专利名称：蓖麻毒素a链突变体的构建及作为候选疫苗抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蓖麻毒素A链突变体的构建及作为候选疫苗抗原，尤其涉及一种 与蓖麻毒素疫苗相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
随着生物技术的快速发展和生物毒素的开发利用，毒素在大规模杀伤性武器中的 重要性已凸现出来，生物毒素及其生物恐怖的威胁与日俱增。蓖麻毒素是由A、B链组成，A 链为效应链，具有RNA N-糖苷酶活性，B链为结合链，介导A链进入细胞内发挥毒性作用。 蓖麻毒素小鼠腹腔LD5tl为3. 0 μ g/kg，其毒性至少是有机磷神经毒剂的380倍。我国为世 界上蓖麻主要生产区之一，生产原料蓖麻籽来源广泛，容易获得，而在许多公开的专业刊物 和互联网上又可轻易得到如何提取制备蓖麻毒素的详细资料，所以，蓖麻毒素的恐怖威胁 不容忽视。针对蓖麻毒素中毒，目前尚无预防疫苗、特异性抗毒素和解毒药。通过分析现有 的研究进展和成果，美军的生防专家认为，疫苗研究是对抗其中毒的有效预防手段。因此， 开展蓖麻毒素疫苗的研究，具有十分重要的军事和社会意义。我国学者对蓖麻毒素生物战剂的侦检和医学防护等研究领域刚刚起步，针对蓖麻 毒素的恐怖袭击尚无配套诊断试剂和有效免疫治疗及防护手段，因此迫切需要建立和发展 具有自主知识产权的检测和防护用品。为了防止敌对势力和恐怖组织使用蓖麻毒素等生物 战剂的袭击，应尽快建立和完善蓖麻毒素等生物战剂的侦检和医学防护系统，保证及时采 取应急措施和对策，将生物恐怖袭击造成的破坏降低到最低限度。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与蓖麻毒素疫苗相关蛋白及其编码基因。本发明提供的蛋白质，命名为mRTA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。上述序列表中的序列2由267个氨基酸残基组成。所述一个或数几个氨基酸残基 的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。mRTA的编码基因mRTA也是本发明保护的范围，为如下1) _3)中任一所述的DNA分 子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述序列表中的序列1由801个核苷酸组成，编码区为序列1自5’末端第1-801位核苷酸。含有所述蛋白质的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本 发明保护的范围。所述重组载体为将所述编码基因插入载体pET-His的EcoR I和Nhe I识别位点 间得到的重组载体。所述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌得到的重组菌。扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物对 的一条引物为序列3所示的DNA分子，另一条引物为序列4所示的DNA分子。本发明的另一个目的是提供一种疫苗，它的活性成分为如下1)-3)中任一一种 1)所述的蛋白质；幻所述的重组载体；幻所述的重组菌。所述蛋白质在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围；所述编码基因在制备疫 苗中的应用也是本发明保护的范围；所述重组载体在制备疫苗中的应用也是本发明保护的 范围；所述重组菌在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围。所述疫苗为蓖麻毒素疫苗，具体为蓖麻毒素A链突变体疫苗。本发明的实验证明，经过点突变获得的突变体mRTA，是通过重组表达得到的蓖麻 毒素A链突变体蛋白，通过A链突变体免疫原的免疫途径、剂量、次数、佐剂等多种不同免 疫方案，分析蓖麻毒素A链突变体的免疫保护效果，结果为该突变体具有低毒性、无血管渗 漏、有良好免疫原性等特点，可以作为候选疫苗抗原。
图1为蓖麻毒素A链突变体纯化2为蓖麻毒素A链突变体的SDS-PAGE电泳3为BCA法测定蛋白浓度标准曲线图4为蓖麻毒素A链突变体对人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用曲线图5为mRTA体内中和实验体重变化图6为mRTA体外中和实验体重变化
