miR590的用途及其相关药物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及miR590的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002]肾脏是哺乳动物体内最重要的器官之一，在动物体内发挥着重要作用，其主要功能体现为排泄体内废弃物、维持体内电解质平衡以及分泌EPO等功能。因此肾脏功能一旦受到损伤，超过自身的代偿，机体就会出现一系列生理病理功能紊乱，直至最终导致肾脏功能的衰竭。在绝大多数肾脏疾病中，肾脏的纤维化几乎是存在于所有肾脏疾病过程中。其特征性的表现主要是过多的细胞外基质沉积在细胞与细胞之间，从而影响着肾小球和肾小管的纤维化或硬化。对于纤维化这一病理过程，目前国内外大多数学者都倾向于认同的一种观点是上皮细胞向间质细胞转化(即EMT)在肾脏纤维化的过程中发挥着重要作用，而阻止EMT的过程对肾脏纤维化的防治可能具有重要临床价值。然而有哪些分子在EMT过程中起重要作用还不完全清楚。随着小分子microrna的发现及其机理的阐明，研究者发现一大批microrna分子参与了 EMT过程。
[0003]miRNAs是一类分子大小大约为22_25nt大小的小的非编码RNA序列，其主要作用是通过结合靶基因3’UTR从而影响靶基因mRNA的降解或翻译。自1993年首次发现这类小分子RNA以来，对于miRNA的研究呈现暴发式增长。在肾脏研究领域关于miRNA的研究主要是基于条件性敲除Drosa或Dicer的小鼠模型。通过该技术人们发现miRNAs在生物体的各种生理病理过程中都发挥着作用，像胚胎的发育、分化，细胞的增值凋亡、代谢，肿瘤的迀移等。而miRNA在肾脏纤维化相关的病理过程的研究还处在起步阶段，许多相关的分子事件还没有完全阐明。
[0004]TGF β R2是TGF β信号通路中一个比较关键的分子。其作为细胞膜受体与TGF β Rl形成异二聚体接受外界的信号刺激从而激活TGF β /SMAD信号通路。TGF β /SMAD信号通路参与生物体内的各种生理病理过程，其中就包括ΕΜΤ。之前有研究表明TGFi3 R2可以作为一个EMT的促进因子在各种生理病理过程中发挥着作用，其上游的调控子是miR655。
[0005]而miR590在肾纤维化中的功能尚没有文献报道。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了 miR590基因在肾脏组织的纤维化过程中的作用。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]本发明的第一方面，提供了一种分离的miR590基因在制备或筛选肾脏纤维化治疗药物或制剂中的用途。
[0009]所述将分离的miR590基因用于制备或筛选肾脏纤维化治疗药物或制剂包括两方面的内容:其一，将miR590基因作为药物或制剂的作用靶标应用于制备肾脏纤维化治疗药物或制剂；其二，将miR590基因作为药物或制剂的作用靶标应用于筛选肾脏纤维化治疗药物或制剂。
[0010]所述将miR590基因作为药物或制剂的作用靶标应用于制备肾脏纤维化治疗药物或制剂具体是指:将miR590基因作为药物或制剂作用的靶标，来研制针对肾脏纤维化细胞的药物或制剂，从而提高肾脏纤维化细胞内miR590基因的表达水平。
[0011]所述将miR590基因作为药物或制剂的作用靶标应用于筛选肾脏纤维化治疗药物或制剂具体是指具体是指:将miR590基因作为药物或制剂作用的靶标，对药物或制剂进行筛选，以找到可以促进miR590基因表达的药物作为肾脏纤维化治疗备选药物。诸如基因、抗体药物，小分子药物等可将miR590基因及其蛋白作为作用对象。例如，本发明通过在肾纤维化细胞中转染pcDNA3.l-miR590来过表达miR590。
[0012]进一步地，所述药物或制剂通过促进miR590表达水平来起到治疗肾脏纤维化的作用。
[0013]进一步地，所述药物或制剂通过过表达miR590来起到治疗肾脏纤维化的作用。
[0014]进一步地，所述miR590通过抑制肾脏纤维化过程中的EMT过程来起到治疗肾脏纤维化的作用。
[0015]所述EMT过程是指上皮细胞向间质细胞转化的过程。
[0016]进一步地，所述miR590通过靶向作用于TGF β R2而起到抑制EMT过程的作用。
[0017]优选地，所述miR590通过与TGFP R2 3’ UTR结合而靶向作用于TGFP R2。
[0018]优选地，所述miR590通过抑制TGF β R2表达水平而起到抑制EMT通路的作用。
[0019]本发明的第二方面，提供了一种肾脏纤维化治疗药物或制剂，所述药物或制剂通过分离的miR590基因制备或筛选获得，所述药物或制剂含有有效量的过表达miR590的药效成分。
