一种嗜热β-葡萄糖苷酶突变体-M36N及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种嗜热β-葡萄糖苷 酶突变体Μ36Ν及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 当今，以木质纤维素为原料、用纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖，进而发酵为燃料 乙醇成为应对当今世界能源危机、环境污染等问题的重要出路。纤维素的降解是三类酶协 同作用的结果，包括：内切纤维素酶(end〇-l，4-0-D_glucanase，EC 3.2.1.4,简称EG)，这类 酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子切 割产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；外切纤维素酶(exo-1，4-0-D_glucanase或 cellobiohydrolase，EC3.2.1.91，简称CBH)，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β_1， 4糖苷键，每次降解产生一个纤维二糖分子;β-葡糖苷酶(β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21， 简称BG)，这类酶作用于纤维二糖或纤维寡糖的非还原端，产生葡萄糖分子。其中BG通常不 直接作用于纤维素，但是它可以降解对纤维素降解起抑制作用的纤维二糖，所以它是快速 降解纤维素过程中所必须的酶类。因此对葡萄糖苷酶的深入研究受到人们越来越多的关 注，特别是β-葡萄糖苷酶的分子改良研究。
[0003] 本发明针对酶分子具体结构进行分析和改良，以达到提高催化效率的目的。本发 明所提供的高温酸性葡萄糖苷酶突变体对于纤维二糖底物的催化效率得到了极大地提 尚。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供了一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体Μ36Ν。
[0005] 本发明的再一目的是提供编码上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体Μ36Ν的基因。
[0006] 本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0008] 本发明以来源于嗜热真菌篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性β-葡萄糖苷酶为母本，采用分子生物学技术对酸性葡萄糖苷酶序列进行区域替换后表达。 [0009]根据本发明的高催化效率β_葡萄糖苷酶突变体，是β_葡萄糖苷酶的催化活性通道 loop区域替换后得到的突变体，即β-葡萄糖苷酶的36位氨基酸由甲硫氨酸"Μ"突变为天冬 酰胺"Ν"
[0010]所述高催化效率葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWNGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRFANPVTAFPAG INAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQA CAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGY IMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPP VAFSSWNGGKANVDVTCDHKSWRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLA MGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNL DPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIA KQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKEL FDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWV VPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
[0012] 所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013] TATGGCTTCGGCGGCTCTGGCTGGGACGCCGCTTATGGCAGAGCAAAGGCTGCGCTGAACAAGCTCAACCAGACCGA GAAGGTTGGTATCGTCACCGGTGTCAAGTGGAACGGCGGCCCTTGTGTTGGCAACACCTACAAGCCCAGTTCGATTG ACTACCCTTCTCTGTGTTTGCAAGACTCTCCTCTCGGGGTGCGTTTTGCCAACCCTGTGACTGCCTTCCCGGCTGGT ATCAACGCCGGCGCCACATGGGATAGATCTCTCATCAACGCCCGTGGTGCGGCCATGGGCGCTGAGGCCAAGGGCCT CGGTGTGAACGTCCAGCTTGGCCCCGTCGCTGGTCCTCTCGGCAAGAATCCCAATAGTGGCAGAATCTGGGAAGGGT