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、突变体mRTA的获得1、突变体mRTA的获得根据已有的蓖麻毒素的A链(rRTA)基因序列，其核苷酸序列为序列表中的 序列5，氨基酸序列为序列表中的序列6，采用Quickchange Lighting Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司，Catalog#210518)进行定点突变获得突变体 mRTA-D75AV76MY80A (质粒)，经测序，mRTA_D75AV76MY80A含有的基因命名为mRTA，其核苷 酸序列为序列表中的序列1，编码区为序列表中序列1的自5’末端第1-801位核苷酸序列， mRTA编码的蛋白mRTA的氨基酸序列为序列表中的序列2所示的序列。应用Lasergene软 件预测所构建的突变体的抗原性未发生明显变化。
测序验证突变结果，具体如下将序列5的第2M位的碱基A突变为序列1第2M位的碱基C，序列5的第2 位 的碱基G突变为序列1第2 位的碱基A，序列5的第2 位的碱基C突变为序列1第2 位的碱基G，序列5的第238位的碱基T突变为序列1第238位的碱基G，序列5的第239 位的碱基A突变为序列1第239位的碱基C。将序列6的第75位的氨基酸天冬氨酸⑶突变为序列2的第75位氨基酸丙氨酸 (A)，序列6第76位的氨基酸缬氨酸(V)突变为序列2的第76位的氨基酸蛋氨酸(M)，序列 6第80位的氨基酸络氨酸(Y)突变为序列2的第80位的氨基酸丙氨酸(A)。设计引物1 :RTA Upper :5，~CGCGAATTCGATAACAACATATTCC~3’ (EcoR I)(序列 3)2 :RTA Lower :5，~CTATTGCTAGCGAACTGTGACGATG~3’ (Nhe I)(序列 4)以上述获得的突变体质粒mRTA-D75AV76MY80A作为模板，用引物RTA Upper和 RTALower进行扩增，获得的PCR产物连接至克隆载体pMDIS-T (宝生物工程(大连)有限 公司，产品目录号D101B)得到pMD18T-mRTA(也可人工合成序列1，连接到pMD18_T得到 pMD18T-mRTA。)，再用 EcoR I (NEB 公司，R0101V)和 Nhe I (NEB 公司，R0131V)双酶切 pMD18T-mRTA后回收小片段，与经过同样酶切的表达载体pET-His (孙嗣梅，王景林等.重 组蓖麻毒素A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析.中国生物工程杂志.2005，25 ) 47-51.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)的载体片 段连接，得到的连接产物转入大肠杆菌BL21 (DE3)(北京全式金生物技术有限公司，产品 目录号Dlll(^S)，经筛选后的阳性菌，提取质粒后测序，结果为该质粒为将序列表中序列 1插入表达载体pET-His的EcoR I和Nhe I的识别位点间得到的质粒，将该质粒命名为 pET-His-mRTA，将其对应的阳性菌命名为 BL21 (DE3)/pET-His-mCTA。2.纯化 mRTA将上述获得的BL21 (DE3) /pET-His-mRTA按1 100的比例接种于5ml含 AmpdOOy g/ml)的 NZCYM 培养基(配方每 IL 培养基含Yeast Extract 5g, Casamino Acid lg, NZ 胺 IOg, NaCl 5g, MgSO4 · 7H20 2g, pH 值 7. 0)，37°C，200rpm 培养至 A600 = 0. 6 时，再按1 100的比例转接至500ml同样的NZCYM培养基(并设阴性对照)，同上条件振 荡培养至A6tltl = 0. 6时，诱导组加IPTG至终浓度0. 5mM并补加Amp，然后继续振荡培养，诱 导条件改为18°C，150rpm诱导1 后，lOOOOrpm，4°C离心15min收集表达菌株的菌体，将全 菌沉淀用PBS洗涤三次，再以裂解缓冲液(0. 02M PB,500mM NaCl，50mM咪唑，pH7. 