苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体v145a的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶生物技术领域，公开了苛求芽抱杆菌尿酸酶突变体V145A及其多位 点协同突变体;相对于中国发明专利化200910103741.1中公开的野生型苛求芽抱杆菌尿 酸酶，此突变体及其协同突变体在pH9.2时的催化活性或/和生理条件下的热稳定性有提 局。
【背景技术】
[0002] 尿酸酶可特异性氧化尿酸为尿囊素和过氧化氨，是临床检验等领域测定血清尿酸 的重要工具酶，也是临床治疗肿瘤溶解综合症(TLS)、痛风及其它高尿酸血症相关疾病的药 用酶。
[0003] 高活性和稳定的野生型尿酸酶或其突变体有更重要的应用价值。
[0004] 野生型苛求芽抱杆菌尿酸酶有良好的稳定性及较高的活性，适合用于血清尿酸测 定，但作为治疗用酶还需显著提高活性和热稳定性，尤其是生理条件下的热稳定性。
[0005] 本发明设计并筛选获得苛求芽抱杆菌尿酸酶突变体V145A及其多位点协同突变 体，其活性比野生型苛求芽抱杆菌尿酸酶均有提高，而协同突变体同时有更高热稳定性。
【发明内容】
[0006] 本发明设计与中国发明专利化200910103741.1中公开的野生型苛求芽抱杆菌胞 内尿酸酶相比，活性或/和热稳定性更好的突变体。
[0007] 所述尿酸酶突变体W苛求芽抱杆菌野生型尿酸酶为亲本。
[000引此野生型尿酸酶序列见中国发明专利化200910103741.1，公开号CN 101875922。
[0009] 所述尿酸酶突变体具体包括W下六种：
[0010] 1、突变体V145A，野生型尿酸酶第144位鄉氨酸突变为丙氨酸。
[0011] 突变体V145A氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012] 2、协同突变体A2R/V145A，据突变体V145A将第2位的丙氨酸突变为精氨酸。
[0013] 协同突变体423/￥1454氨基酸序列如沈9 10備.2所示。
[0014] 3、协同突变体V145A/Y320R，据突变体V145A将第320位酪氨酸突变为精氨酸。
[0015] 协同突变体￥1454/￥3203氨基酸序列如沈9 10^.3所示。
[0016] 4、协同突变体V145A/Y320H，据突变体V145A将第320位酪氨酸突变为组氨酸。
[0017] 突变体￥1454/￥32(^氨基酸序列如沈9 10^.4所示。
[0018] 5、协同突变体A2R/V145A/Y320R，据协同突变体A2R/V145A将第320位酪氨酸突变 为精氨酸。
[0019] 协同突变体423/￥1454/￥3201?氨基酸序列如沈9 10備.5所示。
[0020] 6、协同突变体A2R/V145A/Y320H，据协同突变体A2R/V145A将第320位的酪氨酸突 变为组氨酸。
[0021] 协同突变体423/￥1454/￥32(^氨基酸序列如沈9 10^.6所示。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] 表1比较野生型尿酸酶及其突变体在pH 9.2的活性及生理条件下稳定性
[0024]
[0025] 如表1，突变体V145A比野生型尿酸酶活性提高30% W上且生理条件下稳定性相 当；协同突变体A2R/V145A活性较野生型尿酸酶提高近1倍且稳定性略有提高；协同突变体 V145A/Y320R和V145A/Y320田舌性与突变体V145A相当，但其在热失活初期有活性基本不衰 减的平台期，其后为指数衰减;协同突变体V145A/Y320R活性衰减平台期约6天，此时野生型 尿酸酶剩余活性约75% (附图1)，协同突变体V145A/Y320田舌性衰减平台期约6天;协同突变 体A2R/V145A/Y320巧PA2R/V145A/Y320H活性与突变体A2R/V145A相当，但A2R/V145A/Y320R 和A2R/V145A/Y320H活性衰减平台期分别约8天和6天。
【附图说明】
[00%]图1:协同突变体V145A/Y320R与野生型尿酸酶，生理条件下热失活过程比较
【具体实施方式】
[0027] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般为本领域技术人员通用含义。
[0028] 实施例1:苛求芽抱杆菌尿酸酶系列突变体的重组表达载体构建。
[0029] 选取拟突变位点，委托北京中美泰和生物技术有限公司合成编码基因，并构建表 达载体，转化到大肠杆菌化21 (DE3)中进行重组表达。
[0030] 实施例2:苛求芽抱杆菌尿酸酶突变体的表达与纯化。
[0031] 将转化的大肠杆菌细胞在LB培养基(含O.lg/L卡那霉素)扩大培养4-化后，加入终 浓度0.24g/mL的IPTG于16°C培养1她，细胞在4°C用8000巧m离屯、lOmin收集菌体。菌体用 0.1M化is-HCl(pH 8.0)缓冲液重悬，超声将菌体破碎释放胞内尿酸酶，将细胞裂解液于4 °C、12000巧m离屯、lOmin收集上清。收集的上清用于尿酸酶突变体的纯化。
[0032] 用DEAE-纤维素阴离子交换层析柱进行目标蛋白的分离，纯化步骤具体为：（1)平 衡：用10倍柱体积的0.1M化is-HCl (pH 8.0)缓冲液平衡过夜；（2)上样:预先处理好的样品 WlmL/min的流速上样；（3)洗脱：用高浓度化C1溶液进行梯度洗脱，分步收集检测酶活。测 定热稳定性和比活性时均重复进行一次离子交换层析。