[0020]所述肾脏纤维化治疗药物或制剂包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0021]所述核酸包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
[0022]所述药物或制剂的施用量为足够提高miR590基因的转录或翻译，或者足够提高miR590蛋白的表达或活性的剂量。以使miR590基因的表达维持在能够抑制EMT过程的水平。
[0023]本发明的第三方面提供了一种分离的miR590基因在制备肾脏纤维化诊断药物或制剂中的用途。
[0024]所述将miR590基因用于制备肾脏纤维化诊断药物或制剂，是指将miR590基因表达产物作为一项肾脏纤维化诊断指标应用于肾脏纤维化诊断药物或制剂的制备。
[0025]研究发现:miR590基因在肾脏纤维化细胞中的表达量显著低于正常肾脏细胞。提示miR590基因可能在肾脏纤维化的发生发展中发挥重要作用；miR590基因的表达水平可能成为肾脏纤维化伤诊断的标志。
[0026]本发明的第四方面，提供了一种肾脏纤维化诊断试剂盒，所述试剂盒包括:特异性扩增miR590转录本的引物或特异性抗miR590的抗体。
[0027]本发明的有益效果在于:
[0028]本发明首次揭示了肾脏在纤维化过程的确存在明显的EMT现象并伴随着miR590的下调，另一方面我们通过生物信息学软件发现TGF0R2可能是miR590的潜在靶基因。在体外的双荧光素酶基因报告实验本发明证实了 miR590与TGF β R2存在相互作用的可能，且采用实时荧光定量PCR和western blot实验证实了在人近端小管上皮细胞(即HK2)向间质细胞转化过程中过表达miR590会导致TGF β R2表达的下调，并且抑制其EMT过程。而后通过siRNA干扰实验发现，TGF β R2的下调对ΗΚ2细胞的EMT的影响与过表达miR590相同。在细胞中过表达TGF β R2时，ΗΚ2细胞EMT现象可以部分被被逆转，这一系列数据说明miR590影响HK2细胞的上皮间质化进程可能通过TGF β R2起作用，进而参与纤维化进程。
【附图说明】
[0029]图1:miR590保守性分析示意图。
[0030]图2:TGF0R2 3，UTR保守性分析示意图。
[0031]图3:在HK2细胞中用TGFBl诱导的EMT。
[0032]图4:在mRNA水平体内外EMT模型的验证。
[0033]图5:在蛋白水平体外EMT模型的验证。
[0034]图6:miR590在体内外的EMT模型中表达水平下降。
[0035]图7:肾脏纤维化模型的组织学验证。
[0036]图8:在蛋白水平体外EMT模型的验证。
[0037]图9:miR590过表达效率验证。
[0038]图10:miR590 对 HK2 细胞 EMT 影响(mRNA)。
[0039]图 11:miR590 对 HK2 细胞 EMT 影响(protein)。
[0040]图 12:miR590 对 HK2 细胞 EMT 影响(protein)。
[0041]图13:miR590对TGF β R2 3，UTR作用位点分析示意图。
[0042]图14:miR590 对 TGF β R2 3，UTR 作用实验。
[0043]图15:蛋白水平miR590对TGFP R2影响。
[0044]图16:siRNA干扰技术沉默TGF β R2效率。
[0045]图17:siRNA 沉默 TGFBR2 对 ΗΚ2 细胞 EMT 影响(mRNA)。
[0046]图18:siRNA沉默TGF β R2对ΗΚ2细胞EMT影响(蛋白水平)。
[0047]图19:过表达TGF β R2对ΗΚ2细胞EMT影响。
【具体实施方式】
[0048]本发明经过广泛而深入的研究，首次发现miR590在EMT体外模型和体内模型中都呈下降趋势。接着，本发明的发明人发现且过表达miR590可以有效抑制上皮细胞marker基因的表达及促进间质细胞marker基因上调。其所涉及的下游关键分子是TGFP R2，因为miR590可以影响TGF β R2的表达从而影响ΕΜΤ。
[0049]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的【具体实施方式】加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0050]在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0051]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0052]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技