4)重悬 超声破碎后，10000rpm，4°C离心lOmin，收集上清液和沉淀，上清液直接加2XSDS-PAGE凝 胶上样缓冲液(H20、甘油、1.5mM pH6.8TriS、10%溴酚蓝、β -巯基乙醇)，而沉淀用8M的 尿素溶解后加2X SDS-PAGE凝胶上样缓冲液，最后均在100°C煮沸5min，并短暂离心。吸取 20 μ 1样品，进行SDS-PAGE电泳。经15% SDS-PAGE电泳分析，蓖麻毒素A链突变体(mRTA)在上清液有特异性的蛋 白表达，蛋白相对分子量约为32kDa，与预期的蛋白大小相符。将上述获得的上清液进行亲和层析，层析柱为Ni Sepharose High performance 亲和层析柱(GE Healthcare, 17_5M8_01)，洗脱液为含500mM咪唑洗脱液(由PB、NaCl、咪 唑和水组成，其中PB在洗脱液的终浓度为0. 02M、NaCl在洗脱液的终浓度为500mM、咪唑在洗脱液的终浓度为500mM，PH为7. 4)，洗脱流速为2ml/min，当咪唑浓度为300mM时，收集洗 脱峰即为纯化的mRTA，结果如图1所示。将收集的纯化的mRTA经SDS-PAGE电泳分析，结果如图2，其中M为低分子量蛋白 marker, 1-4均为经镍柱纯化后mRTA，可以看出，蛋白相对分子量约为32kDa，蛋白的纯度高 于 98%。采用同样的方法将空载体pET-His转入大肠杆菌BL21 (DE3)得到重组菌 BL21 (DE3)/pET-His,诱导表达得到的蛋白作为对照蛋白，经SDS-PAGE电泳验证没有目的 蛋白表达。采用同样的方法将序列5所示的DNA分子导入载体pET-His中，再转入大肠杆菌 BL21 (DE3)得到重组菌BL21 (DE!3)/pET-His-rRTA，诱导表达得到的蛋白为rRTA (重组蓖麻 毒素A链蛋白(未突变))。实施例2、突变体mRTA的生物活性检测1.突变体蛋白的定量采用BCA法蛋白定量试剂盒(购于北京百泰克生物技术有限公司，Lot#20120613) 对实施例1得到的纯化的mRTA进行定量，实验重复三次，结果取平均值。具体步骤试剂盒组成蛋白标准(5mg/mlBSA)、SolutionA、Solution B。(1)使用时将Solution A摇晃混勻，根据样品数量，按50体积Solution A加1体 积Solution B (50 1)配制适量BCA工作液，充分混勻。(2)完全溶解蛋白标准品(5mg/mlBSA)，用PBS将其稀释至1. 5mg/ml, 1. 0mg/ml, 0. 8mg/ml，0. 4mg/ml，0. 2mg/ml 作为标准品。(3)将上述各浓度的标准品及待测样品分别加到96孔板中。(4)各孔加入200ulBCA工作液，轻轻用加样枪吹打混勻，37°C放置30-60分钟。(5)冷却到室温后，用酶标仪测定A562。(6)根据标准曲线计算出待测样品中的蛋白浓度。结果如图3所示，纯化的mRTA的浓度为1. 83mg/ml (经Ni亲和层析柱纯化以后得 到的目的蛋白)，500ml菌液所得蛋白量为27. 4mgo2、蓖麻毒素A链突变体(mRTA)抗原性分析将由实施例1获得的纯化的mRTA进行^festern印迹分析将mRTA经SDS-PAGE电 泳后转移至醋酸纤维素薄膜上，以抗天然Ricin兔多克隆抗体(制备方法见后述)为一抗， 以辣根酶标记山羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司，观-2301)为二抗，以实施例1获得的 对照蛋白为阴性对照。结果显示在32KDa附近有特异显色带出现，说明所得到的重组突变体蛋白能被抗 天然Ricin兔多克隆抗体所识别，具有良好的抗原性。将由实施例1获得的纯化的mRTA用包被液进行系列稀释，然后进行包被，IOOul/ 孔，以抗天然Ricin兔多克隆抗体为一抗，以辣根酶标记山羊抗兔IgG为二抗，进行ELISA 检测。以天然ricin为阳性对照，实施例1获得的对照蛋白为阴性对照。实验重复三次，结 果取平均值。结果与阳性对照(纯化的天然ricin)相比，2ug/ml以上浓度mRTA包被孔均为强阳性，说明突变体蛋白mRTA能与抗天然Ricin兔多克隆抗体发生特异性的抗原抗体反应， 进一步验证了所获得突变体的正确性。阴性对照没有发生特异性的抗原抗体反应。