一种酮还原酶及其在不对称合成手性羟基化合物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酮还原酶，该酮还原酶的制备方法， 以及该酮还原酶作为催化剂在不对称合成手性羟基化合物中的应用。
【背景技术】
[0002] (R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯（(R)-HPBE，CAS 号：90315-82-5)是一种手性仲醇， 它是合成众多血管紧张素转化酶（ACE)抑制剂（即普利类药物）的关键手性砌块。
[0003]
[0004] 普利类药物主要用于治疗心力衰竭、高血压。目前在中国抗高血压药物市场上主 要有ACE抑制剂、钙拮抗剂、血管紧张素 II受体拮抗剂和β -受体阻滞剂四类抗高血压药 物。普利类药物近年受到沙坦类药物的影响，销量有所下降，但由于受到欧盟新标准和国内 一些厂家退出的影响，价格较为稳定。
[0005] 自1977年Ondetti等研究开发了第一代的卡托普利后，普利类药物已经拓展到80 多个衍生物，常见的几种普利药物如上所示。普利类药物由于具有疗效显著、不良反应小、 作用时间长等优点，在临床上仍有广泛的应用前景。由于（R)-HPBE是该药物的关键手性中 间体，对于（R)-HPBE合成新方法的研究仍具有较大的实用意义和工业应用前景。
[0006] 合成（R)-HPBE的方法包括化学法和生物法。其中，化学法是由价廉易得的原料 出发，经过多步反应最终合成（R)-HPBE。如由苯甲酸和丙酮酸经过多步反应生成2-羟 基-4-苯基丁酸，再经过去消旋化和酯化作用合成（R)-HPBE ;再如由乙二酸二乙酯和苯丙 酸乙酯作为起始原料，合成2-羰基-4-苯基丁酸乙酯后经过不对称氢化得到（R)-HPBE。化 学法在产物规模上具有较为明显的优势，可达到500公斤的生产规模，但是，化学法要用到 重金属Pt等污染环境的催化剂，无法满足绿色化学的要求且成本较高。另外，化学法存在 收率较低、反应条件较为苛刻、对底物的纯度要求高、得到的产物的光学活性较低等缺点， 所以不适合进行规模化生产的进行。
[0007] 目前生物法合成（R) -HPBE主要有两种途径，一种是利用脂肪酶来拆分rac-HPBE 得到（R)-HPBE，或拆分rac-HPBA后经过乙酯化得到（R)-HPBE。另一种途径是用酮还原酶 0ΡΒΕ或0ΡΒΑ进行不对称还原，生成（R) -HPBE或（R) -HPBA，（R) -HPBA可经过进一步酯化合 成（R)-HPBE。利用酮还原酶进行不对称还原，理论得率可以达到100%，而脂肪酶的理论得 率最高只能达到50%，酮还原酶具有一定的优势，但酮还原酶催化反应通常需要额外添加 价格昂贵的辅酶NAD +/NADP+。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的不对称还原反应制备（R)-HPBE反 应中收率较低、反应条件较为苛刻、对底物的纯度要求高、得到的产物的光学活性较低、或 者需要添加价格昂贵的辅酶等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性 好的酮还原酶，以及使用该酮还原酶催化合成（R)-HPBE，进而进一步合成普利类药物的 酶-化学合成方法。还提供了编码该酮还原酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载 体、重组表达转化体及该酮还原酶的制备方法，以及该酮还原酶在催化羰基底物不对称还 原中的用途。
[0009] 本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
[0010] 本发明的第一方面提供了一种酮还原酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白质：
[0011] (a)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[0012] SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有酮还原酶的功 能，是一种新的酮还原酶。
[0013] (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有酮还原酶活性的蛋白质。
[0014] 其中，所述的"几个"是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比 如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白。根据本发明，在如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋 白质分子中进行1~5个氨基酸残基的突变，仍然保持酮还原酶活性。也就是说，只要由（a) 衍生的蛋白质具有酮还原酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。
[0015] (c)与（a)的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同一性且具有酮还原酶活性的蛋白质。
[0016] SEQ ID N0:2所示的酮还原酶和其他已知酮还原酶的氨基酸序列的同一性低于 90%，具有显著差异性，例如与吗啡脱氢酶YtbE之间的同一性为85%。
[0017] 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Blastp程序进行比对，默认参数。
[0018] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的酮还原酶。优选地， 所述核酸是由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列组成的。
[0019] 由SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境DNA，其可以从土壤样本 中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全 基因人工合成获得。
[0020] 本发明中，SEQ ID N0:1所示的基因命名为BYK-KRED，全长843bp。其中，其编码 序列（CDS)从第1个碱基起至第840个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该 序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
[0021] 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID N0:2的氨基酸序列的 核酸序列不仅仅局限于SEQ ID N0:1。本发明的酮还原酶基因的核酸序列也可以是编码序 列表中SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入替 换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过 对核酸序列SEQ ID NO: 1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来 制得。
[0022] SEQ ID NO: 1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号 序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有 负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全 替换，可提商目标蛋白的表达水平。
[0023] SEQ ID NO: 1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID NO: 1所示序列的核酸 进行杂交的核酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方 式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个 载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂 交缓冲液的组成为〇. lwt % SDS、5wt %硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2~ 8 X SSC (20 X SSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液）；杂交温度为50~70°C;在培 养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓 冲液的组成为6XSSC+0. lwt% SDS溶液，更优选为5XSSC+0. lwt% SDS ;当用这种清洗缓 冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA 分子。
[0024] 本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码酮还原酶的核酸序列的重组 表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码酮还原酶或其突变体的核酸序列 连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的 质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET系列质粒。较佳地，可通过下述方法制得本发明 的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET21a分别用限制性内 切酶Nde I和Hindlll双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发 明的编码酮还原酶的核酸序列的重组表达质粒pET21a-BYK-KRED或含有编码其突变体的 核酸序列的重组表达质粒。
[0025] 本发明的第四个方面提供了一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。