一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体构建及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种酶活提高的谷氨酸脱簇酶突变体构建及其应用，属于基因工程技 术领域。
【背景技术】
[0002]谷氨酸脱簇酶（glutamatedecarbo巧lase，GAD，EC4. 1. 1. 15)是生物合成 丫-氨 基下酸（GABA)的限速酶，催化谷氨酸脱簇形成C〇2和GABA。谷氨酸脱簇酶广泛存在于微生 物，动物，人体，W及植物中。异源表达谷氨酸脱簇酶突出的问题是，蛋白表达量低、谷氨酸 脱簇酶活力低。因此，定点突变改造谷氨酸脱簇酶，提高胞外酶活，对于提高谷氨酸脱簇酶 工业化应用前景具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明首先提供了一种酶活提高的谷氨酸脱簇酶突变体，其氨基酸序列是SEQID NO. 1所示的序列。
[0004] 编码所述突变体的核巧酸序列是SEQIDNO. 2所示的序列。
[0005]本发明还提供了表达所述谷氨酸脱簇酶突变体的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌基因 工程菌。
[0006] 所述大肠杆菌基因工程菌的制备方法，是WSEQIDNO. 2所示核巧酸序列为模板， Flprimer(序列如沈QIDNO. 3所示），Rlp;rime;r(序列如沈QIDNO. 4所示）为引物，进 行PCR即得到SEQID^.2所示的重组基因，将重组基因连接到表达载体祀1'-28曰得到重 组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到大肠杆菌基因工程菌。
[0007] 所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的制备方法，是WSEQIDNO. 2所示核巧酸序列为 模板，Flprimer(序列如沈QIDNO. 3所示），Rlprimer(序列如沈QIDNO. 4所示）为引 物，进行PCR即得到SEQIDNO. 2所示的重组基因，将重组基因连接到表达载体PXMJ9得到 重组质粒，重组质粒转化到谷氨酸棒杆菌宿主菌中即得到谷氨酸棒杆菌基因工程菌。
[0008] 本发明在天然谷氨酸脱簇酶的基础上，通过定点突变生物技术改造谷氨酸脱簇酶 分子结构，突变体酶的纯酶液比酶活较突变前提高81 %。突变体酶Y172C的底物亲和力Km 较突变前降低53%，在35°C下酶的半衰期由1化延长至2地。本发明表明172位氨基酸残 基对酶的催化作用和热稳定性有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础， 并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得可用于生物合成丫-氨基下酸。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1含谷氨酸脱簇酶突变体的重组载体的构建
[0010] (1)Y172C突变体的获得：WSEQIDNO. 2所示核巧酸序列为模板，巧rimer(序列 如SEQIDNO. 3所示）、化rimer(序列如SEQIDNO. 4所示）为引物，进行PCR即得到SEQ IDNO. 2所示的重组基因。
[0011] (2)将重组基因与祀T-28a分别用BamHI、EcoRI双酶切，纯化后用Τ4DM连接酶 16°C过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素巧Omg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为祀T-28a-Y172C。测序工作由上海 生工完成。
[001引 （3)将重组基因与PXMJ19分别用BamHI、EcoRI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶 16°C过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素巧Omg/L) LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为PXMJ19-Y172C。测序工作由上海生 工完成。
[0013] 实施例2产谷氨酸脱簇酶大肠杆菌工程菌构建
[0014] 将实施例1得到的重组质粒祀T-28a-Y172C化学法转化入E.coli化21感受态细 胞，具体方法如下：
[001引 （1)转化实验所需培养基如下（g/L):
[001引LB培养基：蛋白腺10,酵母粉5,化C1 10。
[0017] 0)转化方法：
[0018] 将ΙΟμΙ重组质粒祀T-28a-Y172C加入到120μ1感受态E.coil化21中，于冰上 放置45min，42°C热击90s，放置冰上2min，加入800μ1LB液体培养基，37°C摇床培养比，离 屯、，倒掉大部分上清液，留150μL与沉淀混匀，涂布到卡那霉素平板（Km+LB)上，于37°C培 养箱培养化左右，挑去平板上的阳性菌落到10ml液体LB培养基中，37Γ摇床过夜培养。 提取质粒，经酶切验证连接成功后，将重组菌祀T-28a-Y172C/E.coliBL21加入终浓度17% (w/v)的甘油，-20°C冰箱保藏。
[0019] 实施例3产谷氨酸脱簇酶谷氨酸棒杆菌工程菌构建
[0020] 将实施例1得到的重组质粒PXMJ19-Y172C点击法转化入C.glutami州ml3032感 受态细胞，具体方法如下：
[00川 （1)转化实验所需培养基如下（g/L):
[0022]LBG培养基：蛋白腺10,酵母粉5,化C1 10,葡萄糖5。
[002引 似转化方法：
[0024]将 10μL重组质粒PXMJ19-Y172C加入到 120μ1 感受态C.glutamicuml3032 中，于 冰上放置5min，1800V电击5ms，放置冰上2min，加入800μ1LBG液体培养基，37°C摇床培 养化，离屯、，倒掉大部分上清液，留150μL与沉淀混匀，涂布到卡那霉素平板（Km+LBG)上， 于37°C培养箱培养2化左右，挑去平板上的阳性菌落到10ml液体LBG培养基中，37°C摇床 过夜培养。提取质粒，经酶切验证连接成功后，将重组菌PXMJ19-Y172C/C.glutamicuml3032 加入终浓度17% (w/v)的甘油，-20°C冰箱保藏。
[00巧]实施例4重组菌祀T-28a-Y172C/E.coliBL21谷氨酸脱簇酶高效表达及酶活测定。
[0026] (1)将实施例2构建的重组菌祀T-28a-Y172C/E.coliBL21与表达未突变的酶的 对照菌株祀T-28a-gad/E.coli化21分别接种于10血含卡那霉素的LB培养基中，37°C振荡 培养过夜，次日按4%的接种量转接于大肠杆菌发酵培养基中，37Γ培养12h，取发酵液于 4°C、lOOOOr/min离屯、lOmin，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活 力的测定。
[0027] (2)大肠杆菌发酵培养基：蛋白腺lOg/l，酵母粉5g/l，化C1lOg/l，葡萄糖20g/L。 调节抑6. 8-7. 0。
[0028] (3)酶活定义：酶活力单位扣）定义为在测定条件下每分钟产生1μmolGABA所 需的酶量。
[0029] (4)谷氨酸脱簇酶酶活测定方法：谷氨酸脱簇酶（GAD)检测方法采用比色法，取 200μL底物溶液（0. 2mol/L，抑4.8醋酸-醋酸钢缓冲液含k谷氨酸钢0. 4mol/L)和 100μL粗酶液37°C反应一定时间后加入200μL棚酸缓冲液（0. 2mol/l，pH9. 0)终止反 应，再依次加入6%苯酪1. 0血、次氯酸钢溶液400μL，混匀后沸水浴lOmin，立即冰浴冷却 20min至显色，测定光吸收值Aew。
[0030] (4)结果表明重组菌祀T-28a-Y17