[0033] 实施例3:苛求芽抱杆菌尿酸酶系列突变体活性及稳定性分析。
[0034] (1)活性测定
[0035] 酶活性单位定义:每分钟氧化?μL?ο?底物尿酸所需的酶量为一个活力单位。
[0036] 酶活性测定步骤:用0.2Μ棚砂缓冲液(pH 9.2)，测定体系尿酸浓度至75μπιο1，延时 30s，时间间隔10s，在293nm测定1分钟内吸收变化初速度。对应缓冲液及尿酸均预热至(25 ±0.5)°C，尿酸消光系数固定为11.5(mmol · L-1 ·畑1)-1。
[0037] (2)稳定性分析
[0038] 纯化后浓缩透析尿酸酶酶液，滤菌，加入0.2M憐酸盐缓冲液中(pH 7.4，含0.1 g/ml 氨节霉素和卡那霉素，O.lmM的抓TA，2mM对氨基苯甲脉二盐酸盐，滤菌后用），终体系为 4. OmL，其中加入酶液体积不超过总体系的10 %。样品放入37度恒溫细胞培养箱，20分钟后 超净台取样(1S t)测定活性，记录活性衰减过程，代表如附图1。
【主权项】
1. 苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体V145A，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，并按含起始 氨基酸甲硫氨酸的方式描述其氨基酸残基的位置;与中国发明专利ZL200910103741.1中公 开的野生型苛求芽孢杆菌尿酸酶序列相比，其第145位氨基酸由缬氨酸V变为丙氨酸A，故将 此苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体简称为突变体V145A;此突变体V145A在大肠杆菌中重组表达 为活性可溶同四聚体，且其活性四聚体中每个亚基的第一位甲硫氨酸被脱去，故表达后活 性突变体仅含322个氨基酸残基。2. 据权利要求1所述苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体V145A，有如下协同突变体： A、 协同突变体A2R/V145A:与突变体V145A的氨基酸序列相比，第2位氨基酸由丙氨酸A 变为精氨酸R，其完整氨基酸序列位如SEQ ID No.2所示； B、 协同突变体V145A/Y320R:与突变体V145A的氨基酸序列相比，第320位氨基酸由酪氨 酸Y变为精氨酸R，其完整氨基酸序列如SEQ ID No.3所示； C、 协同突变体V145A/Y320H:与突变体V145A的氨基酸序列相比，第320位氨基酸由酪氨 酸Y变为组氨酸H，其完整氨基酸序列如SEQ ID No.4所示； D、 协同突变体A2R/V145A/Y320R:与突变体V145A的氨基酸序列相比，第2位氨基酸由丙 氨酸A变为精氨酸R，同时第320位氨基酸由酪氨酸Y变为精氨酸R，其完整氨基酸序列如SEQ ID No.5所示； E、 协同突变体A2R/V145A/Y320H:与突变体V145A的氨基酸序列相比，第2位氨基酸由丙 氨酸A变为精氨酸R，同时第320位氨基酸由酪氨酸Y变为组氨酸H，其完整氨基酸序列如SEQ ID No .6所示。3. 据权利要求1所述苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体V 1 4 5 A，与中国发明专利 ZL200910103741.1中公开的野生型尿酸酶相比，活性提高约30%而稳定性相当。4. 据权利要求2所述苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体V145A的协同突变体，特征如下： A、 与野生型尿酸酶相比，协同突变体A2R/V145A活性提高约50%而稳定性相当； B、 与野生型尿酸酶相比，协同突变体V145A/Y320R和V145A/Y320H活性都提高约30%; 此两种协同突变体生理条件下热失活过程中活性都不成指数衰减，其活性维持在起始值 90 %以上的时间即平台期都接近6天； C、 与野生型尿酸酶相比，协同突变体A2R/V145A/Y320R和A2R/V145A/Y320H活性都提高 约50%，且二者生理条件下活性都不成指数衰减，其平台期都约6天。
【专利摘要】苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶突变体V145A，及其协同突变体A2R/V145A、V145A/Y320R、V145A/Y320H、A2R/V145A/Y320R、A2R/V145A/Y320H；所述突变体及其协同突变体的亲本，即对应野生型尿酸酶，来自中国发明专利CN101875922所述氨基酸序列；与野生型尿酸酶相比，突变体V145A、协同突变体V145A/Y320R、协同突变体V145A/Y320H的活性都提高约30％，而协同突变体A2R/V145A、A2R/V145A/Y320R、A2R/V145A/Y320H活性都提高约50％；突变体V145A及协同突变体A2R/V145A在生理条件下稳定性与野生型尿酸酶酶相当且热失活过程基本符合指数衰减模型；在生理条件下协同突变体V145A/Y320R、V145A/Y320H、A2R/V145A/Y320R、A2R/V145A/Y320H热失活过程不符合指数衰减模型，在热失活初期6天内活性基本保留在90％以上，其后酶活性才基本呈指数衰减。
【IPC分类】C12N9/06
【公开号】CN105543187
【申请号】CN201610093491
【发明人】廖飞, 冯涛, 杨晓兰, 胡小蕾, 景一娴, 饶菁菁, 廖娟
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月18日