一种在蛋白纳米笼内部包装外源物质的方法与流程

本发明涉及生物化学技术领域，具体而言涉及一种在蛋白纳米笼内部包装外源物质的方法。

背景技术：

蛋白纳米笼简称蛋白笼，是由一种或几种蛋白质亚基自组装形成的直径为10～200nm的中空笼状结构，如病毒样颗粒(virus-likenanoparticle，vlp)、铁蛋白(ferritin)、细菌微区(bacterialmicrocompartment，bmc)等。利用蛋白笼易于制备、生物相容性好、均质性高、解聚组装状态可人为调控等优势可制备多功能纳米结构和器件。常用的制备方式之一是通过分子自组装在蛋白笼内部包装外源物质。外源物质的类型包括纳米材料、蛋白质、核酸、药物等。大量研究表明，包装外源物质的蛋白笼在生物医学成像、生物传感、递送、诊疗、催化等领域具有重要应用价值。

目前，变换溶液条件控制解聚组装是在蛋白笼内部包装外源物质的通用技术。蛋白笼首先解聚形成寡聚体，再与待包装的外源物质混合；依赖于外源物质和寡聚体的亲和作用、静电吸引、或者外源物质上带有的核酸作为包装信号，寡聚体和外源物质发生相互作用；溶液从解聚条件变换为组装条件后，蛋白笼发生组装的同时将外源物质包装在内。例如，通过改变ph、盐离子浓度、氧化还原条件，在猴病毒40(sv40)vlp和红三叶草坏死花叶病毒(rcnmv)vlp可包装多种外源物质。然而，一些具有重要应用前景的蛋白笼稳定性很强，导致其解聚需要极端的溶液条件，如细菌噬菌体(ms2)、乙肝病毒核心蛋白(hbc)、鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(p22)vlp以及哺乳动物铁蛋白等。极端的溶液条件易造成待包装外源物质的沉淀、变性、失活等，进而导致外源物质不能被包装或包装后丧失功能。由于外源物质的活性或功能对于后续成像，递送，传感，治疗等应用至关重要，因此，急需研发一种对外源物质具有良好兼容性的包装技术。

技术实现要素：

发明人在长期实践中发现：与胶束、微管的组装类似，蛋白笼的组装存在临界组装浓度，当蛋白笼组分的浓度低于临界组装浓度时，即使在组装条件下，寡聚体也不会组装成蛋白笼而继续维持解聚状态。利用蛋白笼解聚与组装的可控性及临界组装浓度，通过蛋白笼组分浓度的提高驱动蛋白笼的组装，本发明可灵活选择组装条件，从而保证不影响待包装外源物质的稳定性和活性，实现外源物质的无损包装。本发明提供了一种在蛋白纳米笼内部包装外源物质的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种在蛋白纳米笼内部包装外源物质的方法，包括以下步骤：

s1：测出蛋白笼的临界组装浓度；

s2：将蛋白笼解聚成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，直至蛋白笼组分的浓度低于临界组装浓度；

s3：向寡聚体中加入外源物质并混匀，得到混合物，浓缩该混合物，直至蛋白笼组分的浓度高于临界组装浓度使组装暨包装发生，纯化即可。

进一步，所述步骤s1中，蛋白笼的临界组装浓度的测定包括以下步骤：

s11：配制系列蛋白笼组分浓度呈梯度变化的寡聚体溶液，并分别透析到组装缓冲液中，得到蛋白液；

s12：将蛋白液离心并取上清液，将上清液作为超滤初始液进行超滤，取滤过液；

s13：以蛋白笼组分浓度的自然对数为横坐标，滤过液与超滤初始液的蛋白浓度比值为纵坐标，作散点图，拟合玻尔兹曼类型的曲线，曲线斜率绝对值最大时横坐标对应的蛋白浓度值即为临界组装浓度。

进一步，所述步骤s12中，蛋白液离心转速为10000rpm，离心时间为10-30min，超滤上清液的超滤管截留分子量为100kd，超滤转速为4000rpm，超滤时间为10-30min。

