人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体。由保藏号为CGMCC No.7459的小鼠杂交瘤细胞产生。本发明还提供所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法及应用。所述单克隆抗体可用于检测转基因牛奶与奶粉中的人α-乳清白蛋白。本发明的人α-乳清白蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，直接对外源表达蛋白进行检测，避免了基因提取费时费力且容易污染的问题；本发明检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。CGMCC No745920130426
【专利说明】人Ct-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及单克隆抗体的制备与应用，尤其涉及一种人α-乳清白蛋白单克隆抗 体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] α -乳清白蛋白（a -LA)是分子量小、酸性的、高亲和性的Ca2+结合蛋白。它几乎 存在于所有的哺乳动物乳汁中。人α-乳清白蛋白的分子量为14. 1KD。α-乳清白蛋白是 人乳中的重要组成成分，约占总蛋白含量的25-35%，而在牛奶中只占总蛋白含量的2-5%。 α -乳清白蛋白可与Ca2+、Zn2+等多种二价阳离子结合，能促进微量元素的吸收。在乳腺分 泌细胞中，α-乳清白蛋白作为调节亚基通过与半乳糖苷转移酶相互作用催化乳糖的合成。 最近还发现人α-乳清白蛋白的不同折叠突变体具有杀菌和诱导肿瘤细胞死亡的功能，还 能与油酸形成复合物杀死皮肤的乳突淋瘤，具有广阔的应用前景。
[0003] 由于α-乳清白蛋白具有如此重要的功能，人α-乳清白蛋白可以被开发成婴幼 儿食品，保健品，运动饮料以及抗菌、抗肿瘤药物等。据FAO预测，全球每年婴幼儿食品市场 为58亿美元，人α-乳清白蛋白已成为这些产品的重要成分，加上其它产品开发，人α-乳 清白蛋白的市场前景非常巨大。但是目前市场上供应的α-乳清白蛋白主要是从牛奶中纯 化的牛α-乳清白蛋白，不过由于牛α-乳清白蛋白在牛乳中含量低（1.2g/L)，纯化工艺复 杂，而且成本偏高，生产的α-乳清白蛋白无法满足市场需求。更重要的是，牛α-乳清白 蛋白并不具备人α-乳清白蛋白的一些营养价值和重要功能，因此人α-乳清白蛋白具有 广阔的开发应用前景。但是由于来源有限，限制了人α-乳清白蛋白作为药用蛋白和保健 品的使用，因此人们开始利用转基因动物即动物乳腺生物反应高效表达重组人α-乳清白 蛋白。
[0004] 同时，与转基因相伴而生的生物安全问题引起了公众和管理部门的强烈关注和重 视。建立精准、快速的检测技术并科学、系统地进行生物安全评价，可防止转基因动物或产 品在研究、生产、销售时发生扩散、污染等安全隐患进行检测和监测技术储备和支撑。这不 仅是维护消费者知情权和在国际贸易中维护国家利益的必要手段，也是我国履行国际义 务、维护国家形象的重要保障。
[0005] 乳铁蛋白的检测方法有很多，其中ELISA检测法以其快速、准确、灵敏且一次能处 理多个样而倍受关注。目前国内外用于ELISA检测的抗体为多克隆抗体，而以单克隆抗体 为基础建立起的免疫学检测试剂盒很少。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人α-乳清白蛋白单 克隆抗体。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供一株能分泌产生所述人α -乳清白蛋白 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0008] 杂交瘤细胞ZZY hLY7El，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编 码：100101 )，保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCC No. 7459。
[0009] 本发明还提供了人α-乳清白蛋白单克隆抗体，其由所述杂交瘤细胞株分泌获 得。
[0010] 本发明还提供了人α-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法，用重组蛋白a-LF免 疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、 通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗a-LA的5株细胞1C7、5E8、5G9、6E6、7E1。取 杂交瘤细胞(效价较高同时细胞状态好)注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得人α -乳 清白蛋白单克隆抗体。
[0011] 经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞7Ε1效价最高。7Ε1细胞亚型为 IgGl。7Ε1细胞能与免疫原α-LA反应，不与筛选原牛乳铁蛋白（bLA)反应。用细胞7Ε1制 备腹水，检测腹水效价为1:81000,腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000,抗体纯度高 于 95%。
[0012] 本发明还提供前述人a-乳清白蛋白单克隆抗体在检测转基因牛奶与奶粉中人 a-乳清白蛋白中的应用。
[0013] 所述人a -乳清白蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L 的人a-乳清白蛋白。Western Blot检测显示抗体7E1只与转基因牛奶及奶粉反应，不与 非转基因牛奶及奶粉反应。
[0014] 本发明还提供前述人a-乳清白蛋白单克隆抗体在制备用于检测转基因牛奶与 奶粉中人a-乳清白蛋白试剂盒中的应用。
