一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种1，3-1，4-β -葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] β -葡聚糖是存在于禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖，在大麦、小麦、大米 等经济类谷物中含量很高。其是由高达上千个β-D-葡萄糖残基通过β_1，3或β_1，4 糖苷键线状排列而成，具有很高的分子量。其可以溶解于水中，形成的溶液黏度很高，这给 啤酒行业及饲料行业带来了诸多不利。在啤酒工业的主要原料麦芽中含有大量葡聚 糖，未降解的β -葡聚糖存在于麦汁中会导致麦汁黏度过大，造成过滤困难，延长麦醪过滤 时间，降低浸出物含量，对于成品啤酒会影响其非生物稳定性。而在生产纯生啤酒时，过多 β-葡聚糖酶会造成滤膜的膜孔堵塞，过滤能力下降。在饲料行业中，麦类饲料中的β-葡 聚糖无论在人的肠道还是动物的肠道内都不能被直接消化吸收，必须经过酶促降解后才能 被利用，且其阻止了有效成分在动物肠道中内的吸收，降低了饲料中有效成分转化率，是一 种抗营养因子，并为微生物特别是致病菌的寄居繁殖提供了丰富的营养造成大量有害微生 物在动物肠道内繁殖，引起畜禽腹泻，同时会竞争性消耗大量物质而降低饲料利用率。
[0003] 来源于特基拉芽孢杆菌（B. terquilensis)CGX 5-1的1，3-1，4-β -葡聚糖酶，简 称β-葡聚糖酶。1，3-1，4-β-葡聚糖酶是一类可以在3-0-吡喃葡萄糖位点专一性切割 β -葡聚糖为三糖和四糖，这是其工业应用的基础。在啤酒行业麦汁糖化过程中温度是从 48°C提高至78°C，而饲料行业中烘焙的温度也在65°C以上。而目前筛选得到的大部分野生 1，3-1，4-β -葡聚糖酶的最适温度主要集中在45°C和55°C，并不能满足工业上的需求。而 催化活性不高也是其不能推广使用的重要原因。而目前市场上几家酶制剂公司如诺维信、 DMS研发生产的β-葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产β-葡聚 糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且β -葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺都是 商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。因此，如果能够 提高野生型1，3-1，4-β -葡聚糖酶的催化活性及热稳定性，获得高活性高热稳定的β -葡 聚糖酶，那么就可以降低成本，推广其在工业上的应用。
[0004] 为了提高1，3-1，4-β-葡聚糖酶的热稳定性，国内外已经进行了一些研宄。目前 研宄发现，1，3-1，4-β -葡聚糖酶中唯一存在的一对二硫键对于蛋白质热稳定性影响不大。 而GLN1、THR2、SER5和ΡΗΕ7的突变大幅度的提高了 β-葡聚糖酶的热稳定性。对β-葡聚 糖酶的杂交结果显示，将来源于浸麻芽孢杆菌（B.macerans)的前16个氨基酸替换为淀粉 液化芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens)的前16个氨基酸得到的杂交酶H(A16_M)和两者之 间前12个氨基酸进行替换及删除TYR13形成的杂交酶H(A12-M) - Λ 13在高温下有很好的 稳定性。这说明β-葡聚糖酶的N端对于该酶的热稳定性有重要的影响。而钙离子对于在 高温下维持β-葡聚糖酶的稳定性也有重要作用。针对β-葡聚糖酶中多有赖氨酸进行定 点突变研宄发现当其中3个赖氨酸突变为丝氨酸得到的三突变酶（BglTM)的热稳定性和催 化活力都有了一定程度的提升。但是目前得到的改造酶BglTM的热稳定性依旧不能适应工 业应用。
[0005] 本发明所使用的经过改造的特基拉芽孢杆菌CGX 5-1来源的1，3-1，4- β -葡聚糖 酶（BglTM)的最适温度为60°C，比活力为3936. 4U/mg，并不能适应工业应用的要求。因此， 进一步提高该酶的催化活力及热稳定性对其在工业上的应用推广有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种1，3-1，4_ β-葡聚糖酶突变体，尤其是一种具有更高热 稳定性的1，3-1，4- β -葡聚糖酶突变体。所述突变体是通过对亲本1，3-1，4- β -葡聚糖酶 (BglTM)表面进行二硫键改造得到的。
[0007] 所述突变体，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3 所示，分别命名为 N31C-T187C、P102C-N125C、N31C-T187C/ P102C-N125C。
[0008] 所述亲本BglTM，在本发明的一种实施方式中，是Niu C，Zhu L，Zhu P，LiQ. 2015. Lysine-Based Site-Directed Mutagenesis Increased Rigidβ-Sheet Structure and Thermostability of Mesophilic I,3 - I,4-β -Glucanase. Journal ofAgricultural and Food Chemistry 63:5249-5256 中构建的三重突变体 K20S/K117S/K165S。
[0009] 所述N31C-T187C，是在亲本BglTM的基础上，将第31位的天冬酰胺和第187位的 苏氨酸突变成半胱氨酸而得到的。
[0010] 所述P102C-N125C，是在亲本BglTM的基础上，将第102位的脯氨酸和第125位的 天冬酰胺突变成半胱氨酸而得到的。
[0011] 所述N31C-T187C/P102C-N125C，是在亲本BglTM的基础上，将第31位、第187位、 第102位、第125位的氨基酸都突变成半胱氨酸而得到的。
[0012] 编码所述突变体的核苷酸，在本发明的一种实施方式中，序列分别如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示。
[0013] 本发明还要求保护含有所述突变体的氨基酸序列的载体，以及表达所述突变体的 基因工程菌。
