一种叶酸修饰的雄黄-介孔氧化硅纳米复合药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明专利涉及介孔材料制备与药物制剂技术领域，具体涉及一种叶酸修饰的雄 黄-介孔氧化硅纳米复合药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 矿物药雄黄（Realgar)，为中医学中应用历史悠久的中药，最早载于《神农本草 经》，主要成分为四硫化四砷（As 4S4),并夹杂少量砒霜（As2O3)及其它重金属盐，用于解毒 杀虫，燥湿，去痰，截疟等。自20世纪50年代以来，国内许多学者将含雄黄的复方制剂或 单味雄黄用于临床治疗血液系统的肿瘤及人体其他部位的肿瘤，取得了很好的疗效。且由 于其毒性低于砒霜注射剂，雄黄被推荐为治疗急性早幼粒细胞白血病（APL)的二线化疗 M(Wu J Z, Shao Y B, Liu J L, et al. The medicinal use of realgar (As4S4) and its recent development as ananticancer agent[J]. Journal ofEthnopharmacology,2011,135 (3)： 595-602)。目前研究证明雄黄抗肿瘤作用的机理为诱导细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制核酸 合成、作为血管内皮细胞抑制剂和直接细胞毒作用等（刘嵘，濮德敏.雄黄的研究进展[J]. 时珍国医国药，2007,18(4) :982-984)。但是雄黄为硫化物类矿物，难溶于水及大部分有机 溶剂，目前的临床应用中一直存在口服剂量大、潜在毒性大等问题。
[0003] 目前通常采用气流和球磨等微粉化技术将雄黄粒径减小到微、纳米级尺度水平， 提高其生物利用度，但现有这些方法仍然存在不少缺点，例如：粒径难以控制、稳定性差、水 溶性差、易发生氧化和团聚等。杨祥良等（Yang X L，Xu H B，Ye H Q，et al. Nanometer realgar solid dispersion and its preparation method :China，CN1478486[P]. 2004-03-03)以纳 米雄黄为活性成分，以高分子聚合物为载体，添加抗氧化剂和表面活性剂，通过熔融法和溶 剂挥发法制备了纳米雄黄固体分散体，解决了纳米雄黄的氧化与团聚问题。沈星灿等（Shen X C, Liang H, Chen Y, et al. Method for preparing nanometer realgar gel and nanometer realgar with biomacromolecule template to regulate shape and particle thereof ： China, CN100374463C[P]. 2008-03-12)采用化学法，以生物大分子为模板调控形貌与粒径 制得不同形貌与粒径的纳米雄黄。然而上述方法制备的纳米雄黄在杀死肿瘤细胞的同时对 正常细胞也有一定的毒副作用。
[0004] 叶酸受体在大部分人体肿瘤细胞上都存在过度表达（Morelli C，Maris P，Sisci D, et al. PEG-templated mesoporous silica nanoparticles exclusively target cancer cells [J]. Nanoscale，2011，3 (8) :3198-3207)，因此，在药物制剂设计中通常将叶酸作 为主动靶向识别配体。而介孔氧化硅纳米粒子表面具有丰富的可接支位点，易于叶酸修 饰，同时该载体具有高的负载量、形貌可控性以及低的系统毒性等优点（Tang F Q，Li L L, Chen D. Mesoporous silica nanoparticles ：synthesis, biocompatibility and drug delivery [J] ? Advanced Materials, 2012, 24 (12) :1504-1534)，并且使雄黄能在纳米水平 均一分散于介孔腔，因此选择其作为雄黄靶向输送载体具有良好的可行性。
【发明内容】
[0005] 本发明公开了一种叶酸修饰的介孔氧化硅纳米粒子，它具有大比表面积和孔体 积、孔径分布窄、粒径均匀以及单分散的球形形貌，适合作为药物载体，在药物传递领域具 有良好的应用前景。
[0006] 本发明的叶酸修饰的介孔氧化硅纳米粒子能够通过物理吸附负载雄黄，形成叶酸 修饰的雄黄-介孔氧化硅纳米复合药物，期望其静注后通过与肿瘤细胞表面的叶酸受体特 异性结合，选择性地在肿瘤部位累积并被细胞吞噬，降低雄黄对正常细胞的毒副作用，并实 现有效的治疗作用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：以正硅酸四乙酯为硅源，十六烷基 三甲基溴化铵为模板剂，乙醇为助溶剂，三乙醇胺为螯合剂在碱性条件下合成介孔氧化硅 纳米粒子，经溶剂萃取法除去模板剂后通过后嫁接法在其表面键合氨丙基，再通过偶联反 应修饰叶酸，即得到叶酸修饰的介孔氧化硅纳米粒子。然后将雄黄溶于无水乙二胺形成簇 溶液（As 4S4-NH2C2H4NH 2)，离心除去其他不溶性矿物成分，再用去离子水稀释，配制成一定浓 度的雄黄乙二胺溶液，通过高速振荡的方式负载于叶酸修饰的介孔氧化硅纳米粒子的孔道 中，即得叶酸修饰的雄黄-介孔氧化硅纳米复合药物。