天然Ricin，其核苷酸及氨基酸的genbank号为X03179，也可以通过如下方法获 得蓖麻籽(蓖麻子，Ricinuscommunis，购自北京秀禾种子公司)勻浆、抽滤、浸提、饱和硫 酸铵沉淀、粗提、亲和层析、离子交换层析，得到纯化的天然ricin。(参考文献余涛，唐吉 军等.一种纯化蓖麻毒素的新方法.生物技术.2005. 15(5) 53-55)抗天然Ricin兔多克隆抗体制备方法用含1 %甲醛的磷酸盐缓冲液对天然Ricin 减毒处理制备类毒素，以类毒素为免疫抗原分4次免疫新西兰纯种大耳白兔，耳缘静脉采 血，以天然Ricin为抗原，用间接ELISA测定效价，效价达到1 IO6后心脏采血。兔血清经 滤膜滤过，加醋酸缓冲液稀释，在酸性条件下，正辛酸沉淀非IgG蛋白，离心取上清液，在中 性条件下置冰浴中饱和硫酸铵，以体积分数为45%饱和度沉淀IgG蛋白，收集沉淀蛋白，透 析、离心、取上清液，经滤膜滤过，按说明书经HiTrapTM rProtein A FF亲和柱纯化抗体。3、突变体蛋白的活性分析通过MTS法测定纯化的mRTA对人肝癌细胞SMMC-7721 (北京兴奥康生物科技有限 公司，AK169711)的杀伤作用，具体如下(1)将人肝癌细胞SMMC-7721计数，调节细胞数至105/ml，制备IOml细胞悬液，加 入96孔板，100 μ 1/孔，即细胞数为IO4/ ？Lo空白孔不加细胞悬液。(2) 5% C02 , 37°C条件下培养 24h。(3)每孔加入100 μ 1用含10%新生牛血清的1640培养基(赛默飞世尔生物化学 制品(北京)有限公司，SH30809.01B)10倍系列稀释的由实施例1获得的纯化的mRTA。阴 性对照孔不加毒素。(4)5% CO2, 37 °C 条件下培养 72h。(5)吸除培养液，PBS洗板三遍，加入100 μ 1无血清培养基，20 μ 1 MTS (CellTiter 961 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Sigma 公司，G3580)，37°C条件下 培养3h。(6)微孔板式酶标仪上测定A490值。(7)计算细胞存活率细胞存活率(％ )=(试验组A490/阴性对照组A490) X 100%。以实施例1获得的rRTA和天然Ricin作为对照。实验重复三次，结果取平均值。结果见图4 所示，mRTA IC50 约为 IX 10_、，天然 Ricin IC50 约为 IX KT11M, rRTA IC5tl约为4X 10_"M，发现突变体蛋白(mRTA)较之未突变前其IC5tl明显升高，说明其毒性明 显减弱，达到预期的突变目的。4、突变体蛋白免疫原性分析(1)免疫接种实验动物采用BALB/c小鼠，雌性，5-6周龄，体重约18-20克(军 事医学科学院实验动物中心，SCXK-(军)2007-004)，每组用20只小鼠。对免疫组小鼠进 行初次免疫，即将PBS稀释由实施例1得到的纯化的mRTA(250 μ g/ml，每只小鼠100 μ 1) 与等量铝佐剂Lnject Alum (Thermo Scientific公司，77161)充分混合后，每只小鼠注射 200 μ 1 (分别采用皮下和肌肉两种免疫方式)，一周后尾静脉取血，37°C孵育池后，6000r/ min离心15min留取血清备用。初免两周后，再进行两次加强免疫，间隔两周，每次免疫后一周均按前述方法取血留血清进行间接ELISA法检测效价。免疫鼠血清效价采用间接ELISA法测定，具体方法如下将定量后的纯化的mRTA 用包被液稀释至5ug/ml，4°C过夜包被酶联板；次日倒掉包被液，以洗涤液洗板3次，2min/ 次；然后加封闭液封闭Ih ;lh后再洗板3次，加入免疫鼠血清(一抗，用稀释液按照1 10， 1 IO2,1 IO3,1 IO4,1 IO5,1 IO6,1 IO7,1 IO8 稀释)，作用 Ih ； Ih 后先洗板， 再加入辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(二抗，用稀释液按1 5000稀释)，作用Ih后；依次加 入显色液A、B,显色5min后加终止液QM H2SO4)，在酶联仪检测0D450。以 PBS 溶液(0. 01mol/L，pH7. 2，每 IL 溶液含 Na2HPO4 ‘ 12H20 2. 86g, NaH2PO4 ·2Η20 0.312g,NaCl 8. 5g)进行注射作为对照。