一种热稳定性提高的β‑淀粉酶突变体的制作方法

文档序号：11246263阅读：1211来源：国知局

本发明涉及一种热稳定性提高的β-淀粉酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术：

β-淀粉酶又称为麦芽糖苷酶、糖原淀粉酶，其系统名为α-1,4-葡聚糖-4-麦芽糖水解酶(α-1,4-dglucanmaltohydrolase)，e.c.编号为3.2.1.2.作用于淀粉时，从其非还原性末端顺次切下麦芽糖，水解产物是β-麦芽糖、β-极限糊精及非常少量的β-葡萄糖。β-淀粉酶具有相当大的工业应用价值，长期以来植物来源的大麦β-淀粉酶一直被广泛用于多个领域。例如，在啤酒发酵业中部分代替大麦芽用于啤酒的生产，在食品业中用于水解淀粉制造麦芽糖浆和饴糖等。自1974年higashihara等人首次确定巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)胞外淀粉酶含有β-淀粉酶以来，相继发现了几种能够产生该酶的微生物，这些菌株大都属于细菌，如蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)、多粘芽孢杆菌(bacilluspolymyxa)、环状芽孢杆菌(bacilluscirculans)、高温放线菌(thermeoactinomycessp.)和热硫梭菌(clostridiumthermosulfurogenes)等。与植物β-淀粉酶相比，微生物来源的β-淀粉酶具有便于大规模工业化生产的优点，因此筛选寻找理想的微生物β-淀粉酶源成为淀粉酶研究应用领域的一个重要目标。

定向进化属于蛋白质的非理性设计，不需要事先了解蛋白质的结构、催化机制、保守序列等因素，而是通过模拟自然进化机制来为酶基因创造体外进化的条件，进而对目的蛋白进行分子改造，并定向筛选研究进化酶的酶学性质。易错pcr技术是目前应用最广泛的定向进化方法之一，具有操作方便、快速、高效的优点。对于微生物来源β-淀粉酶的研究，目前主要是围绕不同宿主的克隆表达、酶学定性，而针对其酶学性质的分子改造显得较少，在定向进化研究其热稳定性方面，尚未见相关文献报道。

发明人在前期的研究中从菜地土壤中成功的筛选到了一株高产β-淀粉酶的弯曲芽孢杆菌(bacillusflexus)cctcc2015368的菌株，并将该菌株的β-淀粉酶基因序列克隆出来，成功的在大肠杆菌(escherichiacoli)宿主中表达。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种热稳定性提高的β-淀粉酶突变体。

所述热稳定性提高的β-淀粉酶突变体，是对亲本弯曲芽孢杆菌(bacillusflexus)cctcc2015368β-淀粉酶进行定向进化，通过分子进化的手段之一易错pcr技术，获得β-淀粉酶突变体。亲本β-淀粉酶氨基酸序列如seqidno：1所示。采用“原始氨基酸-替换位置-突变后氨基酸”来表示β-淀粉酶突变体，β-淀粉酶突变体为thr461tyr/asp506asn/asp519lys，氨基酸序列为seqidno:2。

用于表达所述的β-淀粉酶突变体的表达载体为pet24a(+)；

用于所述的表达载体转化的微生物宿主为大肠杆菌(escherichiacoli)。

与亲本弯曲芽孢杆菌β-淀粉酶相比(55℃下的半衰期t50为18.0min)，所述β-淀粉酶突变体在55℃下的半衰期t50提高了3倍，达到54min。本发明的有益效果：运用了分子生物学的方法对亲本弯曲芽孢杆菌β-淀粉酶进行了定向进化研究，通过易错pcr技术获得了β-淀粉酶突变体，与亲本弯曲芽孢杆菌β-淀粉酶相比(55℃下的半衰期t50为18.0min)，β-淀粉酶突变体在55℃下的半衰期t50提高了3倍，达到54min。

