肿瘤相关基因cdkn2a表位多肽单克隆抗体制备及其应用
【专利摘要】一种肿瘤相关基因CDKN2A表位多肽单克隆抗体制备及其应用，属于免疫学技术领域，本发明提供了CDKN2A基因的一种单克隆抗体，其是以CDKN2A基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得。本发明提供的单克隆抗体与设计合成表位多肽，可用于检测人血或组织CDKN2A抗体的定量表达，具有高特异性、高敏感性的优点，在临床检测和实验研究中将会得到广泛应用。
【专利说明】
肿瘤相关基因 CDKN2A表位多肽单克隆抗体制备及其应用
技术领域：
[0001] 本发明属于免疫学技术领域，涉及杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体与应用， 特别是涉及针对CDKN2A基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，与载体蛋 白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞系 以及该抗体的应用。 技术背景：
[0002] ⑶KN2A基因是一种重要的抑癌基因，位于人类第9号染色体短臂2区1带(9p21)，全 长815kb，由2个内含子和3个外显子组成。CDKN2A蛋白为cyclinD-⑶K4复合物的抑制蛋白， 故又称P16 ink4\P16ink4aS因作为一种新型的抑癌基因直接作用于细胞周期，通过cyclinD-CDK4-pRb-E2F通路调控细胞周期，控制细胞的生长与分化，参与肿瘤的形成与发展。
[0003] 细胞周期调控体系主要包括细胞分裂周期（cell division cycle，CDC)基因、细 胞周期蛋白（eye 1 ins )、细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)和细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白 (cyclin-dependent kinase inhibiters，CKIs) ecyclins和CDKs在细胞周期调节中起促进 作用，而CKIs起抑制作用。在细胞周期调节中有两个起关键作用的检查点:G1/S和G2/M，前 者控制DNA的复制，后者控制细胞的有丝分裂。CDK4与cyclin的复合体参与G1期到S期转换 的调控，⑶KN2A蛋白抑制CDK4活性，最终阻止细胞进入S期;一旦CDKN2A基因缺失、突变等导 致功能缺失，则不能抑制⑶K4,最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生。⑶K4-cycl in可 作用于多种癌基因产物如PP60c-SYc，C-abl产物，对其进行磷酸化修饰调节;也可作用于某 些抗癌基因产物，如Rb蛋白磷酸化后丧失生长抑制功能，在G1/S交界处，CDK4-Glcyclin使 Pb磷酸化而失活，细胞从静止状态进入增殖状态。总之，CDKN2A基因是一种非常重要的抗癌 基因，一旦失活则会引起细胞恶性增殖。
【发明内容】
：
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供肿瘤相关基因 CDKN2A表位多肽单克隆抗体制 备，能与CDKN2A专一结合的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞系。
[0005] 本发明提供的单克隆抗体，其是以CDKN2A基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设 计合成表位多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得。
[0006] 具体地说是使用可以诱发机体产生免疫反应并生成具有中和效应抗体的表位多 肽，偶联至KLH作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳 定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。
[0007] 优选地，上述多肽序列选自：
[0008] CDKN2A:ATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESV
[0009]由这个多肽序列与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够特异性 地识别该序列，将这个单克隆抗体分别称之为clone PUclone P1具有良好的特异性，间接 ELISA表明这个抗体具有较高的效价，因此可用于CDKN2A及上述表位多肽的检测。
[0010] 本发明还提供产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0011] 本发明提供的单克隆抗体与设计合成表位多肽，可用于检测人血或组织CDKN2A抗 体的定量表达，具有高特异性、高敏感性的优点，在临床检测和实验研究中将会得到广泛应 用。
【附图说明】
[0012] 图1是抗体的SDS-PAGE电泳图，其中Μ是蛋白分子量标准(kDa)，P1分别为本发明获 得的单克隆抗体；
[0013] 图2是P1克隆的亚型鉴定图，其中clone P1显示IgG2b信号最强，根据结果判定标 准，clone P1的亚型为IgG2b。
[0014] 图3所示的是ELISA法灵敏度实验的拟合曲线。
[0015] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0016] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0017] 实施例1、杂交瘤细胞系的建立
[0018] -、实验材料
[0019] 1、免疫原:本例以CDKN2A基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽， CDKN2A表位多肽:ATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESV，采用化学合成的方式制备这表位 多肽，纯度要求大于95%。表位多肽分别与KLH偶联制备成免疫原。
[0020] 2、培养基:DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于sigma公 司。
[0021] 3、实验动物:Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。
[0022] 4、其他材料:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于Fluka 公司;HRP-山羊抗小鼠 IgG抗体购于Jacksonlmmune公司；其余试剂均为国产分析纯产品。 [0023]二、杂交瘤细胞系的建立
[0024] 1、动物免疫
[0025] 1)基础免疫:将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只 Balb/c小鼠每次注射量为100yg。
[0026] 2)加强免疫:加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3 天，经腹腔注射含150ug抗原的生理盐水溶液。
[0027] 2、杂交瘤细胞的制备
[0028]按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进 行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10~15天，取上清采用间接ELI SA法筛选分泌抗表位 多肽抗原的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的 操作步骤如下：用200μ1的表位多肽包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生 长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠 IgG 100μ1， 最后测定450nm 0D值。凡0D450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。 [0029] 3、杂交瘤细胞系的建立
[0030]重复步骤2,进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株分别针 对表位多肽，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
[0031 ] 4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测
[0032] 1)细胞培养液上清效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞培养上清效价为： 1:50000-1:100000ο
[0033] 2)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1: 500000-1:1000000。
[0034] 5、杂交瘤细胞系的传代培养