[0008] 叶酸修饰的雄黄-介孔氧化硅纳米复合药物的合成过程如下：
[0009] 上述制备方法中正硅酸四乙酯：十六烷基三甲基溴化铵：三乙醇胺：水：乙醇 的摩尔比为1 : 0.2~0.3 : 0.8~LO : 130~150 : 7.0~13.0。在此范围内，通过 改变正硅酸四乙酯与三乙醇胺或者正硅酸四乙酯与乙醇的比例可以得到不同粒径大小的 介孔氧化娃纳米粒子。
[0010] 雄黄-介孔氧化硅纳米复合物的制备方法中：乙二胺：水的体积比为1 : 0. 33~ 1 : 3,雄黄浓度为2~20mg/mL，载体量为5~20mg，负载时间为0~4小时。
[0011] 更为优选的制备方法如下：
[0012] a.室温下，称取适量阳离子表面活性剂置于圆底烧瓶中，加入去离子水后于40~ 80°C加热搅拌，溶解后依次加入无水乙醇和三乙醇胺，搅拌均匀后逐滴加入正硅酸四乙酯， 保持40~80°C继续搅拌1~3小时；
[0013] b.将反应混合物离心，用去离子水洗至中性，再用无水乙醇洗涤后于60°C真空干 燥；
[0014] C.用含盐酸的乙醇溶液除去模板剂，60°C真空干燥，得到介孔氧化硅纳米粒子；
[0015] d.室温下，称取适量介孔氧化硅纳米粒子置于圆底烧瓶中，加入无水乙醇搅拌分 散，量取适量3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解于无水乙醇后加入上述圆底烧瓶，室温搅拌40~ 60小时；
[0016] e.将反应混合物离心，用无水乙醇洗涤后置60°C真空干燥，得到氨基化的介孔氧 化石圭纳米粒子；
[0017] f.室温下，称取适量叶酸于圆底烧瓶中，加入二甲亚砜超声溶解，依次加入N-羟 基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温避光搅拌1小时后加 入适量氨基化的介孔氧化硅纳米粒子，继续避光搅拌10~30小时；
[0018] g.将反应混合物离心，用磷酸盐缓冲液洗涤后真空干燥，得到叶酸修饰的介孔氧 化石圭纳米粒子。
[0019] h.将雄黄溶于无水乙二胺，溶解后离心除去不溶性矿物成分，再用去离子水稀释， 使得乙二胺：水的体积比为1 : 0. 33~1 : 3,配制成雄黄浓度为2~20mg/mL的雄黄乙 二胺溶液；
[0020] i.称取5~20mg介孔氧化硅纳米粒子置于塑料离心管中，加入上述雄黄乙二胺溶 液，室温下置于高速振荡器振荡0~4小时；
[0021] j.离心，用去离子水洗涤，合并上清液并转移至三角烧瓶中进行湿法消解，用原子 荧光光谱仪测定负载前后样品中砷浓度的变化，根据标准曲线计算雄黄负载量。
[0022] k.用叶酸修饰的介孔氧化硅纳米粒子替换i中的介孔氧化硅纳米粒子，用优化得 到的条件考察其对雄黄的负载量。
[0023] 本发明的创造性在于：
[0024] 1.本发明中的介孔氧化硅材料的制备使用三乙醇胺来络合硅物种，该制备方法与 稀溶液法以及微乳法相比合成过程简单，产率高，后处理方便。
[0025] 2.本发明制备的介孔氧化硅纳米粒子具有蠕虫状孔道的球形形貌，粒径均一，约 为80~IOOnm,见图1，比表面积和孔体积分别为973m 2/g和I. 01cm3/g，具有有序的介孔结 构，窄的孔径分布，见图2至图4,该材料表面具有较多的活性位点，易于被修饰，同时具有 高的负载量、形貌可控性以及低的系统毒性等优点，适合作为药物载体。
[0026] 3.介孔氧化硅纳米粒子作为药物载体是近十年来的研究热点，但通常都是负载传 递分子类药物，负载矿物药雄黄的研究还未见文献报道。本发明通过考察乙二胺与水的体 积比，雄黄乙二胺溶液的浓度，载体量以及振荡时间发现，介孔氧化硅纳米粒子对雄黄有一 定的负载能力，见图6至图9,且其形貌和结构未发生明显的改变，见图10,负载量约为8%， 图11是雄黄-介孔氧化硅纳米复合物的能谱分析图，进一步说明雄黄在纳米水平负载于介 孔氧化硅纳米粒子中，在其表面修饰叶酸后形成叶酸修饰的雄黄-介孔氧化硅纳米复合药 物，但其靶向特性还需进一步经过体外细胞实验验证。
【附图说明】
[0027] 图1为实施例1合成的介孔氧化硅纳米粒子的透射电镜（TEM)照片；
[0028] 图2为实施例1合成的介孔氧化硅纳米粒子的小角X射线衍射（XRD)图谱；
[0029] 图3为实施例1合成的介孔氧化硅纳米粒子的氮气吸附-脱附等温线曲线；
[0030] 图4为实施例1合成的介孔氧化硅纳米粒子的孔径分布曲线；
[0031] 图5为实施例3合成的叶酸修饰的介孔氧化硅纳米粒子的红外光谱图；
[0032] 图6为实施例4中乙二胺与水体积比与载药率的关系曲线；
[0033] 图7为实施例5中雄黄浓度与载药率的关系曲线；
[0034] 图8为实施例6中载体的量与载药率的关系曲线；
[0035] 图9为实施例7中振荡时间与载药率的关系曲线；
[0036] 图10为实施例8中雄黄-介孔氧化硅纳米复合药物的透射电镜（TEM)照片；
[0037] 图11为实施例8中雄黄-介孔氧化硅纳米复合药物的能谱分析（EDX)图谱
【具体实施方式