当蛋白笼组分的浓度小于临界组装浓度时，寡聚体能够穿过超滤管的滤膜，滤过液与超滤初始液的蛋白浓度比值较大，接近100％，曲线斜率绝对值较小，接近0。随着蛋白笼组分浓度的增大，寡聚体相互作用，导致滤过液与超滤初始液的蛋白浓度的比值逐渐减小，曲线斜率绝对值增大。当蛋白笼组分的浓度达到临界组装浓度时，寡聚体开始组装形成蛋白笼而不能穿过超滤管滤膜，滤过液与超滤初始液的蛋白浓度比值突然下降，此时，曲线斜率绝对值最大。当蛋白笼组分的浓度大于临界组装浓度时，组装效率随浓度增大逐渐接近100％，曲线斜率绝对值逐渐接近0。

进一步，所述步骤s3中，用聚乙二醇20000浓缩混合物，直至蛋白笼组分的浓度高于临界组装浓度，使组装暨包装发生，采用蔗糖密度梯度离心的方法纯化包装后的产物。

进一步，所述浓缩混合物及超滤上清液的过程均在4℃环境下进行。

本发明的有益效果：

1、本发明利用蛋白笼解聚与组装的可控性及临界组装浓度，通过蛋白笼组分浓度的提高以驱动蛋白笼的组装，本发明可灵活选择组装条件，从而保证不影响待包装外源物质的稳定性和活性，实现外源物质的无损包装。

2、本发明可用于不同种类的蛋白笼和外源物质，普适性强。本发明可用于包装不同种类以及同种类不同表面修饰、不同粒径的外源物质，如金纳米颗粒、近红外ⅱ区硫化银量子点、可见光硒化镉量子点、超负电荷的绿色荧光蛋白等，同时，本发明适用于不同种类的蛋白笼，如ms2vlp、sv40vlp等。

3、本发明从解聚处理到包装完成仅需6个小时，比传统方法显著省时。

附图说明

图1是测量ms2vlp临界组装浓度的拟合曲线，其中横坐标为蛋白笼组分浓度的自然对数，纵坐标为滤过液与超滤初始液蛋白浓度的比值；

图2(a)是利用本发明在ms2vlp内包装近红外ⅱ区硫化银量子点的透射电镜图；

(b)是利用本发明在ms2vlp内包装近红外ⅱ区硫化银量子点的光吸收和荧光光谱图；

图3是利用本发明在ms2vlp内包装金纳米颗粒的透射电镜图；

图4(a)是利用本发明在ms2vlp内包装超负电荷绿色荧光蛋白的蔗糖密度梯度离心图；

(b)是利用本发明在ms2vlp内包装超负电荷绿色荧光蛋白的透射电镜图；

图5(a)是利用本发明在ms2vlp内包装超负电荷绿色荧光蛋白的荧光光谱图；

(b)是未包装的超负电荷绿色荧光蛋白的荧光光谱图；

图6是利用本发明在sv40vlp内包装近红外ⅱ区硫化银量子点的透射电镜图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

本实施例所述蛋白笼为ms2vlp，所述外源物质为近红外ⅱ区硫化银量子点，其直径是5nm。

首先，配制系列ms2vlp组分浓度呈梯度变化的寡聚体溶液，浓度分别为0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.075mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml和0.8mg/ml，将寡聚体分别透析到组装缓冲液中，得到蛋白液，将蛋白液离心并取上清液，离心转速是10000rpm，离心时间是15min，将上清液作为超滤初始液进行超滤，超滤上清液的超滤管截留分子量为100kd，超滤转速为4000rpm，超滤时间为10-30min，取滤过液，如图1所示，以ms2vlp组分浓度的自然对数为横坐标，滤过液与超滤初始液的蛋白浓度比值为纵坐标，作散点图，拟合玻尔兹曼类型的曲线，曲线斜率绝对值最大时横坐标对应的浓度值即为临界组装浓度。由此测定ms2vlp的临界组装浓度为0.17mg/ml。

然后，用醋酸将ms2vlp解聚成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，直至ms2vlp组分的浓度为0.05mg/ml，本实施例中所用组装缓冲液组成是20mmpb(na2hpo4-nah2po4)、100mmnacl、250mmtmao，其ph值是7.2。