[0035]将上述杂交瘤细胞系在含有10 %胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代， 培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到 1:10000 以上。
[0036] 以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗CDKN2A表 位多肽的单克隆抗体。
[0037] 获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否 则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体 的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部 分。保存方法如下：
[0038] 1.材料
[0039] (1)细胞:取对数生长期的细胞。
[0040] (2)10%二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不 能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10%二甲基亚砜、20%灭活胎牛血清，70% RPMI-1640液。
[0041 ] (3) 20 % FCS - 1640培养液:含青霉素 100U/ml，链霉素 100μg/ml。
[0042] (4)灭菌的2ml安瓶等
[0043] 2.操作方法
[0044] (1)去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10%FCS-1640液，使细胞悬浮。
[0045] (3) 1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10 %二甲基亚砜保护液制成悬液， 使成1.0X107细胞/ml。
[0046] (3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95 %以上。
[0047] (4)用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml~1.0ml，熔封安瓶。
[0048] (5)放 4°C2h。
[0049] (6)放液氮罐气态部分(_70°C) 15h。
[0050] (7)转入液氮部分。
[00511实施例2抗CDKN2A表位多肽的单克隆抗体的制备 [0052] 一抗体制备
[0053] 选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种第16 代杂交瘤细胞，每只小鼠 IX 106-2 X 106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤 有紧张感，即可用9号针头采集腹水。
[0054]将腹水离心（13000r/min 30分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用 Protein G~Sepharose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为： pH2.7，20mM的甘氨酸缓冲液，得到CDKN2A表位多肽的单克隆抗体(将由表位多肽序列产生 的单克隆抗体称之为clone Pl〇 [0055]二抗体的鉴定 [0056] 1、抗体纯度鉴定：
[0057] SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95%以上。
[0058] 2、抗体类及亚类鉴定：
[0059]采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗 体的Ig亚型，结果显示，CDKN2A表位多肽的的5个单克隆抗体均为（IgG2b)(图2)。
[0060] 3、抗体免疫印迹检测：
[00611常规Western Blot检测方法检测该抗体的特异性，使用SDS-PAGE电泳，湿转法转 至PVDF膜上，使用纯化的抗体进行Western Blot杂交检测。结果显示，上述方法制得的单克 隆抗体均能特异性识别CDKN2A表位多肽。
[0062] 4、克隆P1的可变区序列测定
[0063]将克隆细胞株提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩 增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基 酸序列。clone P1抗体的可变区氨基酸序列：clone P1的氨基酸序列为：轻链如SEQ ID No. 1所示，重链如SEQ ID No.2所示。
[0064] clone P1单克隆抗体的轻链序列： Thr Ser Pro Lys Arg Thr Arg： Phe· Se：r Gly Ser Met Ser Ala. P.h，e Pro 1 .5. 10: 15' Qlu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val As-n. Tyr Met 20 25 3：D His T,rp T^r Thr Ser T.hr Leu .Ala :Ser Gly Va.l Pro Ala Arg Cys Asn 35 40 45 Asp Thr Ser Thr Gin :Gln lys Ser Asp· Val Gin M.e；t Gly Gly Ser Ty：r
[0065] 5Q 55 60： Gly Ser Gly tb.r Ser Tyr Set Ley Thr ll.e Ser Sef Met G.lu Ala. Gly 65 70 75 80 Asp .Ala .Ala Thr Tyr :T.yr Cys· Gin Gin Trp :Ser· Ser Asn Pr.e Pr.e th：r 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 1:00 105
[0066] clone PI单克隆抗体的重链序列： V-al. Thr Il:e M'e:：t Gif Asn Thr A:sn .Ly:s: S6；r Gly G.ly G.ly S.er 1 5 10 15 Ser Ser Leu Ser Tbr €y：s· Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr Gly 20 25 30 Met Ser Trp ￥al Arg Leu .Ser lie Ser Gly Set Le.u Tyr .Leti. Set Val 35 40 45 Thr lie- Gin ：Gln Trp Arg ：G：ln Thr Pro Tvr Pro Asp Ser Val Lys Leu. 50 S.5 60
[0067] 〇 Gly Arg Phe Thr Il:e .Ser Gly Gly Leu Ala Lys： As.n Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gin Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Oln Oln Trp Val Glu Leu Ala 85 90 95 Ser Glu Gin Thr Pro; Asp Lys Thr Se.r Leu Lys His Ser Gly Val Thr 100 105 11G Met Asp Ser 11:.5
【主权项】
1. 一种单克隆抗体，其是以CDKN2A基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位 多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得，所述多肽序列选自： CDKN2A表位多肽：ATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESV; 所述载体蛋白为KLH; 所述单克隆抗体特异性地识别CDKN2A蛋白ATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESV表位 序列； 所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，重链可变区的氨基 酸序列如SEQ ID No.2所示。2. 产生权利要求1所述单克隆抗体的表位多肽序列及杂交瘤细胞。3. 含有权利要求1所述单克隆抗体的检测试剂盒。4. 如权利要求3所述的检测试剂盒，其为ELISA检测试剂盒，其以特异性地识别CDKN2A 蛋白ATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESV表位序列的单克隆抗体为包被抗体，以酶标记 的异性地识别CDKN2A蛋白ATERIYHFVVGQMVYY QCVQGYRALHRGPAESV表位序列的单克隆抗体 作为检测抗体。5. 权利要求1所述的单克隆抗体在检测CDKN2A蛋白中的应用。6. 权利要求3或4所述的检测试剂盒在检测CDKN2A蛋白中的应用。
【文档编号】C07K14/47GK106046156SQ201610382199
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】刘颖, 孙世龙
【申请人】吉林大学