马来酸顺反异构酶突变体及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及蛋白质突变体，具体地设及一种马来酸顺反异构酶突变体。
【背景技术】
[0002] 富马酸(Fumaric acid),又称反下締二酸、延胡索酸，是一种天然存在的有机酸。 作为一种重要的四碳平台化合物和精细化工产品，富马酸广泛用于食品、医药、化工、涂料、 增塑剂等领域。富马酸还可W通过生物转化生产一些具有其他工业用途的重要化合物原 料，如k天冬氨酸、k丙氨酸和心苹果酸等。目前，富马酸的生产大都通过石化方法由马来 酸酢制备得到，然而化学合成法存在成本高、副产物多及可能造成的环境污染等问题，运使 得人们的目光逐渐转向环境友好的生物法来制备富马酸。
[0003] 马来酸顺反异构酶化C 5.2.1.1 ,Maleate cis-trans Isomerase ,MaiA)是一种能 够将马来酸(顺下締二酸)催化转化成富马酸(反下締二酸）的异构酶，能够在碳碳双键不断 裂的情况下，实现顺式下締二酸向反式下締二酸的异构化，属于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超 家族。由于具有催化反应抑范围宽泛、较低的Km值W及较高平衡常数的特点，马来酸顺反异 构酶被认为是可用于工业生产富马酸的有潜力的生物催化剂之一。
[0004] 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)来源的马来酸顺反异构酶在室溫有较好的 热稳定性，酶活力也相对其他菌株来源的要高。本发明WS.marcescens来源的马来酸顺反 异构酶基因为基础，进行易错PCR，在大肠杆菌中的高效表达，筛选出酶活力较高的马来酸 顺反异构酶突变体。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明目的是提供一种马来酸顺反异构酶突变 体及其编码基因与应用。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明首先提供一种马来酸顺反异构酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所 示或经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.4衍生的氨基 酸序列。
[000引所述突变体与野生型马来酸顺反异构酶相比，具体的氨基酸序列的改变是:K51I (第51位赖氨酸变为异亮氨酸），R177S(第177位精氨酸变为丝氨酸），A212G(第212为丙氨酸 变为甘氨酸）。
[0009] 其中，所述野生型马来酸顺反异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基 因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 经试验验证，该突变体的酶活力相对于野生型马来酸顺反异构酶提高了 2.71倍。
[0011] 本发明还提供了编码所述突变体的基因序列，任何能够翻译成SEQ ID NO.4所示 或经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.4衍生的氨基酸 序列的基因序列均在本发明的保护范围之内。
[0012] 在上述范围的基因序列中，本发明进一步提供一个具体明确的基因序列，其核巧 酸序列如SEQ ID NO.3所示。该基因序列能够准确翻译得到前述马来酸顺反异构酶突变体。 可用于基因工程，构建载体或工程菌。
[0013] 本发明还提供了含有前述基因的载体。
[0014] 作为优选，所述载体为原核表达载体。进一步优选为表达质粒祀T24a( + )。
[0015] 本发明还提供了含有前述基因或前述载体的宿主细胞。
[0016] 所述宿主细胞可为大肠杆菌D册α或化21 (DE3)。本领域技术人员可根据具体需要， 选择宿主细胞的种类。也可构建既含有本发明所述基因，又含有其他目的基因的载体，转染 宿主细胞，W实现不同蛋白质的表达。
[0017] 进一步地，所述宿主细胞的表达产物也属于本发明保护范围。
[0018] 本发明还提供一种可生产高酶活马来酸顺反异构酶的细胞株，其制备方法包括如 下步骤：
[0019] (1)W粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)基因组DNA作为模板，利用引物扩增 马来酸顺反异构酶的编码基因 maia;
[0020] 所述引物包括：
[0021] MaiA-F:5' -CCGGAATTCATGAGCAACCACTACCGCA-3'，
[0022] MaiA-R:5^-CCCAAGCTTATAAGCGCCGGACAG-3';
