一种在植物中快速表达外源蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体的说是一种在植物中快速表达外源蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]近几十年中，大量研究表明植物生物反应器能够有效表达许多外源蛋白，包括人的血清蛋白，生长因子，抗体，疫苗等。目前，国外利用植物生产的药用蛋白已经用于临床实践阶段，植物生物反应器越来越显出其重要地位。植物生物反应器主要有两种表达体系，即稳定表达体系和瞬时表达体系。植物瞬时表达体系因具有快速，安全，有效等优点而越来越受到人们的青睐，也逐渐成为国内的研究热点之一，其实用价值和开发前景已获得普遍的冃疋?
[0003]植物瞬时表达体系是以植物病毒载体为介导的，通过叶片注射法将携带病毒载体和外源基因的农杆菌重悬液注射到植物叶片，并实现植物中外源蛋白的表达。常用的侵染方法如叶片注射法和真空侵染法，叶片注射法需要逐片叶进行注射，其缺点是人工操作较为繁琐，费时费力，不适合大量植物的侵染，从而影响了其在外源蛋白生产上的进一步推广及应用。
[0004]利用植物作为生物反应器来表达外源蛋白是一种常用的方法。其中，植物瞬时表达体系具有潜在的应用价值和广泛的开发前景。其主要的侵染方法为叶片注射法和真空侵染法，但是，这两种方法都不适用于大量植物的侵染和外源蛋白的规模化生产。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是要提供一种在植物中快速表达外源蛋白的方法，该方法是以植物病毒载体为介导，利用高压喷枪系统(型号HP-G6)将携带有病毒载体的农杆菌重悬液侵染植物烟草叶片，通过携带外源基因的病毒载体在植物体内的大量复制来表达外源蛋白，该方法简单的操作过程，较强的实用性，适合外源蛋白的快速表达和规模化生产。
[0006]本发明的目的是这样实现的，该方法包括以下步骤:
[0007]①、植物材料的准备:
[0008]植物材料为烟草，将烟草(Nb)的种子播种于1/2MS培养(现有技术)基中，放于光照培养箱，培养7-8天就可以长出烟草小苗，将烟草小苗移栽于花盆中，在25±3°C的温度条件下，每天光照16h和黑暗8h的循环条件下培养18-20天，此时的烟草小苗的苗龄在四叶期一六叶期，作为植物材料备用；上述步骤中对植物材料侵染时期进行了优化，即分别选择苗龄为四叶期，五叶期和六叶期的烟草小苗，每个时期选择20株烟草小苗作为植物材料。
[0009]②、病毒载体的构建:
[0010]先将要表达的外源基因GFP连接在病毒载体p35S-30B上，再将质粒p35S-30B-GFP转化农杆菌EHA105，28°C条件下过夜培养，即可获得携带病毒载体和外源基因GFP的农杆菌 EHA105-p35S-30B-GFP 的单菌落。
[0011]③、农杆菌重悬液的制备:
[0012]挑取上述步骤②中培养的单菌落EHA105-p35S-30B-GFP放入5ml LB培养基中，5ml LB培养基中添加浓度为50mg/ml的卡那霉素5ul、50mg/ml的利福平5ul,然后放入培养箱进行过夜培养16h，培养箱的转速设置为200r/min，培养温度为28°C，培养后即可获得农杆菌菌液，然后将Iml的农杆菌菌液放入50ml LB培养基中，50ml LB培养基中加浓度为50mg/ml的卡那霉素50ul、50mg/ml的利福平50ul,再添加浓度为lmol/L的苯磺酸Mes (PH5.6)500ul、浓度为lmol/L的乙酰丁香酮ASlOul，再将上述农杆菌菌液放入培养箱中过夜培养，培养箱的转速设置为200r/min，培养温度为28°C，过夜培养16_18h，将过夜培养的菌液在3000r/min，4°C条件下离心20min来收集菌体，然后将菌体重悬于MMA (1mmol/L Mgcl2, 1mmoI/L Mes, 10umoI/L AS)，获得菌液重悬液；上述步骤中对农杆菌重悬液进行了优化，分别配制浓度(OD6J为0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6的菌液重悬液，将菌液重悬液在侵染前放在暗室静置2-3h后备用。