[0014] 所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，以pET28a(+)质粒为表达载体，以 大肠杆菌为表达宿主。
[0015] 所述宿主，在本发明的一种实施方式中，为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0016] 本发明还提供了一种所述基因工程菌的构建方法。
[0017] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是以一株改造过的Bacillus terquilensis CGX 5-1来源1，3-1，4_β-葡聚糖酶基因为模板，采用重叠延伸PCR的方法 进行定点突变获得编码二硫键改造突变体的基因，随后将编码突变体的基因片段连接至原 核表达载体并转化大肠杆菌进行表达。
[0018] 本发明还要求保护所述突变体在食品、饲料领域的应用。
[0019] 本发明的突变体命名，是以亲本氨基酸序列为基准，采用"原始氨基酸位置替换的 氨基酸"来表示突变体。比如N31C代表将位置31的氨基酸由亲本的天冬酰胺N替换为半 胱氨酸C，又比如N31C-T187C代表第31位和187位的氨基酸同时发生了突变，N31C-T187C/ P102C-N125C代表第31、187、102、125位的氨基酸同时发生了突变。
[0020] 本发明的有益效果：本发明提供的三株β_葡聚糖酶二硫键改造突变体，与野生 酶相比，T 5tl值由76°C升高至77. 1°C、76. 8°C和77. 5°C;在60°C下的半衰期，由59min分别延 长至81. 4min、81. 2min和87. 5min，分别提高了 40%、37. 6%和48. 3%。而三株二硫键改造 酶的比活力和野生酶相比略有提高。本发明的突变体，在保证催化活性的同时使得β-葡 聚糖酶的热稳定性有所提高，更有利于在工业上的应用。
【附图说明】
[0021] 图1 :野生酶与三株β-葡聚糖酶二硫键改造突变体的最适温度比较；□:野生 酶，〇：N31C-T187C，A :P102C-N125C，V :N31C-T187C/P102C-N125C;
[0022] 图2 :野生酶与β -葡聚糖酶突变体的在60°C的半衰期比较；
[0023] 图3 :野生酶与β -葡聚糖酶突变体的T5tl值比较。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 :突变位点分析
[0025] 将β -葡聚糖酶的推定氨基酸序列提交至SWISSM0DEL在线服务器进行同源建模， 并将建模得到的PDB文件输入Disulfide by Design软件进行计算，从而预测得到当突变 为半胱氨酸时可以形成二硫键的潜在氨基酸对。从表1可以看出，共有29对氨基酸对被预 测可能形成二硫键。
[0026] 从表1可以看出，共有29对氨基酸经过预测可能形成二硫键，之后对这些氨基酸 对进行了筛选。首先排除β-葡聚糖酶中自身形成二硫键的氨基酸对（C32-C61)和与其有 冲突的氨基酸对C32-F59C。之后，为了保证活性中心的完整性，排除了 9对位于活性中心 5Α范围内的氨基酸对。根据文献报道，形成二硫键的氨基酸对在序列上相差小于IOAA可 能在结构上会有所冲突，因此，4对氨基酸对也被进一步排除。最终还有14对氨基酸残基剩 余。
[0027] 表1 葡聚糖酶中形成二硫键潜在位点
[0028]
【主权项】
1. 一种热稳定性提高的1，3-i，4- e -葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨 基酸序列如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3 所示。
2. 编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是SEQ ID NO. 4、 SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示的序列。
4. 含有权利要求1所述突变体的氨基酸序列的载体。
5. 表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
6. 根据权利要5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pET28a (+)质粒为 表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
7. 根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌BL21 (DE3)。
8. -种权利要求6所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法是：以一株改造 过的Bacillus terquilensis CGX 5-1来源1,3-1，4-0-葡聚糖酶基因为模板，采用两次 重叠延伸PCR的方法进行定点突变获得编码二硫键改造突变体的基因，随后将编码突变体 的基因片段连接至原核表达载体并转化大肠杆菌进行表达。
9. 权利要求5所述基因工程菌在食品、饲料领域的应用。
10. 权利要求1所述突变体在食品、饲料领域的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明将改造后特基拉芽孢杆菌(Bacillus terquilensis)CGX 5-1来源的1,3-1,4-β-葡聚糖酶的第31位的天冬酰胺和187位的苏氨酸、102位的脯氨酸和125位的天冬酰胺通过重叠延伸PCR的方法突变为半胱氨酸，分别获得单突变体N31C-T187C和P102C-N125C。将两队突变位点进行整合突变，获得N31C-T187C/P102C-N125C双二硫键突变酶。三株突变酶均表现出了更好的热稳定性。这些突变酶和野生酶相比更有利于其在工业上的应用。
【IPC分类】C12N1-21, C12N9-24, C12N15-56, C12N15-70
【公开号】CN104862290
【申请号】CN201510323186
【发明人】朱林江, 钮成拓, 李崎, 李永仙, 王金晶, 刘春凤, 郑飞云
【申请人】江南大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月12日