一种mg53突变体及其突变方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种MG53突变体，其为MG53的N端的RING结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该MG53突变体在保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病方面具有预防/治疗的效果和应用，尤其地，MG53突变体在保护心脏的同时，避免了MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用。
【专利说明】一种MG53突变体及其突变方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种MG53突变体(也可称为MG53蛋白突变体)，以及该MG53突变体在保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病方面的应用，尤其是MG53突变体在保护心脏的同时，避免了同样具有心脏保护功效的MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。
【背景技术】
[0002]MG53 是骨骼肌特异性蛋白 mitsugumin53，简称 MG53;或 TRM72。mitsugumin53(MG53),是一种肌肉特异性tripartite motif family (TRIM)家族蛋白(该家族蛋白常含三个特定模序结构，分别称为RING，Β-Β0Χ，和卷曲结构域。它们共同作用结合在细胞不再需要的蛋白质上，将这些蛋白带上泛素标记以便降解)，也是一种细胞膜修复机制的重要组成部分。
[0003]在医学应用方面，MG53治疗由细胞凋亡引起的心脏疾病的功效已被接受并成为业内前沿领域的公知。MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但是，MG53同时存在着不可忽视并被视为一大危害的负面效果，MG53含量的增加在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用。这是业内所关心的且不希望其正负面作用共存的一个问题，至今没有解决渠道。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种MG53的突变体，为MG53蛋白在其N端的RING结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸(例如丙氨酸)的MG53蛋白突变体。该MG53蛋白突变体在保护心脏的同时，避免了同样具有心脏保护功效的MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。
[0005]MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但之后发现，MG53含量的增加在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。为促进MG53蛋白在保护心脏方面能进一步去劣存优，本申请进行大量的科研工作，最主要目的是对MG53蛋白进一步突变，希望能在不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用等前提下，使突变体保留行使心脏保护功能，但不伴随相应的副作用。
[0006]本发明提供了一种MG53突变体，该MG53突变体为MG53的N端的RING结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该7个半胱氨酸分别是在RING结构域的第14位点、第17位点、第29位点、第34位点、第37位点、第53位点、第56位点。
[0007]上述这7个半胱氨酸都是MG53的RING手指区的重要结构，而RING手指区是其行使E3连接酶活性、降解其底物、以及引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用所必需的，因此发明人选择了这7个半胱氨酸作为研究对象。
[0008]实验和事实证明，该7个半胱氨酸的任意一个或者两个或两个以上的组合突变为非极性氨基酸都能达到本发明的预期目的和有益效果。
[0009]本发明提供的上述MG53蛋白突变体在保护心脏的同时，能够避免MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用，且心脏保护作用却不受任何影响。
[0010]上述的MG53突变体中，所述的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或蛋氨酸。优选地，非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。最优选地，该非极性氨基酸为丙氨酸。
[0011]当上述MG53突变体中非极性氨基酸为丙氨酸时，所述的MG53突变体选自MG53C14A, MG5 3C17A, MG53C29A、MG53C34A、MG53C37A、MG53C53A、MG53C56A 中的任一。
[0012]本发明所述的MG53突变体，其序列的属种包括灵长类动物、大鼠和小鼠。
[0013]在优选实施例中，本发明提供的MG53突变体，其为MG53蛋白突变体，该突变体的N端的RING手指区域的第14位是丙氨酸，即，MG53蛋白的N端的RING手指区域的第一个半胱氨酸被丙氨酸替代后突变成为本发明的MG53突变体，由于MG53蛋白中该半胱氨酸位于第14位，取而代之的丙氨酸也在14位，也就是说，本发明的MG53突变体为MG53C14A。
[0014]通过大量实验研究，发明人惊喜地发现，MG53蛋白第14位点的C (半胱氨酸)，是MG53引起胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病所必需的，即，第14位C突变的MG53(MG53C14A)不能引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。而MG53C14A却仍然能够保护心肌细胞的损伤(科研实验过程中有可靠的实验数据能够支持这一发明点)，也就是说MG53C14A能够在不引起胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用等前提下，行使心脏保护功能。这正是发明人希望得到的出乎意料的有益效果。若有需要，这些证明效果的药理实验将在本发明随后部分予以奉上，以提供本论点也是本发明的创造性的实验数据的具体支持。
[0015]以下部分，本发明以丙氨酸为例，来阐述MG53突变体，需要说明的是:本发明中半胱氨酸突变可选的不仅仅是A (丙氨酸)，还可以是8种非极性氨基酸中的任意一种，例如甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸或异亮氨酸，同样可起到MG53突变后不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用等前提下，行使心脏保护功能的效果。由于篇幅所限，仅以A做最优选实施例，其他非极性氨基酸的突变方法与丙氨酸相同，在此不再赘述。
[0016]MG53 是 TRIM 家族(The superfamily of tripartite motif-containingproteins)中新发现的一个蛋白质，与其他家族成员不同，它只在骨骼肌和心肌表达。初期的研究表明，在骨骼肌和心肌中MG53能够作为一种结构蛋白促进细胞膜损伤的修复，同时也能够调节细胞内小泡的转运和骨骼肌细胞再生；另外在心肌中，MG53还通过介导Caveolin-3与PI3K的结合，激活再灌注损伤救援通路(reperfusion injurysalvagekinase pathway, RISK pathway),进而在心脏缺血预处理中发挥重要保护功能。本发明人通过实验证明，蛋白质免疫印迹实验可以得出这样的结论，骨骼肌MG53在多种胰岛素抵抗的动物模型中表达量显著上调，提示MG53很可能参与骨骼肌胰岛素抵抗的发生发展过程。
