基于空心介孔硅-dna复合材料及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米生物医学领域，具体涉及一种基于空心介孔硅-DNA复合材料及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]至今为止，癌症依然是世界上最难攻克的重大疾病之一。尽管全世界对癌症的研宄投入了大量精力及科研资金，癌症仍然是引起死亡的主要原因之一，并给社会经济带来巨大损失。近年来，多功能纳米治疗系统因为具有多重优异的性能而备受关注。它可以集成像，靶向，定位，可控药物释放等于一身，从而提高治疗效果。目前，多功能治疗体系成为癌症治疗和成像的热门。众多多功能体系被发明和报道，这些报道多集中于无机纳米粒子，如基于磁性纳米粒子、上转换纳米粒子、碲化镉量子点、金纳米粒子等，对其进行修饰，使其具有多功能化。
[0003]虽然在构建此系统方面取得了一定的进展，但大部分都是将具有不同功能的材料生硬的堆积在一起，复杂繁琐，并可能导致毒性问题。到目前为止，如何构建一个简单安全的多功能治疗系统依然是一个挑战。作为具有独特结构和多重性质的智能生物大分子，近年来，DNA已超出其自然角色，被应用于众多生物领域中。例如，它被开发应用于微型生物传感器，显微外科，纳米机器人，药物输送，动态的纳米材料等各种新型器件中。同时，其众多优异的性质还为应用于治疗领域提供了可能性:1)许多药物小分子可以与它结合，并具有序列选择性。2)它具有多种构象，且通过设计一定的序列，其能在某些刺激，如温度，质子浓度，金属离子，光或者磁场等控制下在两种或两种以上的构型之间变换。这为实现智能的结合和释放药物提供了可能性。3)通过“指数富集配体系统进化(SELEX) ”法筛选出来的适配体DNA可以对特定的小分子，蛋白，细胞甚至器官具有靶向性，因而可用于靶向药物运载。4)许多荧光金属纳米簇可以DNA为模板合成，从而可用于生物成像。由于DNA拥有以上多种治疗相关的功能于一身，且本身具有优异的生物相容性，其有望被构建成一个简单，智能，安全的多功能治疗器件。
[0004]现有技术有报道过用介孔娃-DNA复合材料(The packaging of siRNA withinthe mesoporous structure of silica nanoparticles)，该文献中将DNA装载入介孔娃的孔道里，并用于基因治疗，但是目前为止还没有报道过将有功能的DNA纳米机器装载入空心介孔硅的空腔里，并将这一复合材料用于多功能药物载体。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了提供一种基于空心介孔硅-DNA复合材料及其制备方法和应用，该空心介孔硅-DNA复合材料能用于多功能药物载体及成像体系，实现癌症的治疗和成像。
[0006]本发明首先提供一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，包括如下步骤:
[0007]步骤一:在Fe3O4纳米粒子上包覆娃壳，得到Fe 304@nSi02纳米粒子，将Fe 304inSi02纳米粒子溶于混合溶剂中，然后加入正硅酸乙酯搅拌，得到反应产物，将反应产物溶解于丙酮溶液中，然后用盐酸溶液刻蚀除去Fe3O4内核，得到空心介孔硅；
[0008]步骤二:将富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液混合，得到混合溶液，将步骤一得到的空心介孔硅加入混合溶液中，在室温下反应l_2h，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
[0009]优选的是，所述的步骤一中混合溶剂为十六烷基三甲基溴化铵和乙醇的混合液。
[0010]优选的是，所述的步骤一中刻蚀温度为70_90°C，刻蚀时间为8_12h。
[0011 ] 优选的是，所述的步骤二中富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液的体积比为1:1:4。
[0012]优选的是，所述的步骤二中混合溶液的体积(μ L):空心介孔硅的质量(mg)为60:0.3。
[0013]本发明还提供上述制备方法得到的空心介孔硅-DNA复合材料。
[0014]本发明还提供空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的应用。
[0015]优选的是，所述的空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的方法为:将空心介孔硅-DNA复合材料与AgNO3溶液在0°C，黑暗环境下孵育2-3h，然后加入NaBH 4，剧烈震荡2-4min，将得到的混合液在4°C静置24_48h，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇，然后将药物加入空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇中，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物。
[0016]优选的是，所述的空心介孔硅-DNA复合材料、AgNO3, NaBHj^质量比为1000:4.5:1ο
[0017]本发明的有益效果
[0018]本发明首先提供一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，该制备方法是将富C茎环结构DNA引入空心介孔硅中，该制备方法简单，操作方便。
[0019]本发明还提供上述制备方法得到的空心介孔硅-DNA复合材料，该复合材料具有高的生物相容性，并且可以作为药物载体使用。
[0020]本发明还提供空心介孔硅-DNA复合材料的应用，该复合材料由于具有高的生物相容性，并且集中药物运载，pH控制的细胞成像以及药物释放监测过程到一个简单的DNA器件中，利用Ag纳米簇荧光的变化及药物荧光的叠加检测药物释放过程和进行细胞微环境成像，用于癌症的治疗及成像。
【附图说明】
[0021]图1为实施例1所用的富C茎环结构DNA在中性/酸性条件下药物的结合与释放的不意图；
[0022]图2为实施例1所用的富C茎环结构DNA在pH7.4或者pH5.0的UV热变性曲线图；
