用于治疗癌症的抗CCR4抗体和4‑1BB激动剂的组合的制作方法
本申请要求于2014年5月21日提交的美国临时申请No.62/001,534的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及可用于治疗癌症的组合疗法。特别地，本发明涉及包含特异性结合人CC趋化因子受体4(CCR4)的抗体和4-1BB蛋白的激动剂的组合疗法。
发明背景
已经认识到趋化因子是正常免疫监视和应答所必需的以及血细胞生成、血管生成、病毒感染的控制和T细胞分化中的几种其它功能所必需的基础白细胞运输的关键组分(Baggiolini等人，Ann.Rev.Immunol.15：675(1997)；Zou等人，Nature 393：595(1998)；Tachibana等人，Nature 393：591(1998))。生物活性的这种多样阵列，包括对白细胞的一系列促炎效应的介导，例如趋化性的触发、脱颗粒、脂质介质的合成和整联蛋白活化，以及它们在炎性疾病的引发和维持中的关键作用，已经使趋化因子和趋化因子受体成为有吸引力的新的一组治疗靶标。
趋化因子受体4(CCR4)由Power等人鉴定(J.Biol.Chem.270：19495-19500(1995)；Genbank登录号X85740)和Meyer等人(J.Biol.Chem.271(24)：14445-14451(1996)；Genbank登录号X94151)。CCR4是七次跨膜G蛋白偶联受体，并在Th2细胞和调节性T细胞上选择性表达(D'Ambrosio等人，J.Immunol.161：5111-5115(1998))。正常细胞例如Th2细胞上的CCR4表达可以被配体，特别是巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)部分调节(Mariani等人，Eur.J.Immunol.34：231-240(2004))，而癌细胞上的配体的调节还不清楚。已经表明，抗CCR4单克隆抗体选择性地耗竭效应子型FoxP3+CD4+调节性T细胞，从而引发人中的抗肿瘤免疫应答(Sugiyama等人，Proc.Nat.Acad.Sci.110(44)：17945-17950(2003))。
KW-0761(莫加利珠单抗或POTELIGEOTM)在日本被批准用于复发性或难治性CCR4阳性成人T细胞白血病/淋巴瘤和复发性或难治性CCR4阳性外周T细胞淋巴瘤(PTCL)和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。KW-0761是免疫球蛋白G亚类1(IgG1)κ同种型的人源化单克隆抗体，其靶向CCR4表达细胞并已显示通过ADCC耗竭表达CCR4的T淋巴细胞的能力。KW-0761由于在恒定(Fc)区从复合型寡糖的去岩藻糖基化而具有增强的ADCC活性。(Ishii等人，Clinical Cancer Research 16：1520-31(2010)；Shitara等人，Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof，美国专利号7,504,104；美国专利号8,491,901)。
最初被鉴定为在活化的T细胞上表达的诱导型共刺激受体的4-1BB(CD137和TNFRSF9)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的跨膜糖蛋白。对4-1BB的当前理解指出表达通常是活化依赖性的，并且涵盖免疫细胞的广泛子集，包括活化的NK和NKT细胞，调节性T细胞，树突状细胞(DC)包括滤泡DC，刺激的肥大细胞，分化髓样细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞(Wang等人，Immunol Rev.229(1)：192-215(2009))，和活化的B细胞(Zhang等人，J Immunol.184(2)：787-795(2010))。也已经在肿瘤脉管系统(Broll K等人，Am J Clin Pathol.115(4)：543-549(2001)；Seaman等人，Cancer Cell 11(6)：539-554(2007))和动脉粥样硬化内皮(Olofsson等，Circulation 117(10)：1292-1301(2008))上证实了4-1BB表达。刺激4-1BB(4-1BBL)的配体在活化的抗原呈递细胞(APC)、骨髓祖细胞和造血干细胞上表达。
在B细胞受体结合时，激活的正常人B细胞上的4-1BB与其配体的相互作用刺激增殖并增强存活(Zhang等人，J Immunol.184(2)：787-795(2010))。在两项已发表的研究中研究了4-1BB结合在B细胞淋巴瘤中的潜在影响。几种类型的人原代NHL样品的评价表明，4-1BB主要在浸润性T细胞而不是淋巴瘤细胞上表达(Houot等人，Blood 114(16)：3431-3438(2009))。将4-1BB激动剂加入具有利妥昔单抗和NK细胞的B淋巴瘤细胞的体外培养物导致增加的淋巴瘤杀伤(Kohrt等人，Blood 117(8)：2423-2432(2011))。此外，在食蟹猴中以0.001-100mg/kg的剂量使用PF-05082566(抗4-1BB激发型单克隆抗体)的两个实验中进行了B细胞免疫分型；在这些实验中，外周血B细胞数量不变或减少。