[0017]进一步地，通过氨基酸序列分析，发明人发现MG53蛋白是由公认具有E3连接酶活性的RING结构域(也可叫做RING手指区域)、B-box结构域、Coiled-coil结构域和SPRY结构域组成。从MG53氨基酸序列分析的结果来看，只有RING结构域是公认的含有E3泛素连接酶活性的结构域，因此，发明人认定MG53的E3泛素连接酶活性就在RING中。RING结构域内部锌指结构中第一个结合锌原子的半胱氨酸，即野生型小鼠MG53氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，是维持RING结构域E3泛素连接酶活性的关键所在。于是发明人构建了两个可能导致MG53的E3泛素连接酶失活的突变体，一个是缺失RING结构域的MG53(ARING-MG53)，另一个是氨基酸序列第十四位突变为丙氨酸的MG53 (C14A-MG53)。当比较这两个突变体与正常的MG53对IRSl泛素化的影响时，发现只有正常的MG53能够有效地泛素化胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物I (IRS1)，ARING或C14A都不具备这一功能。这也完全证明MG53的RING结构域，特别是氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，对于MG53催化IR和IRSl泛素化是必需的。
[0018]上述这个重要发现引导着发明人对MG53在骨骼肌胰岛素抵抗中的潜在作用进行了深入研究。这样的科研思路和大量实验数据决定了本发明不是科学猜想或是科研臆断，而是一种真正可以产业化的科研成果，一种真正的发明创新。
[0019]为进一步探讨MG53致IR和IRSl降解在MG53负调控肌肉胰岛素信号通路中的作用及弄清被MG53泛素化的IR和IRSl的具体降解途径，发明人进行了研究。在C2C12肌管中分别过表达正常的MG53及它的两个突变体，比较它们对胰岛素信号的影响。结果发现，只有能降解IR和IRSl的正常MG53才能够抑制胰岛素信号通路，而失去E3泛素连接酶活性的两个突变体，尤其是C14A，即使只有一个氨基酸突变，也不能行使其抑制胰岛素信号的功能。
[0020]也就是说，本发明的前期科研实验得到的结论是:第一，肌肉特异性蛋白MG53异常高表达是胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征发生发展的重要原因；第二，第一次在整体水平和细胞水平证明了 MG53是IR和IRSl的E3泛素连接酶，它通过泛素-蛋白酶体途径降解骨骼肌IR和IRS1，是造成机体胰岛素抵抗状态所必需的，同时通过引起机体的胰岛素抵抗，进一步造成肥胖、糖尿病和代谢综合征的发生。第三，还可以再进一步做以关联构想。
[0021]E3是参与蛋白质泛素化反应的唯一可控成分。按介导泛素与靶蛋白的结合方式不同，E3可分为两大类:含RING (really interesting new gene)结构域的E3和含HECT(homologous to E6_associated protein C terminus)结构域的 E3。前者同时与装载泛素的E2和靶蛋白结合，将泛素直接转移到靶蛋白上；后者先将泛素从E2转移到HECT结构域的一个半胱氨酸活性位点上，再将硫脂化的泛素转移到靶蛋白上。泛素由76个氨基酸组成，其中散布着7个赖氨酸残基，即，本发明涉及的7个半胱氨酸，这些残基可以作为其他泛素共价结合的位点。经过几轮结合后，泛素链将会变得很长，这样有助于对“标记”的识别。一般认为，由48位赖氨酸介导结合的泛素链聚合体是介导靶标蛋白质经蛋白酶体降解的经典引导信号，由63位赖氨酸介导结合的泛素链聚合体将介导靶标蛋白质进行其他的非降解功能。然而，这一观点近来有被打破的趋势。泛素化的靶标蛋白质在泛素结合域(Ubiquitin-binding domains, UBDs)的作用下定位于26S蛋白酶体,经去泛素化和解折叠等程序，最终被水解。随着科学研究的不断深入，在大多数胰岛素靶器官中，人们已经基本认清胰岛素信号网络的大致骨架结构，即IR/IRSs-PI3K_Akt通路；然而，对于影响此信号途径的具体分子机制，人们的研究目前却刚刚起步。正如本发明人在科研实验中发现的，在胰岛素信号的调控中，除去广泛的磷酸化修饰调控以外，蛋白质降解对于胰岛素信号传递的影响也是巨大的。早在胰岛素抵抗研究的初期，人们就在胰岛素抵抗的病人或动物模型中观察到，IR和IRSl在酪氨酸磷酸化普遍受抑制的同时，存在其蛋白含量的下降。直到近些年，人们才对IRSs的蛋白质降解得到了一些认识，比如，S0CS1/3作为culling-RING类泛素连接酶的底物识别分子，通过与IRSl和IRS2结合，介导了它们的泛素化降解。后来人们又发现SOCSs能在多种炎症因子的刺激下显著上调，结合大量临床和动物模型的证据，人们意识到肥胖和II型糖尿病实质上是一种炎症状态，而各种炎症因子在胰岛素抵抗的发生中起了重要作用。除此之外，也有证据表明在某些组织细胞中Akt及其下游分子也可能成为UPS的靶标，发生降解从而影响葡萄糖转运和糖异生。然而对于胰岛素抵抗中IR的降解机制，至今仍然有待进一步研究。
[0022]简而言之，本发明在诸多试验数据的支持下，得到了 MG53蛋白突变体，其为MG53蛋白在其N端的RING结构域的7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸被丙氨酸替代的突变体。该MG53蛋白突变体是MG53C14A、MG53C17A、MG53C29A、MG53C34A、MG53C37A、MG53C53A、MG53C56A 中任一，本发明最优选的 MG53 突变体是 MG53C14A。
[0023]本发明提供了一种MG53蛋白突变体的突变方法，该方法在于，利用定点突变试剂盒对野生型MG53质粒的全长序列进行定点突变，得到所述的MG53突变体。该试剂盒是北京全式金公司的 Easy Mutagenesis System。
[0024]即，上述改造方法或突变方法是利用定点突变试剂盒(北京全式金公司的EasyMutagenesis System)对野生型MG53质粒的全长序列进行突变,得到第14位的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的MG53突变体；当该非极性氨基酸为丙氨酸时，即可得到第14位的半胱氨酸突变为丙氨酸的MG53蛋白突变体，该MG53蛋白突变体为MG53C14A。
[0025]同样地，发明人 也做了半胱氨酸突变为甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸等其他非极性氨基酸的实验，突变方法同上，同样得到了 MG53C14G、MG53C14L、MG53C14P、MG53C14V、MG53C14I。
[0026]在本发明的具体实施例中，所述的改造方法即定点突变的过程为:
[0027](I)先设计突变引物，使上下游引物都带有突变位点，重叠区域为18_27bp ；
[0028](2)以突变质粒作为模板，使用DNA聚合酶，用特异性突变引物进行PCR反应扩增，反应产物用琼脂糖凝胶鉴定；
[0029](3)利用DpnI进行酶切反应处理PCR产物；
[0030](4)转化大肠杆菌感受态细胞T0P10，融解感受态T0P10，加入处理后的PCR产物，冰上孵育，加入LB,孵育，涂氨苄抗性LB平板，培养，挑取平板上的单菌落，DNA测序检测得突变结果为阳性，即是。
[0031]上述步骤(1)所述的重叠区域优选20bp。