最后，设定ms2vlp与硫化银量子点的摩尔比为1：2，加入二氢硫辛酸(dhla)修饰的硫化银量子点并混匀，加入包有聚乙二醇20000、截留分子量为3.5kd的透析袋，于旋转混合仪上混匀并使蛋白逐渐浓缩，直至ms2vlp组分的浓度不低于0.2mg/ml，组装暨包装完成，浓缩过程在4℃环境进行，从解聚处理到包装完成用时6h。

图2(a)是利用本发明在ms2vlp内包装近红外ⅱ区硫化银量子点的透射电镜图，由图可见，一个ms2vlp内有且只有一个硫化银量子点，表明利用本发明可维持硫化银量子点的稳定性、实现在ms2vlp内包装硫化银量子点。当采用传统的48h孵育方法包装近红外ⅱ区硫化银量子点时，其具体步骤如下：首先用醋酸将ms2vlp解聚成寡聚体。然后用含有硫化银量子点的组装缓冲液稀释寡聚体，直至ms2vlp组分的浓度为0.3mg/ml，混匀后得到混合物,此时混合物所处溶液的ph值为5.5-6.0。最后于4℃放置此混合物48h。由于硫化银量子点加入后溶液的ph值是5.5-6.0，此酸性条件导致硫化银量子点完全沉淀而不能被包装，即硫化银量子点与此条件不兼容，而利用本发明可保持硫化银量子点的稳定性并成功包装。

另外，对包装前后硫化银量子点的荧光强度进行了测试与比较，如图2(b)所示。虚线是包装于ms2vlp内的硫化银量子点的荧光光谱，实线是未包装的硫化银量子点的荧光光谱。两种样品中硫化银量子点浓度相同。由图可见，与未包装的硫化银量子点相比，利用本发明包装后硫化银量子点完全保持了其荧光发射特性。

实施例二：

本实施例所述蛋白笼为ms2vlp，所述外源物质为金纳米颗粒，其直径是5nm。

用醋酸将ms2vlp解聚成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，直至ms2vlp组分的浓度为0.05mg/ml，本实施例中所用组装缓冲液组成是20mmpb(na2hpo4-nah2po4)、100mmnacl、250mmtmao，其ph值是7.5。设定ms2vlp与金纳米颗粒的摩尔比为1：2，加入dhla修饰的金纳米颗粒，加入包有聚乙二醇20000、截留分子量是3.5kd的透析袋，于旋转混合仪上混匀并使蛋白逐渐浓缩，直至ms2vlp组分浓度不低于0.2mg/ml，浓缩过程在4℃环境进行，从解聚处理到包装完成用时6h。

图2(a)是利用本发明在ms2vlp内包装金纳米颗粒的透射电镜图，由图可见，一个ms2vlp内有且只有一个金纳米颗粒，可见利用本发明可实现在ms2vlp内包装金纳米颗粒。当采用传统的48h孵育方法包装金纳米颗粒时，其具体步骤如下：首先用醋酸将ms2vlp解聚成寡聚体。然后用含有金纳米颗粒的组装缓冲液稀释寡聚体，直至ms2vlp组分的浓度为0.3mg/ml，混匀后得到混合物,此时混合物所处溶液的ph值为5.5-6.0。最后于4℃放置此混合物48h。由于金纳米颗粒加入后溶液的ph值是5.5-6.0，此酸性条件导致金纳米颗粒完全沉淀而不能被包装，即金纳米颗粒与此条件不兼容。由此可见，利用本发明可保持金纳米颗粒的稳定性、实现ms2vlp对金纳米颗粒的包装。