[0013]④、利用高压喷枪系统侵染植物:
[0014]将步骤③中准备好的菌液重悬液和金刚砂按照3:1的比例混合，然后放入与高压喷枪(东莞市安信五金科技有限公司生产，型号R-21S)相连的溶液管中，压力保持在0.1Mpa，高压喷枪的喷头距离叶面15-20cm，将菌液重悬液垂直喷射在步骤①中制备的烟草苗的叶片上，注意喷洒时喷枪不要距离植物材料太近，以免对植物叶片造成较大的伤害，所述金刚砂借助高压喷枪的压力在叶片上形成微小的伤口，使菌液重悬液携带的病毒载体和外源基因容易侵染植物的叶片，以保证较高的病毒侵染效率和外源基因的表达效率。
[0015]⑤、侵染后植物材料的培养与观测:
[0016]将上述步骤④中高压喷枪侵染的植物材料放入光照培养箱(28°C;16h日光灯光照/8h黑暗)进行培养，黑室中，在紫外灯(UV)照射条件下进行观察，GFP表达的叶片表型为呈现绿色，未表达GFP的叶片呈现红色；上述步骤中对侵染后植物材料的培养温度进行了优化，在光照培养箱分别选择不同的培养温度22°C，25°C ,28°C, 31°C和34°C进行植物材料的侵染后培养，观察GFP的表达并计算GFP的表达效率表达GFP的烟草植株占总侵染株数的百分比。
[0017]⑥、GFP的快速表达及检测
[0018]用Trizol试剂(购于TAKARA公司)提取表达GFP的植株的总RNA，在RNA水平上进行GFP表达的RT-PCR检测(现有技术)；利用PBS提取液提取植物总可溶性蛋白，进行GFP表达的Western Blotting检测(现有技术)。
[0019]本发明具有以下优点和积极效果:
[0020]1、本发明为植物中简便、快速表达外源蛋白的一种新方法，利用该方法成功表达了绿色荧光蛋白GFP。在大量优化实验中，申请人对影响基因表达的各种因素进行了较为全面具体的研究，确定该方法最适侵染条件，包括菌液重悬液(MMA OD600)浓度，适合该方法的植物材料及侵染时期，植物材料培养的温度条件等。
[0021]2、本发明以来源于TMV病毒的载体p35S-30B为媒介，将外源基因连接于病毒载体，通过病毒在植物中的传播而获得大量目的蛋白，本发明目的植物为烟草，目的蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)，本发明首次利用高压喷枪系统将携带有病毒载体和目的基因的农杆菌菌液侵染植物并在植物中快速表达外源基因，通过病毒在植物体内的快速扩增而在短期内获得大量外源蛋白。
[0022]3、本发明方法的主要优点为操作过程简单，快捷，易于推广应用，只要将农杆菌重悬液和金刚砂按照3:1的比例混合好后，通过高压喷枪系统喷射在植物叶片上，即可达到将农杆菌重悬液侵染植物的目的。
[0023]4、本发明方法成本低，具有实用价值；操作过程简单快捷，省时省力，方便有效，能够实现大量植物的侵染工作，能够应用于外源蛋白(如血清蛋白、生长因子、抗体、疫苗等药用蛋白)的快速、大量表达和规模化生产。
【附图说明】
[0024]图1是本发明p35S-30B-GFP表达载体载体图。
[0025]图2是本发明农杆菌重悬液的浓度对蛋白GFP表达效率的影响柱形图。
[0026]图3是本发明烟草小苗的苗龄对蛋白GFP表达效率的影响柱形图。
[0027]图4是本发明侵染后烟草的培养温度对蛋白GFP表达效率的影响柱形图。
[0028]图5是本发明紫外下绿色荧光蛋白GFP的表型观察照片图。
[0029]图6是本发明绿色荧光蛋白GFP表达的RT-PCR和Western Blot检测照片图。
【具体实施方式】
[0030]实例一:
[0031]分别采用不同的菌液浓度，MMA OD600分别为0.6,0.8，1.0, 1.2，1.4时进行侵染。