[0032]在另一优选实施例中，为了得到Flag-C14A MG53质粒，在Flag_MG53质粒的基础上，利用QuikChange II点突变试剂盒，将MG53氨基酸序列的第十四位半胱氨酸突变成丙氨酸。
[0033]在本发明又一优选实施例中，上述突变过程是:
[0034]1、首先设计突变引物，使上下游引物都带有突变位点，并且重叠区域为18~27bp。
[0035]2、以突变质粒200ng作为模板，使用高保真DNA聚合酶，用特异性突变引物进行PCR反应扩增。反应产物用琼脂糖凝胶鉴定。
[0036]PCR反应条件如下:
[0037]95 0C IOmin (分钟)
[0038]950C 30sec (秒)
[0039]550C 30sec (秒) 20 Cycles (SP，20 个循环)
[0040]72°C 3.5sec (秒)
[0041]72 °C 5min (分钟)
[0042]4°C Hold (维持)
[0043]3、利用DpnI进行酶切反应处理PCR产物，反应条件如下:10uL PCR产物加入IuLDpnI，37°C处理过夜。
[0044]4、转化大肠杆 菌感受态细胞T0P10:融解感受态T0P10，加入处理后的PCR产物，放在冰上孵育30分钟，42oC热刺激60秒，加入LB, 37oC孵育45分钟。涂氨苄抗性LB平板。37oC过夜培养16小时。
[0045]5、挑取平板上的单菌落，DNA测序检测突变结果。
[0046]参考:Stratagene的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit
[0047]北京全式金公司Easy Mutagenesis System,说明书可参见如下公开内容:http://www.transgen.com.cn/uploadfiIe/201111/20111109161357731.pdf.[0048]本发明的MG53蛋白突变体的改造方法也可参见市售可得到的北京全式金公司的Easy Mutagenesis System (试剂盒)的说明书,其对突变改造方法和步骤均有详细的说明记载。
[0049]本发明还提供了上述的MG53突变体(即MG53蛋白突变体)在制备治疗心肌细胞损伤相关疾病的药物中的用途。
[0050]上述的MG53突变体的用途，其中所述的治疗心肌细胞损伤的药物还包括治疗/预防心脏缺血、再灌注损伤所致疾病的药物；上述疾病进一步还包括心肌细胞缺损、心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂等的药物。
[0051]本发明尤其提供了 MG53突变体为MG53C14A时，即，MG53C14A在制备治疗心脏损伤或心肌损伤的药物中的用途。
[0052]关于MG53在治疗心脏损伤/心肌损伤中的应用，以及其在治疗/预防心脏缺血、再灌注损伤所致疾病中的用途，可参见200910241451.3公开的药学实验部分的实验方法和实验数据。
[0053]在心肌细胞中过表达MG53或者MG53C14A，都能够对缺氧引起的心肌细胞的损伤
产生保护作用。
[0054]众所周知，胰岛素抵抗是肥胖、2型糖尿病等多种代谢障碍疾病的根本致病因素之一。虽然骨骼肌在胰岛素刺激引起的糖利用中占70-90%，但是人们对肌肉胰岛素抵抗的具体机制至今仍所知甚少。本发明以下实验部分先证实，在小鼠中，骨骼肌特异性蛋白mitsugumin53 (即本发明所述的MG53)介导了胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物I (IRSl)的降解。当上调MG53时，引起以胰岛素抵抗、肥胖、高血压、脂代谢紊乱为表征的代谢综合征。在胰岛素抵抗动物模型中，MG53表达水平显著升高；MG53过表达可以导致肌肉胰岛素抵抗，继而引发代谢综合征。相反，通过保护IR和IRS1，保持胰岛素信号通路完整性，MG53的敲除成功阻止了饮食诱发的代谢综合征的发生。在机制上，MG53作为E3连接酶，泛素化胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物I (IRS1)，导致二者通过泛素依赖的途径降解，构成骨骼肌中控制胰岛素信号强度的主要机制。这些发现确切地证实MG53是一个治疗代谢紊乱和相关心血管并发症的新靶点。
[0055]代谢综合征包含胰岛素抵抗、中心型肥胖，脂代谢紊乱和高血压等一系列的病征，其流行病比率正在增加，已经成为人类健康的重大威胁之一。代谢综合征使心血管疾病发生几率上调2倍，2型糖尿病发生几率上调5倍。胰岛素抵抗是包括代谢综合征、肥胖、2型糖尿病在内的众多代谢紊乱疾病的根本病因。因为骨骼肌在胰岛素刺激引起的糖利用中占70-90%的比例，骨骼肌中胰岛素抵抗可能是代谢综合征和2型糖尿病的主要致病机理。确实，纵向研究提供证据表明骨骼肌胰岛素抵抗是代谢综合征和2型糖尿病病理过程的最早期步骤。然而，人们对骨骼肌胰岛素抵抗背后的机制所知甚少。
[0056]在MG53保护小鼠抵抗饮食诱导的代谢综合征的实验中，用western blots检测骨骼肌中MG53含量平均值(胰岛素紊乱和代谢疾病大鼠、非人灵长类模型，与年龄性别对应的对照相比)，数据与GAPDH相比后标准化，结果表明，在高脂喂养诱导的肥胖小鼠、db/db糖尿病模型小鼠、自发性高血压大鼠和非人灵长类代谢综合征模型中，MG53丰度均上调。在肥胖人类个体中，MG53水平上调也被实验证实(图暂欠奉)。这些结果为未曾预料到的MG53和代谢疾病之间的联系提供了重要线索。
[0057]为了确定MG53在代谢综合征致病过程中的必要性，从小鼠出生3周起，发明人开始跟踪监测MG53敲除(MG53-/-)小鼠和对应的野生型同窝出生仔在高脂饮食(60%热量来自脂肪)和普通饮食情况下的体重和代谢指标变化。在3-38周内，正常饮食情况下，与野生型小鼠相比，MG53敲除小鼠体重、血压、血清胆固醇、甘油三酯，都没有明显变化。然而，在不改变血清胰岛素水平的情况下，MG53敲除小鼠血糖含量明显减少(在38w检测)。
[0058]在高脂喂养情况下，MG53敲除小鼠和野生型小鼠有显著不同。经过35周的高脂喂养，野生型小鼠MG53水平上调，发生了以肥胖和高血压、高血糖、高胰岛素、脂代谢紊乱、肝脂肪化为特征的代谢综合征。值得注意的是MG53敲除小鼠不会发生高脂喂养引发的代谢紊乱。与正常饮食喂养的野生型和MG53敲除小鼠相比，经过35周高脂喂养MG53敲除小鼠的血压、血糖、血清胰岛素、血脂(胆固醇和甘油三酯)水平相当。MG53缺失也显著减弱了高脂喂养诱导的肥胖，脂肪肝骨骼肌脂肪积聚，脂肪细胞肥大，白色和棕色脂肪含量上调。
[0059]为探究全身性胰岛素敏感性与代谢综合征发生之间的关系，在饮食干预后的不同时间点进行了葡萄糖耐量试验(GTTs)和胰岛素耐量试验(ITTs)。给予高脂饮食的野生型小鼠在7周时表现出葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，即，该现象早于11周时肥胖的发生。随着高脂饮食的继续喂养，野生型小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗逐渐加剧。35周后，高脂饮食导致了胰岛的代偿性肥大、血清胰岛素水平较本底升高7倍，致使葡萄糖刺激胰岛素分泌障碍。