附图说明

图1：野生型β-淀粉酶与突变体bea-10的最适温度比较；

图2：野生型β-淀粉酶与突变体bea-10在55℃下的热稳定性比较。

具体实施方式

实例中涉及到的培养基及试剂配方如下：

lb液体培养基：酵母粉5.0g/l，胰蛋白胨10.0g/l，nacl10.0g/l。

lb固体培养基：在lb液体培养基的基础配方上，添加1.0％-2.0％(m/v)的琼脂。

tb培养基：酵母粉24.0g/l，甘油5.0g/l，胰蛋白胨12.0g/l，k2hpo4·3h2o16.43g/l，kh2po42.31g/l。

sob培养基：胰蛋白胨20.0g/l，酵母粉5.0g/l，mgcl20.952g/l，nacl0.5g/l，kcl0.186g/l。

lb琼脂淀粉板：在lb液体培养基的基础上添加可溶性淀粉1g/l，用于突变体的初步筛选。

实施例1：基于易错pcr技术构建β-淀粉酶突变体文库

运用易错pcr技术向弯曲芽孢杆菌β-淀粉酶基因中引入核苷酸突变。易错pcr的反应条件如下：

其中上游引物f和下游引物r的序列分别为：

f：(5′-aaccatggcggtaaatggacagtcgtt-3′)；

r：(5′-aactcgagttaccaattattcgtatacgttg-3′)。

pcr扩增程序为：94℃4min；98℃10s，53℃10s，72℃1min40s，30个循环；72℃延伸10min，并于4℃下保温。

易错pcr产物经琼脂糖凝胶试剂盒胶回收，目的基因与载体pmd-18t连接转化jm109，克隆培养后，用限制酶ncoi和xhoi将目的基因片段回收与经过ncoi和xhoi双酶切消化后的表达载体pet24a(+)相连，转化至e.colijm109感受态细胞。涂布lb抗性平板(kan)，37℃培养8-10个小时，将转化子全部转移至lb液体培养基中培养，并抽提重组突变体质粒。

将重组突变体质粒转化e.colibl21(de3)感受态细胞。在lb平板上(kan)培养获取β-淀粉酶突变体文库。

实施例2：热稳定性提高的β-淀粉酶突变体的筛选

以pet24a(+)表达亲本β-淀粉酶的大肠杆菌作为对照菌。

lb琼脂淀粉板初筛：重组菌e.colibl21(de3)/pet24a(+)-bfa于tb发酵培养基中诱导表达48h，离心获得胞外上清，利用高通量筛选系统将96空板中每一个突变体的发酵液一一转移到lb琼脂淀粉板上。37℃下过夜培养8h左右，用碘液(0.03％w/v)涂布琼脂淀粉板，观察透明圈，选取比对照明显大的透明圈所对应的突变菌株。

96孔板dns法定量筛选：挑选透明圈比对照高的突变菌株，用排枪快速将发酵上清转移到pcr管中(转移前用1：1的磷酸缓冲液与发酵液混合)，在55℃的金属浴上保温40min，采用dns法测定保温前与保温后的酶活，在540nm处下测定吸光值并记录数据，通过计算残留酶活力从而选出热稳定性有提高的突变株。

实施例3：酶活分析方法

一个β-淀粉酶酶活单位(1u)定义(u/ml)：1ml酶液在ph7.0，温度55℃,1h水解可溶性淀粉生产1mg麦芽糖所需的酶量称为一个酶活力单位。

测定方法：准确吸取0.5ml2％可溶性淀粉溶液，置于15ml比色管中，加0.4ml50mmph7.0磷酸盐缓冲溶液，摇匀，于55℃水浴预热5min，准确加入100μl酶液，立即计时，摇匀，于55℃水浴准确保温酶解反应10min，立即加入dns1ml，摇匀，并煮沸5min，冰水中冷却。以同样条件下用缓冲液代替酶液的反应体系作为对照，上述反应体系加10ml蒸馏水，混匀，1cm比色皿，540nm波长下测吸光度。

实施例3：β-淀粉酶突变体的纯化

将发酵上清液于4℃，12000rpm离心10min除去细胞。将上清液置于磁力搅拌器中并缓缓加入45％固体硫酸铵盐，于4℃过夜盐析。然后4℃，12000rpm离心20min。取沉淀物用适量ph7.0，50mm磷酸-柠檬酸缓冲液溶解，通过0.4μm透析膜过滤透析后得到浓缩酶样品。经过凝胶层析柱纯化后得到电泳纯的β-淀粉酶。

实施例4：β-淀粉酶突变体的最适温度和热稳定性

酶分子热稳性的提高可以用半衰期(t50)来体现。即酶分子的活力降低到初始活力一半时所需要的时间。酶的半衰期时间越长，则酶的热稳定性越高。反之，它的热稳定就比较差。

以ph7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠(50mm)为缓冲液，在30-70℃温度范围测定野生型β-淀粉酶及突变体bfa-10(即thr461tyr/asp506asn/asp519lys)的最适温度。突变体和野生型β-淀粉酶的最适温度和热稳定性见图1和图2。

从图1可以得知，野生型和突变体bfa-10β-淀粉酶的最适温度均为55℃；在30-55℃的温度范围内，β-淀粉酶的相对活力没有明显的变化；值得注意的是，当温度升高到60℃和65℃时，突变体bfa-10能够保留最初酶活的75％和44％，而野生型仅保留其酶活的37％和23％。在最适温度55℃的条件下，测定不同时间点残留酶活来确定突变体bfa-10的热稳定性，并与野生型相比较(图2)；从图2可知，突变体bfa-10在55℃下的半衰期为54min，而野生型的半衰期只有18min。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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