[0023] (2) W步骤(1)扩增得到的maia基因为模板，采用易错PCR技术，扩增获得马来酸顺 反异构酶突变体基因；
[0024] (3)将步骤(2)所得易错PCR产物及表达质粒祀T24a( + )用EcoRI和化nd虹双酶切后 连接，连接产物转入大肠杆菌化2UDE3)感受态细胞，涂布至LB化an)平板，将平板置37°C恒 溫培养箱培养，构建得到重组马来酸顺反异构酶基因突变库；
[0025] (4化B化an)平板上长出菌落，挑取多个单克隆，转接到LB化an)液体培养基中，适 宜溫度下摇床培养，待菌液OD600长至0.別寸，加入IPTG诱导，继续摇床培养，收集菌体，超声 破碎，测定马来酸顺反异构酶酶活，挑选酶活力最强的一株，即得。
[0026] 由于易错PCR的反应条件对易错PCR反应中的突变频率影响较大，本发明优选所述 易错PCR的反应体系为10化1: 10 X buffer 10 μ1 dATP 2 μ1
[0027] dTTP 4μ1 dCTP 4μ1 dGTP 2 μ1 MgCl: 6 μ1 上游引物 4μ1 下游引物 4μ1
[002引 DNA模板C实旅側1FCR片段)4 Taq DNA聚合酶 1 μ1 加&0 59 μ1 总体积 100 μ1。
[0029] 优选所述易错PCR的程序为:96°C预变性4min，94°C变性Imin，56°C退火Imin，75°C 延伸2min，反应45个循环，最后75°C延伸15min。
[0030] 本发明还提供了所述马来酸顺反异构酶突变体、所述宿主细胞培养物或所述细胞 株的培养物或分泌物在催化马来酸转化为富马酸中的应用。
[0031] 本发明进一步提供含有所述基因的载体。含有所述基因或所述载体的宿主细胞。
[0032] 本发明的有益效果在于：
[0033] 本发明WS.marcescens来源的马来酸顺反异构酶基因为基础，进行易错PCR，在大 肠杆菌中的高效表达，筛选出酶活力较高的马来酸顺反异构酶突变体。所述突变体与野生 型马来酸顺反异构酶相比，具体的氨基酸序列的改变是:K51K第51位赖氨酸变为异亮氨 酸），R177S(第177位精氨酸变为丝氨酸），A212G(第212为丙氨酸变为甘氨酸）。经试验验证， 该突变体的酶活力相对于野生型马来酸顺反异构酶提高了 2.71倍。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明所述maia基因 PCR的琼脂糖凝胶电泳图；
[00对图2为本发明所述maiaM基因 PCR的琼脂糖凝胶电泳图；
[0036] 图3为本发明所述MaiA及Mai Μ的SDS-PAGE图，其中：Μ: Maker; 1和2:野生型；3和4: 突变体;1和3:未诱导;2和4:诱导。
[0037] 图4为本发明所述MaiAM在大肠杆菌中的表达与纯化，其中:M:Maker;l:未诱导；2: 诱导;3:纯化。
【具体实施方式】
[0038] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0039] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0040] 实施例1马来酸顺反异构酶基因的获得
[0041 ] W化g粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)基因组DNA为PCR反应模板，按沈Q ID NO. 1 的序列设计正向引物MaiA-F为5' -CCGGAATTCATGAGCAACCACTACCGCA-3'，反向引物 MaiA-R为5^ -CCCAAGCTTATAAGCGCCGGACAG-3/，其中斜体字母部分分别为酶切位点EcoR巧口 化nd虹。PCR反应在50μ1总体积中进行，反应条件为在94°C变性5min后开始循环，然后94°C 变性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30个循环后，再于72°C延伸lOmin。取化1 PCR扩 增产物做琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。取10化1 PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照 胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。
[0042] 实施例2野生型马来酸顺反异构酶基因表达载体的构建
[0043] 实施例1中PCR产物经限制性内切酶EcoRI和化nd虹双酶切消化后，与用EcoRI和 化ndin内切酶消化的pET-24a( + )质粒(购自Novagen公司）进行连接反应，构建的载体被称 为祀T-MaiA，然后用连接产物祀T-MaiA混