[0060]但是，MG53敲除小鼠在高脂饮食下没有表现出上述任一表型，而是维持着正常的血糖和胰岛素水平，即便在经过高脂饮食30周后，MG53敲除的小鼠，未出现野生型小鼠中的胰岛素抵抗(糖耐量和胰岛素耐量)<^653敲除小鼠的胰腺形态变化和胰岛素分泌反应也明显改善。因此，MG53的敲除可保护小鼠免于高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和代谢紊乱，以上表明，MG53为高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和代谢综合征发生所必需。[0061]为进一步确定MG53的上调是否足以引发代谢紊乱，发明人构建了过表达MG53的转基因小鼠(MG53Tg)。在38周龄时，其MG53蛋白水平于骨骼肌中升高2.6+0.3倍，于心脏中升高2.6+0.7倍。然而，在MG53转基因小鼠的非肌肉组织(肺、脑、下丘脑、肝、肠、肾、内脏脂肪和睾丸)，并没有检测到MG53，这说明MG53的表达受到一种肌肉特异性方式的严格调控。即使在没有饮食干预的情况下，38周龄的MG53转基因小鼠出现肥胖和高血压，并伴随着血脂异常、高胰岛素血症肥胖和禁食后血糖水平升高。与同窝出生的野生型小鼠相t匕，MG53转基因小鼠的昼夜能量消耗明显降低，但日摄食量不变。值得一提的是，葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验显示，MG53转基因小鼠的糖代谢和胰岛素敏感性存在严重的损伤，并伴随着胰岛肥大和葡萄糖刺激胰岛素分泌的障碍。解剖学和组织学数据进一步显示，MG53转基因小鼠出现了中心性肥胖、脂肪肝、脂肪细胞肥大和骨骼肌内脂质沉积。这些数据表明，MG53的上调对于引发胰岛素抵抗和进一步发展为代谢综合征既是必要的也是充分的。注:MG53的敲除阻断了饮食诱导的全身胰岛素抵抗相关实验中，野生型和MG53敲除小鼠，给予正常饮食或高脂饮食后在指定时间点进行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验。胰腺用苏木精和伊红染色。葡萄糖(按2克每千克体重腹腔注射)刺激下血清胰岛素的浓度变化。野生型和MG53敲除小鼠均给予正常饮食或高脂饮食35周。所有数据均显示为平均值+/-标准误。
[0062]胰岛素刺激时，胰岛素受体的内在酪氨酸激酶活性可引起受体自身的酪氨酸15位自磷酸化。随后招募并磷 酸化胰岛素受体底物如胰岛素受体底物I (IRS1)、胰岛素受体底物2 (IRS2)，并激活下游的磷酸肌醇-3-激酶，以调节骨骼肌的葡萄糖稳态。为探究MG53介导的胰岛素抵抗的分子机制，发明人检测了 MG53可能调控的位于胰岛素受体-1RSl-PI3K-Akt-GSK3-13途径的信号分子。在胰岛素抵抗和代谢紊乱的MG53转基因小鼠模型中，骨骼肌内由胰岛素刺激引起的胰岛素受体(β亚基)和IRSl的酪氨酸磷酸化，以及Akt473位丝氨酸的磷酸化均被阻断。同时，这些小鼠骨骼肌中，胰岛素受体和胰岛素受体底物I的蛋白表达水平显著减少，但其mRNA水平保持不变。为区别MG53过表达的直接效应和代偿性反应，同时采用腺病毒转染系统，过表达MG53基因于培养的C2C12肌管细胞。MG53升高表达了 3.5±0.2倍，并显著降低了胰岛素受体和IRSl的蛋白水平，但其mRNA水平不变。MG53的过表达也阻断了胰岛素诱导的胰岛素受体、IRSl，Akt和GSK3-0的活化，这表明在细胞水平上调MG53成功模拟了 MG53转基因小鼠的典型特征。因此，发明人的体内和体外实验数据均证实MG53的上调表达足以同时降低胰岛素受体和胰岛素受体底物从而抑制胰岛素信号转导的这两个关键步骤。注:在过表达MG53引发全身胰岛素抵抗和代谢综合征的试验中，通过野生型和MG53转基因小鼠的体重、及38周龄的野生型和MG53转基因小鼠的收缩压和舒张压、血清胆固醇、甘油三酯、血清胰岛素及在禁食和进食状态的血糖水平，及30周高脂饮食喂养的野生型和MG53敲除小鼠的葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验、38周龄的野生型和MG53转基因小鼠胰腺、38周龄的野生型和MG53转基因小鼠葡萄糖(按2克每千克体重腹腔注射)刺激下的血清胰岛素的浓度变化，或其相对于基线的变化百分比来做实验指标和数据进行统计。
[0063]高脂饮食喂养的野生型小鼠MG53表达量增高，和MG53过表达一样，骨骼肌胰岛素信号被严重抑制了，同时IR和IRSl蛋白水平降低，mRNA水平不变。此外，伴随着MG53上调，IR和IRSl后下调在各种用于研究的胰岛素抵抗啮齿类模型中是一个普遍的现象，就像肥胖或2型糖尿病动物模型和人一样。在其他实验中，还证明了即使在高脂饮食导致的代谢压力下，MG53缺失可以使小鼠维持IR和IRSl的完整性以及全身的胰岛素敏感性。特别地，在MG53敲除小鼠中高脂饮食无法降低IR和IRSl的丰度。实际上，MG53基因水平的缺失会使骨骼肌中IR和IRSl的显著积累，可能导致MG53敲除小鼠相对于其同窝野生型对照血糖水平降低。相对于野生型正常饮食小鼠，MG53敲除小鼠因胰岛素引起的IR、IRSUAkt和GSK3-0磷酸化会显著增加。因此，MG53上调对于高脂饮食和代谢疾病引起的骨骼肌IR和IRSl下调看起来必不可少。
[0064]之后，寻找决定MG53介导的骨骼肌特异的胰岛素抵抗发展成为全身的代谢紊乱的原因。为了该目的，发明人跟踪了 MG53TG小鼠和高脂饮食喂养的野生型小鼠多种器官代谢紊乱发生的不同时期。结果显示通过过表达MG53和高脂饮食诱导骨骼肌胰岛素抵抗远早于全身代谢紊乱的发展(包括肥胖和多器官胰岛素抵抗)。6周龄的MG53TG体重和野生型对照类似，但是肌肉的胰岛素信号明显被损伤了，而肝脏和腹部脂肪的胰岛素信号却没有变化。同样的，高脂饮食喂养I周的野生型小鼠会导致MG53显著上调和骨骼肌胰岛素信号损害，这在高脂7周之后才出现的系统性葡萄糖胰岛素不耐受和11周出现明显的肥胖之前。这之后，正常饮食的MG53TG小鼠(38周)和高脂饮食的野生型小鼠(高脂喂养35周)的肝脏和脂肪组织才发展为完全的胰岛素抵抗。这些数据和MG53缺失对于代谢紊乱重要的保护作用一起，强烈说明MG53介导的骨骼肌胰岛素抵抗在病理发生过程是一个重要的因素。与之前的发现一致的是，在人和动物模型上的研究也揭示了肌肉胰岛素信号降低在肥胖和葡萄糖不耐受病理过程中是一个重要的环节。注:MG53调节的胰岛素信号的相关实验，用代表性的和平均western blots数据显示38周野生型和MG53转基因小鼠或正常饮食或高脂饮食喂养的MG53敲除小鼠和他们的野生型同窝小鼠胰岛素诱导的IR-β和IRSl的酪氨酸磷酸化，Akt丝氨酸磷酸化和他们的总蛋白水平。磷酸化蛋白和总蛋白相对于GAPDH标准化，呈现为其相对于野生型本底的倍数。代表性的western印记和统计数据显示胰岛素引起6周、38周野生型和MG53转基因小鼠骨骼肌、肝脏、腹脂Akt的磷酸化。
[0065]因为IRSl是IR和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)信号通路共同的节点，发明人还研究了 MG53对于肌肉除胰岛素信号之外IGF-1信号的影响。通过比较不同剂量胰岛素或IGF-1诱导的野生型和MG53缺陷小鼠骨骼肌IRSl酪氨酸磷酸化，发明人发现MG53优先把在胰岛素信号中的IRSl作为目标。特别地，尽管MG53缺失增加了胰岛素刺激的IRSl酪氨酸磷酸化的剂量效应，这加强了 IGF-1在高浓度的效果，而不是低浓度的IGF-1。如果MG53选择性的把胰岛素受体介导的IRSl信号作为目标，那么MG53调节IGF-1受体信号应该归功于胰岛素受体和IGF-1受体的异二聚化或高剂量IGF-1引起的胰岛素受体交叉激活。
[0066]由于MG53在氨基端包含一个经典的E3泛素化连接酶RING finger结构域(或称RING手指区域，或RING结构域)，发明人提出MG53可能作为一个肌肉特异的E3泛素化连接酶作用胰岛素受体和IRSl进行泛素依赖的降解。多种证据支持这个假设。首先，免疫共沉淀揭示了内源性MG53和胰岛素受体、IRSl之间有物理相互作用，在HEK293细胞外源性表达MG53和IR、IRSl也是如此。其二，在MG53TG小鼠骨骼肌中，过表达MG53可以提高IR和IRSl的泛素化。另外 ，高脂饮食增加了野生型小鼠骨骼肌胰岛素受体和IRSl的泛素化，而不是MG53敲除。现有的结果证明了 MG53 E3泛素化连接酶促进了泛素依赖的骨骼肌IR和IRSl降解，尽管在(FBX040是肌肉特异性的)某些特定的细胞培养系统和组织其他一些E3连接酶和IRSl降解有关。相反的，无论是MG53过表达还是敲除，与血糖稳态有关骨骼肌IRS2、GLUT1或GLUT4的蛋白丰度却没有改变，说明他们不是MG53的底物。