[0023]图3为实施例1所用的富C茎环结构DNA在pH7.4或者pH5.0的⑶曲线图；
[0024]图4为当pH从7.4变到5.0时富C茎环结构DNA对Hoechst的结合与释放时的荧光变化图；
[0025]图5为在中性/酸性条件下DNA-Ag纳米簇荧光变化示意图；
[0026]图6为DNA-Ag纳米簇的透射电镜图；
[0027]图7为DNA-Ag纳米簇不同pH条件下的紫外-可见吸收光谱；
[0028]图8为DNA-Ag纳米簇在紫外平板下的荧光照片；
[0029]图9为实施例1得到的空心介孔硅的透射电镜图；
[0030]图10为空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇的透射电镜图；
[0031]图11为实施例4得到的空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物在pH7.4时的发射光谱；
[0032]图12为实施例4得到的空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物在pH5.0时的发射光谱；
[0033]图13为空心介孔娃-DNA-Ag纳米簇-Hoechst和空心介孔娃-DNA-Ag纳米簇-Hoechst与A549细胞孵育后的荧光显微镜成像图。
【具体实施方式】
[0034]本发明首先提供一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，包括如下步骤:
[0035]步骤一:在Fe3O4纳米粒子上包覆娃壳，得到Fe 304@nSi02纳米粒子，将Fe 304inSi02纳米粒子溶于混合溶剂中，然后加入正硅酸乙酯搅拌，得到反应产物，将反应产物溶解于丙酮溶液中，然后用盐酸溶液刻蚀除去Fe3O4内核，得到空心介孔硅；
[0036]步骤二:将富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液混合，得到混合溶液，将步骤一得到的空心介孔硅加入混合溶液中，在室温下反应l_2h，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
[0037]按照本发明，首先在Fe3O4纳米粒子上包覆娃壳，得到Fe 304@nSi02m米粒子，所述的Fe3O4纳米粒子的直径优选为150-300nm，更优选为200nm，所述的Fe 304纳米粒子的制备为本领域常用的制备方法，优选为水热法；所述的在Fe3O4纳米粒子上包覆硅壳优选通过碱性水解TEOS的方法，具体为将Fe3O4纳米粒子超声溶解于乙醇-水混合液中，所述的混合液中乙醇(ml):水(ml)为4:1，然后加入TEOS，Fe3O4纳米粒子与TEOS的质量比为1:60，最后加入氨水，氨水与混合液的体积比为1:10，超声2小时，得到产物Fe3O4OnS12纳米粒子。
[0038]按照本发明，将上述Fe304@nSi02m米粒子溶于混合溶剂中，然后加入正硅酸乙酯搅拌，得到反应产物，所述的混合溶剂优选为十六烷基三甲基溴化铵、乙醇和超纯水的混合液，所述的混合液中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的质量(g):乙醇的体积(ml):超纯水的体积(ml)为0.3:60:80o所述的搅拌温度优选为室温，搅拌时间优选为5_7h，更优选为6h，所述的Fe3O4纳米粒子与正硅酸乙酯(TEOS)的质量比为1:60 ;得到的反应产物经分离、水洗干燥，将干燥的产物溶于丙酮溶液中脱去CTAB模板，然后用盐酸溶液刻蚀除去Fe3O4内核，得到空心介孔硅；所述的刻蚀温度优选为70-90°C，刻蚀时间优选为8-12h ;所述的盐酸的浓度优选为2M。
[0039]按照本发明，将富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液混合，得到混合溶液，将上述得到的空心介孔硅加入混合溶液中，在室温下反应l_2h，将得到的溶液离心，所述的离心转速优选为5000-6000rpm，离心后经沉淀、洗涤，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
[0040]按照本发明，所述的富C茎环结构DNA序列为5’-CGT ATA TCC CTA ACC CTA ACCCTA ACC CTA TAT ACG，所述的富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液的体积比优选为1:1:4。所述的混合溶液的体积(μ L):空心介孔硅的质量(mg)优选为60:0.3。
[0041]本发明还提供上述制备方法得到的空心介孔硅-DNA复合材料。
[0042]本发明还提供空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的应用，所述的空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的方法为:将空心介孔硅-DNA复合材料与AgNO3溶液在0°C，黑暗环境下孵育2-3h，然后加入NaBH4,剧烈震荡2_4min，将得到的混合液在4°C静置24-48h，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇，然后将药物加入空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇中，得到空心介孔娃-DNA-Ag纳米簇-药物复合物。所述的空心介孔娃-DNA复合材料、AgNO3溶液、NaBH 4的质量比优选为1000:4.5:1。所述的药物与空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇的质量比优选为1:5000 ;所述的药物优选为可以结合在双链DNA上的潜在抗癌试剂，所述的潜在抗癌试剂优选为Hoechst33258 (Hoechst)。
[0043]下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明。
[0044]实施例1
[0045]在Fe3O4纳米粒子(直径200nm)通过碱性水解TEOS的方法包上一层薄的硅壳，得到Fe3O4OnS12,将Fe3O4OnS12纳米粒子分散在含有0