TCTCGAATGATCCCTATCTCAGCGGTGTTGCGATGGAGGAAACCATCGCCGGAATGCAAGGATCTGGTGTGCAGGCC TGCGCCAAGCACTATATTGGTAACGAGCAAGAGCACAACCGTGAAACCATCAGCTCCAACATCGATGACCGCACTCT GCACGAGCTCTACGTCTGGCCGTTCATGAACGCCGTCAAGGCCAACGTCGCCTCCGTCATGTGCTCGTACAACGAGG TCAATGGTTCCTGGTCCTGTGAGAATGATGCTCTTCTCAACGGTCTGTTGAAGACTGAGCTCGGATTCCCCGGATAC ATCATGAGCGATTGGAACGCGCAGCACACCACGGTCAACAGCGCCAACTCGGGTCTCGATATGACCATGCCTGGCAG TGACTTCAACAACCCTCCTGGCAGCATCTACTGGGGGCCCAACCTCGAAGCCGCCGTCGCCAATGGCTCCGTTCCGC AGTCCCGTTTGGACGACATGGTCACTCGTATCCTTGCGTCTTGGTACTTGGTTGGCCAGGATGAGGGCTACCCACCG GTCGCCTTCAGCTCCTGGAATGGCGGCAAGGCCAATGTTGACGTGACGGGCGATCACAAGAGCGTCGTCAGAGCTGT GGCTCGTGACTCTATCGTTCTTCTGAAGAACGACAATAACGCTTTGCCTCTGCGCAAGCCCAAGAGCCTCGCGATCA TCGGCCAGGATGCAACTGTCAACCCTGCCGGGCCCAACGCTTGCTCTGATCGCGGCTGCGACACCGGTACTCTCGCC ATGGGTTGGGGCAGTGGTACCGCTCAGTTCCCATACATCGTCGGCCCTCTCGATGCTATCCAGTCTCAGGCTGCCGC TGATGGCACTAACATCACCACCAGCACGACCGATGATACCACCGCGGCAGCTTCTGCAGCCGCCTCCGCCGGAACCG CCATCGTCTTCATCAACTCCGACTCTGGTGAAGGTTACATCACCGTCGAGGGCAACGCTGGTGACCGCAACAACCTC GACCCCTGGCACAACGGCAACGAGCTCGTCCAGGCCGTTGCGGCTGTGAACAAGAATGTCATTGTCGTTGTCCACAG CGTCGGTCCCGTGATCTTGGAGGCTATCCTTGCACAGCCCAACGTCAAGGCCATTGTGTGGCCCGGTCTCCCTGGAC AAGAGAGCGGCAATGCCCTGGTCGATGTTCTGTACGGCTCCACCTCCCCCAGCGGCAAGTTGCCCTATACCATTGCC AAGCAGTTCAGCGACTATGGCACCACCTGGACGACCTCCCTGGTCGATGACTTCACCGAGGGTCTGTTCATTGACTA CCGCCACTTTGACGAGAACAACATTACTCCCAGATACGAGTTCGGATACGGCTTGTCTTACACCACCTTCAAATACT CCGACCTGGACGTCAACGTCCAGGCCCGCCCCGGCGCAGCCGAAGGCCCCATCGTCCCCGGCGGCGTCAAGGAACTT TTCGACACCGTCGGCACCGTCACCGTCACCGTCCAGAACAGCGGCAAGGTTGCCGGCGCGGAAGTTGCCCAGCTGTA CATCGGCCTTCCCGACTCTGCCCCGTCGACCCCTCCCAAGCAGCTCAGAGGATTCCAGAAGTTGCACCTCGCGCCCG GCCAGAGAGAGGGCGCCACTTTCGAACTCACCCGCCGAGACATCAGCTACTGGGACGTTCAGCAGCAGAAGTGGGTT GTTCCTAGCGGTACGTTCAAGGTCTATGTTGGAAGCTCGAGCAGGGACATTAGGGAGCAGGAATCTTTCCGTATTTG A
[0014] 本发明还是提供一种制备高催化效率β-葡萄糖苷酶的方法：
[0015] 1)采用over-lap PCR的方法扩增高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因序列；
[0016] 2)将催化效率β-葡萄糖苷酶突变体序列片段克隆到表达载体pPIC 9r上，重组载 体命名 pPIC9r-A-M36N;
[0017] 3)将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，诱导表达，获得突变株，优选为GS115/ A-M36N。
[0018] 本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体，优选为pPIC9r-A-M36N。将本发明的β-葡萄糖苷酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之 间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方 案，优选为将葡萄糖苷酶基因插入到质粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之 间，得到重组表达质粒pPIC9r-A-M36N。
[0019] 本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/ Α-Μ36Ν。