[0067]根据以前对其他RING类型E3连接酶的了解，序列分析预测到MG53 N端的RING手指区域中的半胱氨酸丰富区，尤其是7个半胱氨酸，特别是第一个半胱氨酸(半胱氨酸14，能与锌离子结合)可能是MG53作为E3连接酶功能的关键位点。的确，RING手指区的删除或者半胱氨酸位点的丙胺酸突变替换能够彻底的去除或者明显地缓解MG53对IR和IRSl的泛素化程度。需要注意的是，与野生型MG53不同，这些MG53突变体既没有影响IR和IRSl的总蛋白量，也没有影响胰岛素促使的IR-1RSl-AKT-GSK3i3信号途径的激活。因此，在分子水平，RING finger区是MG53实现E3连接酶功能所必需的。而且，利用clasto-lactacystin- β -lactone ( β -lac)对蛋白酶体抑制能够彻底的去除MG53引起的IR和IRSl蛋白的下调，并恢复IR和IRSl酪氨酸的磷酸化，以及AKT的丝氨酸473的磷酸化，还有胰岛素引起的葡萄糖摄取，这证明了 MG53介导的胰岛素信号通路的抑制是通过蛋白酶体系统。在利用MG132，另一种蛋白酶体抑制剂的实验中也得到了类似结果。总之，我们的体内实验和体外实验的实验结果证明，MG53是一个新的E3连接酶，它能够通过泛素依赖的降解，直接调节IR和IRSl的蛋白稳定性。这个发现证实了 MG53能够同时下调IR和IRSl，是一个解释全身胰岛素抵抗和代谢疾病的潜在机制，而RING手指区域中的半胱氨酸是MG53介导IR和IRSl降解，产生胰岛素抵抗，发生全身肥胖和代谢性疾病所必需的。
[0068]归纳起来，尽管MG53作为膜修复和心肌保护已经众所周知，发明人在这里展示了 MG53是一个在胰岛素抵抗和代谢紊乱的动物模型中普遍高表达的，并且这种骨骼肌特异性的MG53高表达做为启动全身胰岛素抵抗和代谢综合症是必需的。MG53作为一个新的肌肉特异性E3连接酶能够导致IR和IRSl的泛素依赖性降解，成为了一个决定性的骨骼肌胰岛素信号的负向调节者，从而引起全身的胰岛素信号及代谢的缺陷。而RING手指区域中的半胱氨酸是MG53发挥 上述代谢相关作用必需的，突变RING手指区域中的半胱氨酸能够使MG53丧失引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的作用。
[0069]这些发现不仅定义了 MG53是一个骨骼肌胰岛素敏感性的负向调节者，还建立了MG53介导的肌肉胰岛素信号抑制是一个导致全身胰岛素抵抗和代谢综合征的重要的机制。这也标志着MG53 E3连接酶能够被作为一个治疗各种代谢疾病，包括肥胖、2型糖尿病和相关的心血管并发症的重要潜在靶点。
[0070]实验方法总结:
[0071]试剂和材料:PY100，p-Akt，p-GSK3-0以及 IRSl 的抗体均来自 Cell SignalingTechnology公司；MG53和GLUTl的抗体来自Abcam公司；p-1R_i3和IRSl的抗体来自Upstate 公司；IR_i3, GAPDH, GSK3- β 和 GLUT4 的抗体来自 Santa Cruze Biotechnology公司；MG132, clasto-lactacystin β-lactone (β -lac), ant1-b-actin，Flag, Myc andinsulin 抗体来自 Sigma-Aldrich 公司。2-(N_(7-nitrobenz-2-oxa_l，3-diazol -4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG)来自Invitrogen公司。人的膜岛素样生长因子-1(IGF-1)来自PeproTech公司。如无特别说明，其他化学试剂均来自Sigma-Aldrich公司。
[0072]胰岛素抵抗的动物模型:糖尿病(db/db)小鼠(年龄为25周的雄性糖尿病小鼠)和对照组瘦小鼠来自Jackson Laboratory公司。自发性高血压大鼠(年龄为12个月的雄性自发性高血压大鼠)和同源同龄雄性正常血压大鼠来自北京市维通利华公司。自发性胰岛素抵抗和代谢综合征的非人灵长类动物模型的开展和鉴定在之前的文献中已有报道。
[0073]MG53基因敲除小鼠和饮食干预:所有动物程序和安乐死术都是按照中国北京大学动物研究委员会批准的协议来执行的，并且符合实验动物护理和使用指南(1985年由美国国家卫生研究所修订发行，发行号为86-23)。所有动物都维持在中国北京大学实验动物中心的一个光照/黑暗循环的温控屏障设施里，他们可自由获取食物和水。本研究仅使用雄性动物为研究材料。MG53基因敲除小鼠的构建之前已有说明。MG53基因敲除小鼠和野生型同窝出生小鼠从出生三周开始进行高脂饮食(60%卡路里来自脂肪，饮食研究有限公司，货号为D12492)和正常饮食(11.4%的卡路里来自脂肪，中国军事医学科学学院)的干预。
[0074]MG53转基因小鼠:鼠科MG53基因全长cDNA编码序列被克隆到pUC_CAGGS质粒的XhoI位点，受鸡beta肌动蛋白启动子调控。经SalI酶切线性化并通过凝胶纯化以后，这个片段被显微注射到小鼠的受精卵内。PCR用来进行基因型鉴定。
[0075]质粒和腺病毒载体:通过PCR从小鼠cDNA文库扩增了 MG53全长序列和缺失了RING结构域的MG53序列 (Λ RING)，并从BglII和XbaI两个酶切位点插入p3XFLAG_CMV_10的表达载体(来自Sigma-Aldrich公司)。全长的MG53序列也经KpnI和XhoI两个酶切位点嵌入pcDNA4/T0/Myc_His B的表达载体(来自Invitrogen公司)。C14A (第14位的半胱氨酸被丙氨酸替代)的MG53突变体是利用快速点突变试剂盒的策略对野生型(全长)MG53质粒改造而成。胰岛素受体序列是从pBABE-bleo人胰岛素受体B (来自Addgene公司)亚克隆而来，并经HindIII和XbaI两个酶切位点嵌入pcDNA4/T0/Myc-His B的表达载体(来自Invitrogen公司)。胰岛素受体底物I (IRSl)是从pBS-m IRSl (来自Invitrogen公司)亚克隆而来，并经HindIII和NotI两个酶切位点嵌入pcDNA4/T0/Myc-His B的表达载体(来自Invitrogen公司)。N端带HA标签的泛素表达质粒和C端带FLAG标签的胰岛素受体表达质粒分别有陈博士和1.Leibiger提供。表达GFP和融合表达GFP-MG53的腺病毒已在之前做出说明。
[0076]细胞培养，腺病毒感染和质粒转染:C2C12成肌细胞(来自细胞资源中心，IBMS，中国医学科学院/中国协和医科大学)置于37摄氏度含5% 二氧化碳的细胞培养箱中，经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)培养，该培养基中补充有10%牛胎儿血清(Sigma-Aldrich公司)，0.llg/L丙酮酸钠和I %的青霉素-链霉素。当C2C12成肌细胞90%密度时，我们通过腺病毒感染或质粒转染进行基因导入。之后，细胞在含有2%的马血清的DMEM培养基里培养四天分化成肌管。
[0077]免疫共沉淀，免疫印迹:组织或细胞在冰上经裂解缓冲液(pH7.6的30mM的HEPES，100mM的氯化钠，0.5% NP-40，和蛋白酶抑制剂混合物)裂解10分钟，裂解物以13,000 rpm离心10分钟。免疫共沉淀和免疫印迹检测在之前已作说明10.胰岛素受体底物I (IRSl)的酪氨酸磷酸化的分析，是先利用IRSl抗体从总裂解物中免疫沉淀IRSl，然后用PYlOO抗体进行免疫印迹分析。其他蛋白均用特异抗体进行分析。
