/甘油，2ml MgS〇4,2ml CaCl2， 2ml FeCb，1ml亮氨酸)洗两次，铺板固体极限培养基(在液体GMML培养基中加入500ml 3 % 琼脂粉，ImM HqAla，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四环素），37°C培养60小时。收 取细胞，提取质粒DNA，电泳分离，胶回收。然后，将经过正筛选的地K-lib-jwl转化到包含负 筛选质粒的DH10B感受态细胞中。SOC培养基中恢复1小时。之后涂板包含0.2%阿拉伯糖(购 自sigma公司）的LB固体培养基(每升培养基含lOg膜蛋白腺，5g酵母粉，lOg化C1)。37°C培 养8-12小时。共重复3轮。
[0121] 最后一轮正筛选挑384个克隆，分别点板在含有ImM化Ala、氯霉素60,80，100， 120mg/L的GMML固体培养基上，及不包含化Ala、但包含氯霉素0，20，40，60mg/L的GMML固体 培养基。挑选在在ImM町AlalOOmg/L氯霉素的培养基上生长，而在OmM F2Y，浓度大于20yg/ mL氯霉素培养基中不生长的克隆进行进一步验证。最终挑出1个克隆，插入8-径基哇嘟丙氨 酸效率最高，测序表明，克隆所包含的氨酷基-tRNA合成酶突变体化qAlaRS)的氨基酸序列 为沈Q ID N0:4所示，其中突变位点为Y32H，I53V，L6甜，H70G，F108R，Q109V，D158N，L162D和 V164G。
[0122] 本领域技术人员应该理解，在本发明中，除了SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列之 夕h术语"正交氨酷基-tRNA合成酶"或"正交8-径基哇嘟丙氨酸氨酷基-tRNA合成酶"还包括 SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的保守性变体，只要所述保守性变体具有与SEQ ID N0:4所示 的氨基酸序列相同的酶活性即可;并且还包括将SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列经过一个 或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的酶活性 的由SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0123] 实施例3:表达HqAla-绿色巧光蛋白及质谱鉴定
[0124] 将正交tRNA(SEQ ID N0:1)和筛选出来的编码町AlaRS的核巧酸序列(SEQ ID NO: 3)构建到祀VOL载体(购自美国scripps研究所化ter G. Schultz实验室）上，编码超容易折 叠绿色巧光蛋白的核巧酸序列（66TAGKSEQ ID N0:6)构建到祀T2化载体(购自Novagen公 司）上，然后共转化到大肠杆菌化21感态细胞(购自全式金公司）中。挑取单个克隆在至含有 50yg/mL氨节霉素和30iig/mL氯霉素的5ml LB培养基中，37°C培养12小时。然后将1mlW上培 养液在含有W上抗生素的100ml LB培养基中扩大培养，到OD600约等于1.1时，向LB培养基中 加入ImM町Ala，lmM IPTG及0.2%阿拉伯糖(购自sigma公司）培养细胞，对照不加入HqAla。 12小时之后，收菌，Ni-NTA纯化蛋白，并用SDS-PAGE电泳分析(图6)。
[0125] 我们发现，只有在存在HqAla的培养基中才能纯化出全长的超折叠绿色巧光蛋白， 运说明筛选出来的町AlaRS可W特异性的识别HqAla。在LB培养基中町Ala-超折叠绿色巧光 蛋白的产率为20mg/L，而野生型蛋白的产率为lOOmg/L。为了检测町Ala仅仅插入到超折叠 绿色巧光蛋白的66位班巧突变位点，我们对sfGFP-66-HqAla进行了 ESI-T0F质谱检测，检测 结果分子量为27342Da(图7)，与计算的分子量27342Da吻合。
[01%]突变蛋白质sfGFP-66-HqAla的激发和发射波长分别为537和544nm，相比野生型 sfGFP产生了约30皿的红移，我们解析了 sfGFP-66-HqAla的晶体结构（图8)，发现HqAla参与 了 sfGFP蛋白中发色团的形成，且HqAla的哇嘟环和发色团中的咪挫嘟酬环基本共平面，运 为突变蛋白质的红移现象提供了结构基础。
[0127] 实施例4:表达HqAla-巧光蛋白突变体进行激发/发射光谱研究