实验重复三次，结果取平均值。mRTA三免以后血清效价达到1 IO6;PBS溶液对照组三免以后ELISA检测为阴性，无特异性抗体产生。(2)免疫小鼠血清的体内中和作用改良寇氏法测定天然Ricin小鼠LD50 :BALB/c小鼠，雌性，20g/只，分为7组，每 组8只，其中一组注射PBS作为阴性对照，其余各组分别经腹腔注射12. 5ng/ml,25ng/ml, 50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml的天然Ricin，观察7天，记录各组死亡率分别为0， 0，0，0，25%，62. 5%，100%，应用公式 log LD50 = Xm-i ( Σ Ρ_0. 5)，计算出 LD5。为 3. 9 μ g/ kg。其中Xm 最大剂量组剂量的对数P:各组死亡率i:组间剂量比的对数η:每组动 物数。20只ELISA抗体效价达1 IO6的免疫后小鼠，分成四组，每组5只，PBS免疫小 鼠为对照组。1-4组分别注入ILD5tl，4LD50,8LD50, IOLD50的纯化的天然Ricin (纯化的天然 Rbrin对小鼠的腹腔注射LD5tl为3. 9 μ g/kg，小鼠的体重按23g/只计算)，注射体积用 PBS (0. 01mol/L, pH7. 2)稀释为0. 5ml/只，注射后观察10天，每天记录小鼠体重变化和死
亡情况。攻毒后一周尾静脉取血，采用上述的间接ELISA法测定抗体效价变化，结果如下 攻毒后一周，测定抗体效价，1-4组血清效价比攻毒前升高，均由1 IO6达到1 107。攻毒后10天，记录小鼠体重，具体结果如表1和图5所示表1 mRTA体内中和实验体重变化
权利要求
1.一种蛋白质，是如下1)或幻中任一所述的蛋白质1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)-3)中任一 所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述蛋白质的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表 达盒。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将权利要求2或3所 述编码基因插入载体pET-His的多克隆位点间得到的重组载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将权利要求4或5所述 重组载体导入宿主菌得到的重组菌。
7.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或任一片段的引物对，所述引物对的一条引 物为序列3所示的DNA分子，另一条引物为序列4所示的DNA分子。
8.一种疫苗，它的活性成分为如下1)-3)中任一一种1)权利要求1所述的蛋白质；2) 权利要求4或5所述的重组载体；幻权利要求4或6所述的重组菌。
9.权利要求1中所述蛋白质在制备疫苗中的应用；权利要求2或3所述编码基因在制 备疫苗中的应用；权利要求4或5所述重组载体在制备疫苗中的应用；权利要求4或6所述 重组菌在制备疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述疫苗为蓖麻毒素A链突变体疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种与蓖麻毒素疫苗相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为mRTA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，经过点突变获得的突变体mRTA，是通过重组表达得到的蓖麻毒素A链突变体蛋白，经过检测，其具有低毒性、无血管渗漏、有良好免疫原性等特点，可以作为候选疫苗抗原。
文档编号C12N15/63GK102079780SQ201010552949
公开日2011年6月1日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者康琳, 王景林, 韩艳辉, 高姗 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所