[0015] 所述人a-乳清白蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或多 种：
[0016] 1)洗涤液；
[0017] 2)底物显色液；
[0018] 3)反应终止液；
[0019] 4)人a -乳清白蛋白标准品。
[0020] 所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H2S04。
[0021] 本发明的有益效果：本发明的人a-乳清白蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏 度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，可直接对外源表达蛋白进行检测， 同时避免了核酸检测方法中，基因提取费时费力且容易污染的问题。检测成本低廉，结果迅 速，灵敏可靠，而且可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为免疫抗原（6his-MBP-CCG343)及检测抗原（PGEX-6P-1-CCG343)的表达纯 化；
[0023] 其中，la :6his-MBP-CCG343 样品；lb :6his-MBP-CCG343 穿柱液；Ic : 6his-MBP-CCG343 洗脱 I ;ld :6his-MBP-CCG343 洗脱 2 ;2a :PGEX-6P-1-CCG343 样品；2b : PGEX-6P-1-CCG343 穿柱；2c :PGEX-6P-1-CCG343 洗脱 I ;2d :PGEX-6P-1-CCG343 洗脱 2 ;
[0024] 图2为实施例2Western_blot检测结果图；
[0025] 其中，1 为 PGEX-6P-1-CCG343 ;2 为 6his-MBP-CCG343 ;
[0026] 图3为杂交瘤细胞上清与样品Wester-blot试验结果；
[0027] 其中，3 :转人乳铁蛋白基因奶牛牛奶样品；5:牛乳清白蛋白；4:转人α-乳清白 蛋白基因奶粉样品；
[0028] 图4为转基因牛奶及奶粉样品Western Blot检测；
[0029] 其中，1:转人α-乳清白蛋白基因牛奶样品；2:转人α-乳清白蛋白基因奶粉样 品；3 :三元极致牛奶样品；4 :人α -乳清白蛋白；5 :牛α -乳清白蛋白；6 :三元极致牛奶样 品；
[0030] 图5为转基因牛奶样品的检测标准曲线。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032] 转人α-乳清白蛋白基因奶牛样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实 验室；单克隆抗体和多克隆抗体由中国检验检疫科学研究院动检实验室构建；日本大耳白 兔购自军事医学科学研究院实验动物中心；人α-乳清白蛋白购自Sigma公司。
[0033] 酶标板购自宏捷成生物公司；HRP标记试剂盒（CatNo31488)购自Pierce公司；山 羊抗小鼠 IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥生物公司；TMB (可溶型）购自天根生 物公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、96孔酶标板购自北京宏捷成生物科技有限公司； IgG纯化试剂盒购自嘉兴行建生物科技有限公司，石蜡油购自BBI公司。
[0034] 层析柱购自Phamacia公司；润旋仪购自江苏海门市其林贝尔公司；高速微量离心 机购自美国Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM纯水系统购自美国Millipore公司；舒适 性恒温仪购自eppendorf公司；台式冷冻离心机、真空浓缩仪购自eppendorf公司；电热恒 温水浴锅购自PolyScience公司；NanoDroplOOO紫外/可见分光光度计购自NanoDrop公 司；恒温鼓风干燥箱、摇床购自中国智成公司；紫外凝胶成像系统购自UVP公司；PYY-6C型 稳压稳流电泳仪、DYCP-31C微型水平电泳槽购自北京六一厂；高压灭菌锅、-80°C冰箱购自 日本三洋公司；混合型球磨仪购自Retsch公司；酶标仪，BI0-RAD。
[0035] 转基因牛奶、奶粉样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，非转基 因牛奶及脱脂奶粉购自超市。
[0036] 实施例1原核表达人α -乳清白蛋白
[0037] 1、委托宝生物工程(大连）有限公司合成429bp的人α-乳清白蛋白基因连接到 ρΜΒΡ 和 pGEX-6P-l 载体，分别命名为 6his-MBP-CCG343 和 pGEX-6P-l-CCG343,表达并纯化 两种蛋白，其中6his-MBP-CCG343为制备单克隆抗体的免疫抗原，PGEX-6P-1-CCG343为制 备单克隆抗体的检测抗原，蛋白纯化见图1。其中洗脱1+洗脱2作为免疫抗原，共IOmL (0· 8mg/ml)，洗脱1+洗脱3作为检测抗原共4mL (0· 7mg/ml)。
[0038] 实施例2制备人乳清白蛋白多克隆抗体，并对原核表达的两种蛋白进行验证
[0039] 1、兔免疫血清的制备
[0040] 选择同一批次健康的雌性日本大耳白兔4只，随机分为2组，实验组和对照组，实 验组3只免疫hLA (sigma)，对照组1只用PBS缓冲液代替hLA免疫，每只兔子皮下注射总 量为2mL用佐剂乳化好的抗原，每只兔子5mg，在第3次加强免疫，每只兔子5mg，后7天，耳 静脉采血,检测血清中抗体滴度（间接ELISA法)，如滴度未达到1:104, ODLO以上，则再加 强免疫。在抗体滴度已达到I: IO4后的第10天，心脏采集兔血，分离血清，-20°C保存备用。
[0041] 2、多克隆抗体的提取
[0042] 采用IgG的纯化提取试剂盒，按说明书提取血清中的IgG，具体操作如下：
[0043] (I) IOmL平衡缓冲液平衡柱子，流速为lmL/min ;
[0044] (2) ImL注射器将抗体推入纯化柱中上样；