[0078]泛素化分析:转染了特定质粒的C2C12肌管细胞用IOmM的MG132处理12小时，然后用冰冷的磷酸缓冲溶液PBS漂洗细胞，用RIPA裂解液(200mM的NaCl，pH值8.0的20mM的 Tris-Cl，在 ImM 的 EDTA，ImM 的 EGTA，I % NP-40，0.5 % 脱氧胆酸钠，0.1% SDS, 2.5 mM焦磷酸钠，I mM的甘油磷酸盐，I mM四氧嘧啶，蛋白酶抑制剂混合物及IOmM的MG132)于冰上裂解10分钟，然后13000 rpm离心10分钟。上清经蛋白A琼脂糖4快速流动(GEHealthcare公司)处理I小时，然后和抗Myc抗体，蛋白A琼脂糖珠在4摄氏度孵育4小时，最后用RIPA缓冲液洗涤该树脂三次，洗脱下来用于免疫印迹分析。
[0079]为了检测在体水平泛素化情况，骨骼肌肉在液氮中磨成粉末，用上述提到的RIPA缓冲液于4摄氏度裂解I小时，然后13000 rpm离心10分钟。蛋白A琼脂糖珠于特定抗体于4摄氏度孵育8小时，然后和700ug裂解物4摄氏度孵育3小时.最后用RIPA缓冲液洗涤免疫沉淀物，用2XSDS样品缓冲液洗脱下来用于免疫印迹分析。
[0080]组织学分析:用于组织学分析的组织(肝脏，胰腺，棕色脂肪，内脏脂肪和骨骼肌)被固定在4%多聚甲醛(pH7.4)中过夜，包埋在石蜡中，并在5 um连续切片。并对他们进行标准的苏木精和曙红染色以及免疫荧光染色。
[0081]血压测量:收缩压和舒张压的测量是以一种非侵入性的方法在有意识的小鼠上，用尾套系统加热至37摄氏度(Visitech BP-2000血压分析系统)完成的。小鼠对该设备的适应期为7-10天，之后经历了两个周期的测量，每天测量10个动物，为期三天至血压稳定。
[0082]2-NBDG摄取测定:导入特定基因的C2C12肌管细胞在不含血清的DMEM培养基中培养12小时，然后维持在的Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液(128mM的NaCl，1.4mM氯化钙，
1.4mM干燥的硫酸镁，5.2mM氯化钾，IOmM的磷酸氢二钠和2mM丙酮酸钠，pH7.4)中于37摄氏度下孵育30分钟，随后用0.1uM的胰岛素和100uM2 -NBDG (Invitrogen)于37摄氏度处理6小时。然后，将细胞用冰冷的PBS缓冲液洗涤三次，用0.5%的胰蛋白酶将细胞消化下来，1000rpm离心5分钟，再用PBS重新悬浮细胞，最后用FACSCalibur流式细胞仪(BD)测定FLl的荧光值31。
[0083]代谢测量:在葡萄糖耐量实验中，小鼠禁食过夜(16小时)，然后腹腔注射D-葡萄糖(2g/kg体重)。在胰岛素耐量实验中，小鼠随机喂养和腹腔注射牛胰岛素(0.75U/kg体重，Sigma-Aldrich公司)。为了检测葡萄糖刺激胰岛素的释放，小鼠禁食16 h后腹腔注射D-葡萄糖(2g/kg)。收集注射前和注射后不同时间点的尾静脉血。测血糖和胰岛素浓度的测量是利用一 AccuCheck的血糖仪(罗氏诊断公司制)和凌嘉研究的ELISA试剂盒(目录的数量EZRM1-13K)分别进行的。血清甘油三酯和胆固醇浓度是利用试剂盒(目录编号分别为290-63701 和 294-65801)测量的。
[0084]对于代谢率分析，小鼠分别独立安置在一个12小时光照/黑暗的环境内。一个综合性的动物代谢监控系统(CLAMS;哥伦布仪器公司)被用来评价小鼠连续超过72小时的氧耗量(V02)和二氧化碳生产(VC02)。能源支出的计算公式为:能源支出=(3.815+1.232V02/VC02) XV02。
[0085]统计:统计显着性检验组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)或重复测量的方差分析，适当时候用Bonferroni后t检验。所有P值小于0.05认为显著。数据表示为mean+s.e.nio
【专利附图】
【附图说明】
[0086]图1:MG53和MG53C14A都能够保护缺氧引起的心肌细胞的损伤。
[0087]在培养的心肌细胞中，通过细胞内ATP含量(左图)和细胞外乳酸脱氢酶(LDH)浓度(右图)检测缺氧引起过表达对照载体(vector)的细胞出现明显的死亡，而在过表达MG53或者MG53C14A的细胞中，细胞的死亡均明显减少。
[0088]图2:MG53敲除能够保护高脂饮食引起的代谢疾病。
[0089]a正常饮食或高脂饮食喂养不同时间的野生型和MG53敲除小鼠的体重变化。b_e正常饮食或高脂饮食喂养35周的野生型和MG53敲除小鼠的血压(b)、血糖(C)、血胰岛素(d)、血胆固醇(e)和血甘油三酯(f)数据。
[0090]图3:MG53敲除能够保护高脂饮食引起的胰岛素抵抗。
[0091]a正常饮食或高脂饮食喂养30周的野生型和MG53敲除小鼠的糖耐量(左)和胰岛素耐量(右)数据。b正常饮食或高脂饮食喂养30周的野生型和MG53敲除小鼠中葡萄糖引起的胰岛素分泌数据。
[0092]图4:MG53转基因能够引起的肥胖和代谢疾病。
[0093]a用western blots实验检测MG53转基因小鼠的不同组织中MG53的表达量。b正常饮食喂养不同时间的野生型和MG53转基因小鼠的体重数据。c正常饮食喂养38周的野生型和MG53转基因小鼠的血胰岛素、血糖、血压和血胆固醇数据。
[0094]图5:MG53敲除能够保护高脂饮食引起的胰岛素抵抗。
[0095]a正常饮食喂养38周的野生型和MG53转基因小鼠的骨骼肌中，胰岛素(Insulin)刺激引起的IR，IRSl和Akt的磷酸化和总蛋白量变化。左侧是代表性的western blots图，右侧是左边数据的统计图。b正常饮食或高脂饮食喂养35周的野生型和MG53敲除小鼠的骨骼肌中，胰岛素(Insulin)刺激引起的IR，IRSl和Akt的磷酸化和总蛋白量变化。左侧是代表性的western blots图,右侧是左边数据的统计图。
[0096]图6:MG53能够与IR和IRSl相互作用，并增加其泛素化。
[0097]a通过免疫共沉淀实验检测野生型小鼠的骨骼肌中，MG53与IR和IRSl相互作用。b正常饮食喂养38周的野生型和MG53转基因小鼠的骨骼肌中，IR (上)和IRSl (下)的泛素化程度数据。c正常饮食或高脂饮食喂养35周的野生型和MG53敲除小鼠的骨骼肌中，IR (上)和IRSl (下)的泛素化程度数据。
[0098]图7 =RNG手指区删除和C14A突变的MG53，不能引起IR和IRSl的泛素化增加，而且不能抑制胰岛素信号。
[0099]a在C2C12肌管细胞中，MG53的过表达(Flag_FL_MG53)能显著引起IR (左)和IRSl(右)的泛素化增加，但RNG手指区删除(Flag- Δ RNG)和C14A突变(Flag_C14A)的MG53过表达，对于IR (左)和IRSl (右)的泛素化无影响。b C2C12肌管细胞中，通过westernblots实验检测MG53的过表达(FL-MG53)能显著抑制胰岛素(Insulin)引起的IR，IRSl和Akt的磷酸化，减少IR和IRSl的总量；RNG手指区删除(八8如)和(:14八突变((:144)的1^53无类似的作用。左为代表性的western blots图，右为左边数据的统计图。
[0100]图8:蛋白酶体抑制剂能抑制MG53引起的胰岛素信号变化。
[0101]a C2C12肌管细胞中，通过western blots实验检测MG53的过表达(Adv_MG53)能够显著抑制胰岛素(Insulin)引起的IR，IRSl和Akt的磷酸化，并减少IR和IRSl的总量，而利用蛋白酶体抑制剂β -1ac能够抑制MG53的作用。左侧是代表性的western blots图，右侧是左边数据的统计图。b C2C12肌管细胞中，胰岛素(Insulin)引起细胞对于葡萄糖衍生物(2-NBDG)的摄取增加，而MG53过表达(Flag_MG53)能够抑制胰岛素引起的2-NBDG的摄取，MG53的作用能够被蛋白酶体抑制剂β -1ac抑制。具体实施方案
[0102]以下实施例中采用的试剂盒是市售可得到的北京全式金公司的EasyMutagenesis System。
[0103]实施例1.MG53蛋白突变体，即，MG53突变体:MG53C14A。
[0104]MG53C14A的突变过程:
[0105]1、设计突变引物，使上下游引物都带有突变位点，并且重叠区域为18_27bp。引物序列为:
[0106]C14A primer 1:
[0107]5， -gaactgtccgccccactgtgcttgcagctg-3，
[0108]C14A primer 2:
[0109]5， - agcacagtggggcggacagttcctgacgca_3，
[0110]2、以突变质粒200ng作为模板，使用高保真DNA聚合酶，用特异性突变引物进行PCR反应扩增。反应产物用琼脂糖凝胶鉴定。
[0111]PCR反应条件如下:
[0112]95 °C IOmin
[0113]950C 30sec
[0114]55°C 30sec 20 Cycles
[0115]72°C 3.5sec
[0116]72 °C 5min
[0117]4°CHold (维持)
[0118]3、利用DpnI进行酶切反应处理PCR产物，反应条件如下:10uL PCR产物加入IuLDpnI，37°C处理过夜。
[0119]4、转化大肠杆菌感受态细胞T0P10:融解感受态T0P10，加入处理后的PCR产物，放在冰上孵育30分钟，42oC热刺激60秒，加入LB, 37oC孵育45分钟。涂氨苄抗性LB平板。37oC过夜培养16小时。
[0120]5、挑取平板上的单菌落，DNA测序检测突变结果。
[0121]参考:Stratagene的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit
[0122]北京全式金公司Easy Mutagenesis System。说明书可参见如下公开内容:http://www.transgen.com.cn/uploadfiIe/201111/20111109161357731.pdf.[0123]实施例2.MG53蛋白的突变体，BP, MG53突变体:MG53C17A。
[0124]MG53C17A的突变过程:
[0125]引物序列为:
[0126]C17A primer 1:
[0127]5， - gcccactggccttgcagctgttcgatgcgc-3，
[0128]C17A primer 2:
[0129]5， - cagctgcaaggccagtgggcaggacagttc_3，
[0130]其他步骤同C14A。
[0131]实施例3.MG53 突变体:MG53C29A。[0132]MG53C29A的突变过程:
[0133]引物序列为:
[0134]C29A primer 1:
[0135]5， - acggctgaggctggccacagtttctgccgt-3，
[0136]C29A primer 2:
[0137]5， - actgtggccagcctcagccgtcactggcgc _3，
[0138]其他步骤同C14A。或可参见实施例1或2.[0139]实施例4.MG53 突变体:MG53C34A。
[0140]MG53C34A的突变过程:
[0141]引物序列为:
[0142]C34A primer 1:
[0143]5， - cacagtttcgcccgtgcctgcctgatccgg-3，
[0144]C34A primer 2:
[0145]5， - gcaggcacgggcgaaactgtggccacactc-3，
[0146]其他步骤同C14A。
[0147]实施例5.MG53 突变体:MG53C37A。
[0148]MG53C37A的突变过程:
[0149]引物序列为:
[0150]C37A primer 1:
[0151]5， - tgccgtgccgccctgatccgggtggcaggg _3，
[0152]C37A primer 2:
[0153]5， - ccggatcagggcggcacggcagaaactgtg _3，
[0154]其他步骤同C14A。或可参见实施例f 4.[0155]实施例6.MG53 突变体:MG53C53A。
[0156]MG53C53A的突变过程:
[0157]引物序列为:
[0158]C53A primer 1:
[0159]5， - acagttgccgctccctgttgtcaggcacct-3，
[0160]C53A primer 2:
[0161]5， - acaacagggagcggcaactgtgccgtccgc _3，
[0162]其他步骤同C14A。
[0163]实施例7.MG5 3 突变体:MG53C56A。
[0164]MG53C56A的突变过程:
[0165]引物序列为:
[0166]C56A primer 1:
[0167]5， - tgtccctgtgctcaggcacctacacggccg _3，
[0168]C56A primer 2:
[0169]5， - aggtgcctgagcacagggacaggcaactgt-3，
[0170]其他步骤同C14A。[0171]实施例8.MG53 突变体:MG53C14G。
[0172]MG53C14G的突变过程:
[0173]引物序列为:
[0174]C14G primer 1:
[0175]5，-gaactgtccggcccactgtgcttgcagctg-3，
[0176]C14G primer 2:
[0177]5，- agcacagtgggccggacagttcctgacgca-3，
[0178]其他步骤同C14A。
[0179]实施例9.MG53 突变体:MG53C17G。
[0180]MG53C17G的突变过程:
[0181]引物序列为:
[0182]C17G primer 1:
[0183]5， - gcccactgggcttgcagctgttcgatgcgc-3，
[0184]C17G primer 2:
[0185]5， - cagctgcaagcccagtgggcaggacagttc-3，
[0186]其他步骤同C14A。
[0187]实施例10.MG53 突变体:MG53C29G。
[0188]MG53C29G的突变过程:
[0189]引物序列为:
[0190]C29G primer 1:
[0191]5， - acggctgagggtggccacagtttctgccgt-3，
[0192]C29G primer 2:
[0193]5， - actgtggccaccctcagccgtcactggcgc _3，
[0194]其他步骤同C14A。
[0195]实施例11.MG53 突变体:MG53C34G。
[0196]MG53C34G的突变过程:
[0197]引物序列为:
[0198]C34G primer 1:
[0199]5， - cacagtttcggccgtgcctgcctgatccgg-3，
[0200]C34G primer 2:
[0201]5， - gcaggcacggccgaaactgtggccacactc-3，
[0202]其他步骤同C14A。
[0203]实施例12.MG53 突变体:MG53C37G。
[0204]MG53C37G的突变过程:
[0205]引物序列为:
[0206]C37G primer 1:
[0207]5， - tgccgtgccggcct gatccgggtggcaggg _3，
[0208]C37G primer 2:
[0209]5， - ccggatcaggccggcacggcagaaactgtg _3，[0210]其他步骤同C14A。
[0211]实施例13.MG53 突变体:MG53C53G。
[0212]MG53C53G的突变过程:
[0213]引物序列为:
[0214]C53G primer 1:
[0215]5， - acagttgccggtccctgttgtcaggcacct-3，
[0216]C53G primer 2:
[0217]5， - acaacagggaccggcaactgtgccgtccgc _3，
[0218]其他步骤同C14A。
[0219]实施例14.MG53 突变体:MG53C56G。
[0220]MG53C56G的突变过程:
[0221]引物序列为:
[0222]C56G primer 1:
[0223]5， - tgtccctgtggtcaggcacctacacggccg _3，
[0224]C56G primer 2:
[0225]5， - aggtgcctgaccacagggacaggcaactgt_3，
[0226]其他步骤同C14A。
[0227]实施例15.MG53 突变体:MG53C14L。
[0228]MG53C14L的突变过程:
[0229]引物序列为:
[0230]C14L primer 1:
[0231]5， -gaactgtccctcccactgtgcttgcagctg-3，
[0232]C14L primer 2:
[0233]5， - agcacagtgggagggacagttcctgacgca_3，
[0234]其他步骤同C14A。
[0235]实施例16.MG53 突变体:MG53C14V。
[0236]MG53C14V的突变过程:
[0237]引物序列为:
[0238]C14V primer 1:
[0239]5， -gaactgtccgtcccactgtgcttgcagctg-3，
[0240]C14V primer 2:
[0241]5， - agcacagtgggacggacagttcctgacgca_3，
[0242]其他步骤同C14A。
[0243]实施例17.MG53 突变体:MG53C14I。
[0244]MG53C14I的突变过程:
[0245]引物序列为:
[0246]C14I primer 1:
[0247]5， -gaactgtccatcccactgtgcttgcagctg-3，
[0248]C14I primer 2:[0249]5， - agcacagtgggatggacagttcctgacgca_3，
[0250]其他步骤同C14A。
[0251]实施例18.MG53 突变体:MG53C14P。
[0252]MG53C14P的突变过程:
[0253]引物序列为:
[0254]C14P primer 1:
[0255]5， -gaactgtccccaccactgtgcttgcagctg-3，
[0256]C14P primer 2:
[0257]5， - agcacagtggtggggacagttcctgacgca_3，
[0258]其他步骤同C14A。
[0259]实施例19.MG53 突变体:MG53C17L。
[0260]MG53C17L的突变过程:
[0261]引物序列为:
[0262]C17L primer 1:
[0263]5， - gcccactgctcttgcagctgttcgatgcgc-3，
[0264]C17L primer 2:
[0265]5， - cagctgcaagagcagtgggcaggacagttc_3，
[0266]其他步骤同C14A。
[0267]实施例20.MG53 突变体:MG53C29L。
[0268]MG53C29L的突变过程:
[0269]引物序列为:
[0270]C29L primer 1:
[0271]5， -acggctgagcttggccacagtttctgccgt-3，
[0272]C29L primer 2:
[0273]5， -actgtggccaagctcagccgtcactggcgc-3，
[0274]其他步骤同C14A。
[0275]经实验证实，包括实施例1所述的MG53C14A在内的MG53突变体，即，MG53C14A、MG53C17A、MG53C29A、MG53C34A、MG53C37A、MG53C53A、MG53C56A 均对心脏能产生保护作用，可保护心脏损伤。MG53含量的增加在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病，MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。而MG53的第14位点、第17位点、第29位点、第34位点、第37位点、第53位点、第56位点的半胱氨酸，特别是第14位点的C，是MG53引起胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病所必需的，也就是说上述位点的半胱氨酸尤其是第14位C发生突变的MG53突变体(例如MG53C14A)不能引起胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病，却仍然能够保护心肌细胞的损伤，即，MG53突变体(包括MG53C14A)能够在不引起胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用等前提下，行使心脏保护功倉泛。
[0276]本发明所述的MG53突变体，包括上述实施例的MG53突变体，其序列的属种包括了灵长类动物(例如:人)、大鼠和小鼠。
[0277]以上旨在进一步说明本发明，并不对本发明的范围加以限制。本领域技术人员对在此公开的实施方 案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
【权利要求】
1.一种MG53突变体，其特征在于，该MG53突变体为MG53的N端的RING结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该7个半胱氨酸分别是在RING结构域的第14位点、第17位点、第29位点、第34位点、第37位点、第53位点、第56位点。
2.如权利要求1所述的MG53突变体，其特征在于，所述的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
3.如权利要求2所述的MG53突变体，其特征在于，所述的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。
4.如权利要求3所述的MG53突变体，其特征在于，所述的非极性氨基酸为丙氨酸，所述的 MG53 突变体选自 MG53C14A、MG53C17A、MG53C29A、MG53C34A、MG53C37A、MG53C53A、MG53C56A中的任意一种。
5.一种MG53突变体的突变方法，其特征在于，该方法是利用定点突变试剂盒对野生型MG53质粒的全长序列进行定点突变，得到所述的MG53突变体。
6.如权利要求5所述的突变方法，其特征在于，利用定点突变试剂盒对野生型MG53质粒的全长序列进行突变，得到第14位的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的MG53突变体。
7.如权利要求6所述的改造方法，其特征在于，该定点突变的过程为: (1)先设计突变引物，使上下游引物都带有突变位点，重叠区域为18-27bp； (2)以突变质粒作为模板，使用DNA聚合酶，用特异性突变引物进行PCR反应扩增，反应产物用琼脂糖凝胶鉴定； (3)利用DpnI进行酶切反应处理PCR产物； (4)转化大肠杆菌感受态细胞T0P10，融解感受态T0P10，加入处理后的PCR产物，冰上孵育，加入LB,孵育，涂氨苄抗性LB平板，培养，挑取平板上的单菌落，DNA测序检测得突变结果为阳性，即是。
8.权利要求1所述的MG53突变体在制备治疗心肌损伤的药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物包括治疗与心肌细胞损伤相关的疾病的药物，该疾病包 括心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂的药物。
10.如权利要求8或9所述的用途，其特征在于，该MG53突变体为MG53C14A，其为MG53C14A在制备治疗心肌损伤的药物中的用途。
【文档编号】A61P9/04GK103965342SQ201310047584
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2013年1月25日
【发明者】肖瑞平, 曹春梅, 张岩, 吕凤祥 申请人:北京博雅和瑞科技有限公司