实施例三：

本实施例所述蛋白笼是ms2vlp，所述外源物质是超负电荷绿色荧光蛋白。

用醋酸将ms2vlp解聚成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，直至ms2vlp组分的浓度为0.05mg/ml，本实施例中所用组装缓冲液组成是20mmpb(na2hpo4-nah2po4)、100mmnacl、250mmtmao，其ph值是7.3。设定ms2vlp与超负电荷绿色荧光蛋白的摩尔比为1：180，加入超负电荷绿色荧光蛋白，加入包有聚乙二醇20000、截留分子量是3.5kd的透析袋，于旋转混合仪上混匀并使蛋白逐渐浓缩，直至ms2vlp组分浓度不低于0.2mg/ml，浓缩温度是4℃，从解聚处理到包装完成用时6h。

图4(a)是紫外光照射下在ms2vlp内包装超负电荷绿色荧光蛋白的蔗糖密度梯度离心图，由图可见：蔗糖密度梯度后超负电荷绿色荧光蛋白与ms2vlp共存。

图4(b)是在ms2vlp内包装超负电荷的绿色荧光蛋白的透射电镜图，由图可见在ms2vlp内有遮光性蛋白。

图5(a)是利用本发明及传统48h孵育方法在ms2vlp内包装超负电荷绿色荧光蛋白的荧光光谱图，实线是利用本发明在ms2vlp内包装超负电荷绿色荧光蛋白的荧光光谱，虚线是利用传统的48h孵育方法在ms2vlp内包装超负电荷绿色荧光蛋白的荧光光谱。两种样品中超负电荷绿色荧光蛋白的浓度相同。由图可见，与传统的48h孵育方法相比，利用本发明包装后超负电荷的绿色荧光蛋白的荧光强度提高了20％。

图5(b)是在相同浓度下未包装的超负电荷绿色荧光蛋白的荧光光谱图，结合图5(a)可见，利用本发明包装后超负电荷绿色荧光蛋白的荧光强度与未包装的超负电荷绿色荧光蛋白的荧光强度相差不大，而传统的48h孵育方法却使超负电荷绿色荧光蛋白的荧光强度减少了20％。由此可见，利用本发明包装后维持了超负电荷绿色荧光蛋白的活性，而传统的48h孵育方法却使其荧光发生一定程度的淬灭。

通过实施例一至三得出，本发明对于外源物质的包装具有较强的普适性，本发明可包装不同种类的外源物质如金纳米颗粒、近红外ⅱ区硫化银量子点、超负电荷绿色荧光蛋白等。此外，利用本发明还可包装同种类不同表面修饰及不同粒径的外源物质，如金纳米颗粒等，在此不再赘述。

实施例四：

本实施例所述蛋白笼为sv40vlp，所述外源物质为近红外ⅱ区硫化银量子点，其直径是5nm。

用碱性的解聚缓冲液将sv40vlp解聚成寡聚体，所述解聚缓冲液是10mmtris-hcl、200mmnacl、2mmdtt、1mmedta，其ph值是8.8。用组装缓冲液稀释寡聚体，直至sv40vlp组分的浓度为0.05mg/ml，所述组装缓冲液是10mmtris-hcl、250mmnacl、2mmcacl2，其ph值是7.2，静置48h后用透射电镜检测，结果表明sv40vlp在此浓度下无组装现象，由此可见sv40vlp的临界组装浓度大于0.05mg/ml，设定sv40vlp与硫化银量子点的摩尔比为1：2，加入dhla修饰的硫化银量子点，加入包有聚乙二醇20000、截留分子量是3.5kd的透析袋，于旋转混合仪上混匀并使蛋白逐渐浓缩，直至ms2vlp组分的浓度不低于0.2mg/ml，浓缩温度是4℃，从解聚处理到包装完成用时6h。

图6是在sv40vlp内包装近红外ⅱ区硫化银量子点的透射电镜图，由图可见，一个sv40vlp内有且只有一个硫化银量子点，可见利用本发明可实现sv40vlp对硫化银量子点的包装。由此可见本发明也适用于在碱性条件下解聚、中性条件下组装的蛋白笼。

通过实施例一和四得出，本发明对于蛋白笼具有较强的普适性，本发明适用于不同种类的蛋白笼，如ms2vlp、sv40vlp。此外，本发明也适用于其他蛋白笼，如雀麦草花叶病毒(bmv)vlp，豇豆褪绿斑驳病毒(ccmv)vlp等，在此不再赘述。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。