[0045] (3) IOmL的结合缓冲液冲洗柱子，流出的液体收集在EP管中；
[0046] (4) 4mL洗脱液进行洗脱，每mL洗脱蛋白加0. ImL中和缓冲液。
[0047] (5)收集的液体用考马斯亮蓝测定浓度，-20°C储存备用。
[0048] 纯化结果通过考马斯亮蓝验证，洗脱管2和洗脱管3能满足要求，浓度约为2mg/ Π?Τ, η
[0049] 3、多克隆抗体与原核表达载体Western-blot试验
[0050] 选择1号管和2号管的兔血清分别与PGEX-6P-1-CCG343和6his-MBP-CCG343进 行Western-blot试验，结果在相应位置均有目的条带，见图2。
[0051] 由于多克隆抗体的免疫抗原与原核表达的抗原来源不同，前者来源于人奶(产品 编号L7269 I CAS号9051-29-0 I Sigma)此结果证实表达的抗原具有结合相应抗体的能力，可 用于制备单克隆抗体，前期工作中也尝试使用编号为L7269的抗原制备单克隆抗体，但结 果未筛选到特异性的单克隆抗体，所以后期使用原核表达的抗原制备单克隆抗体。
[0052] 实施例3单克隆抗体抗体的制备
[0053] 1、小鼠抗体的制备
[0054] 选择6周龄同一批次健康的雌性Balb/c小鼠10只作为实验动物，随机分为2组， 实验组5只（1#、2#、3#、4#、5#小鼠)，对照组2只。实验组用6his-MBP-CCG343作为免疫 原进行免疫，用PBS缓冲液代替hLA进行免疫作为阴性对照。每只小鼠皮下注射总量为 100 μ L用佐剂乳化好的抗原（250 μ LPBS溶解Img抗原后与250 μ L弗氏不完全佐剂混合， 共500 μ L，每只小鼠注射100 μ L)。第一次基础免疫剂量为每只小鼠200 μ g，加强免疫免 疫剂量为每只小鼠200μ g，基础免疫时使用弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用弗氏不完全 佐剂乳化。基础免疫后间隔10天进行加强免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加强免疫后7 天,尾静脉采血,检测血清中抗体滴度（间接ELISA法)，如滴度未达到1:10 4, ODL 0以上，则 再加强免疫。在抗体滴度达到I: IO4后的第10天眼眶采血，分离血清，_20°C保存备用。
[0055] 2、间接ELISA法检测免疫小鼠的抗体水平
[0056] 以PGEX-6P-1-CCG343作为包被抗原，包被浓度：10 μ g/mL，利用间接ELISA法检测 血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为：1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、 1:240000、1:720000 ;对照组血清 1:3000 稀释。
[0057] hLA间接ELISA法测定的基本操作步骤如下：
[0058] (1)包被：将PGEX-6P-1-CCG343用包被液(磷酸缓冲液ρΗ9· 6)稀释至10 μ g/mL， 用微量加样器吸取稀释后的抗原加入96孔酶标板，100 μ L/孔，置4°C冰箱过夜。
[0059] (2)洗涤：取出ELISA板，弃去孔内液体，在纸巾上轻轻叩打以除去残留液体，加入 PBST洗涤液，300 μ L/孔，静置Imin，重复操作3?5次。
[0060] (3)封闭：用微量加样器按200 μ L/孔加1%BSA，放入37°C温箱2h。
[0061] (4)洗涤：同步骤2)。
[0062] (5)加待检样本：用PBS缓冲液将血清稀释，血清稀释倍数依次为：1:400、1:800、 1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600 ;放入 37?温箱 Ih ;
[0063] (6)洗涤：同步骤2)。
[0064] (7)加酶标抗体：用PBST洗涤液将HRP标记的山羊抗小鼠二抗稀释到工作浓度 1:5000,每孔加 100 μ L，37°C温箱孵育 45min。
[0065] (8)洗涤：同步骤2)。
[0066] (9)加底物溶液：避光按100 μ L/孔加入TMB底物溶液，室温孵育15min。
[0067] (10)终止反应：室温下加终止液50 μ L/孔,终止反应。
[0068] (11)测0D450值：检测450nm波长下的OD值，检测结果见表1。
[0069] 表1.经三次免疫后小鼠血清效价的测定结果
[0070]
【权利要求】
1. 杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)， 保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCC NO. 7459。
2. 人a _乳清白蛋白单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌 获得。
3. 权利要求2所述人a-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，用重组蛋 白a -LF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳 性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗a -LA的杂交瘤细胞，注射至小 鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化即得。
4. 权利要求2所述的人a -乳清白蛋白单克隆抗体在制备用于检测转基因牛奶与奶粉 中人a-乳清白蛋白试剂盒中的应用。
5. 权利要求2所述的人a-乳清白蛋白单克隆抗体在检测转基因牛奶与奶粉中人 a _乳清白蛋白中的应用。
【文档编号】C07K16/18GK104419685SQ201310395917
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】林祥梅, 朱振营, 王勤, 刘建, 付伟, 李晓琳, 孙敏, 薛振华 申请人:中国检验检疫科学研究院