[0128] 我们用基因工程方法构建了超容易折叠黄色巧光蛋白sfYFP(SEQ ID N0:8)，光转 换单体澄色巧光蛋白PsmOrange(SEQ ID N0:9)和深红色巧光蛋白eqFP650(SEQ ID N0:10) 突变体，然后用实施例3中的相同方法在巧光蛋白突变体的特定定点特异性插入HqAla，表 达产生突变蛋白sf YFP-66-町Ala，PsmOrange-72-町Ala和eqFP650-67-町Ala，然后分别测 量了运些突变蛋白的激发/发射光谱，结果如图9所示，定点特异地插入8-径基哇嘟丙氨酸 后导致运几种突变蛋白的发射波长均红移30nm左右，尤其是eqFP650突变体，激发和发射波 长分别为622和680nm，运是迄今为止报道的类绿色巧光蛋白中远红外区的最大发射波长。
[0129] 实施例5:表达HqAla-绿色巧光蛋白进行铜离子亲和力测定
[0130] 我们用与实施例3相同的方法表达产生了突变蛋白sfGFP-151-化Ala并测定了其 铜离子结合能力。在60mM his-HCLpH 7.0缓冲液中加入liiM sfGFP-151-町Ala和化M Cu (II)，对照不加入Cu(II)，然后进行巧光强度测定。结果显示加入UiM化（II)可导致65%的 巧光泽灭，表明8-径基哇嘟丙氨酸和3-化挫酪氨酸(参见申请号为201210285659.7，发明名 称为"3-化挫基酪氨酸翻译系统及其应用"的专利申请)结合铜离子后均可作为电子受体， 与作为电子供体的GFP发色基团产生光诱导电子传递从而导致巧光泽灭。但是sfGFP-151- 町Ala拥有更强的铜离子结合能力，其对铜离子的亲和力为O.lfM，是GFP-151-p^yr的九百 万倍。
[0131 ]实施例6:表达HqAla-绿色巧光蛋白突变体作为锋离子传感器
[0132] 为了验证sfGFP定点插入HqAla后是否可W作为锋离子传感器，我们在60mM Tris- 肥1，抑7.0缓冲液中加入化M sfGFP-66-町Ala和lOOiiM氯化锋，但是没有检测到任何巧光 信号变化。于是，我们将sfGFP-66-町Ala进行进一步的改造，在蛋白的N末端和C末端分别加 入一段六肤的接头GGTGGS，形成突变蛋白cpsfGFP-66-町Ala(图10C，图10D)，然后再加入氯 化锋，发现巧光信号增强了 7.2倍。接着，我们检测了 cpsfGFP-66-町Ala结合其他金属离子 的能力，往突变蛋白中分别加入lOOiiM的〇1(11)^6(11)，(：〇(11)和化（11)等多种金属离子， 结果如图10A所示，除了锋离子，其他金属离子均没有显著增加突变蛋白的巧光强度，证明 cpsf GFP-66-HqAla可W作为特异性锋离子传感器。
[0133] 为了检测cpsfGFP-66-HqAla在活细胞内是否也可W作为锋离子传感器，我们将 cpsfGFP-66-町Ala和祀0V-町AlaRS质粒共转化到大肠杆菌细胞内，在含有50yg/mL氨节霉 素和30yg/mL氯霉素的培养基中，37°C培养到OD600约等于1.1时，向LB培养基中加入0.5mM HqAla，ImM IPTG及0.2%阿拉伯糖，继续培养12小时之后，收菌，加入lOOiiM Zn(II)，同时W 不加入Zn(II)的菌液作为对照，在巧光显微镜下观察，发现没有加入化（II)的细胞巧光强 度很弱，而加入化（11)后，巧光强度显著增强（图10B)，证明cpsfGFP-66-HqAla在活细胞内 电可有效地结合锋离子。
[0134] 应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求所定义的本发明的精神和范围 的条件下，可W在其中进行各种形式和细节的变化，可W进行各种实施方案的任意组合。
【主权项】
1. 一种酪氨酸酚裂解酶突变体，所述酪氨酸酚裂解酶突变体催化8-羟基喹啉生成8-羟 基喹啉丙氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示。2. 编码权利要求1的酪氨酸酚裂解酶突变体的核苷酸序列。3. -种制备8-羟基喹啉丙氨酸的方法，所述方法包括用权利要求1的酪氨酸酚裂解酶 突变体催化8-羟基喹啉，生成所述的8-羟基喹啉丙氨酸。
【文档编号】C12N15/60GK106047846SQ201610301263
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2013年3月22日
【发明人】王江云, 刘晓红, 李家松, 胡诚, 周庆, 张维, 胡美荣, 周娟作, 江欢欢
【申请人】中国科学院生物物理研究所