4-1BB在幼稚T细胞的表面上是不可检测的，但是在激活时表达增加。在4-1BB激活时，作为TNFR相关因子(TRAF)家族的促存活成员的TRAF-1和TRAF-2被募集到4-1BB胞质尾区，导致NFκB和有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶级联(包括ERK，JNK和p38MAP激酶)的下游激活。NFκB活化导致Bfl-1和Bcl-XL(Bcl-2家族的促存活成员)的上调。促凋亡蛋白Bim以TRAF-1和ERK依赖性方式下调(Sabbagh等人，J Immunol.180(12)：8093-8101(2008))。
报道已经显示，4-1BB激发型mAb增加共刺激分子表达并显著增强溶细胞T淋巴细胞反应，导致在多种模型中的抗肿瘤功效。4-1BB激发型mAb已经在单一疗法和组合疗法的预防和治疗设置中表现出功效，并且已经建立了持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答(Lynch等人，Immunol Rev.222：277-286(2008))。4-1BB激动剂还在多种自身免疫模型中抑制自身免疫应答(Vinay等人，J Mol Med 84(9)：726-736(2006))。
概述
本文提供了用于治疗个体中的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用抗CCR4抗体和4-1BB激动剂。
还提供了药物。在一些实施方案中，所述药物包含与4-1BB激动剂组合用于治疗癌症的抗CCR4抗体。在其它实施方案中，药物包含与抗CCR4抗体组合用于治疗癌症的4-1BB激动剂。
其它实施方案提供了抗CCR4抗体在制备用于当与4-1BB激动剂组合施用时治疗个体中的癌症的药物中的用途，以及4-1BB激动剂在制备用于当与抗CCR4抗体组合施用时治疗个体中的癌症的药物中的用途。
其它实施方案提供了抗CCR4抗体和4-1BB激动剂在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，药物包括试剂盒，并且试剂盒还包括包装插页，其包含用于将抗CCR4抗体与4-1BB激动剂组合使用以治疗个体中的癌症的说明书。
在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用包含耗竭CD4+T细胞的试剂和4-1BB激动剂的组合疗法。在一些实施方案中，CD4+T细胞是FoxP3+CD4+调节性T细胞。在一些实施方案中，耗竭CD4+T细胞的试剂选择性地耗竭FoxP3+CD4+调节性T细胞。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用包含耗竭CD4+T细胞的试剂、4-1BB激动剂和PD-1拮抗剂的组合疗法。在一些实施方案中，耗竭CD4+T细胞的试剂是抗CCR4抗体或抗CD4抗体。
在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用包含抗CCR4抗体、4-1BB激动剂和PD-1拮抗剂的组合疗法。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用包含抗CD4抗体、4-1BB激动剂和PD-1拮抗剂的组合疗法。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂还抑制PD-L2与PD-1的结合。在上述治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，PD-1拮抗剂是特异性结合PD-1或PD-L1并阻断PD-L1与PD-1结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
组合疗法还可以包含一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂可以是例如化疗剂，生物治疗剂(包括但不限于针对VEGF，VEGFR，EGFR，Her2/neu，其它生长因子受体，CD20,CD40,CD-40L,CTLA-4,OX-40,4-1BB,PD-1,TIM-3,LAG-3,GITR,CD137,ICOS,CD28,CD27,HVEM,BTLA,VISTA,CCR8,TIGIT,CD4,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB，CD137)，CYBB和CTLA4)，免疫原性剂(例如，减毒的癌细胞，肿瘤抗原，抗原呈递细胞，例如用肿瘤衍生的抗原或核酸脉冲的树突细胞，免疫刺激细胞因子(例如IL-2，IFNα2，GM-CSF)，和用编码免疫刺激细胞因子例如但不限于GM-CSF的基因转染的细胞)。
在一些实施方案中，抗CCR4抗体特异性结合人CCR4。在一些实施方案中，抗CCR4抗体可以选择性地耗竭CD4+T细胞。在一些实施方案中，抗CCR4抗体可以包含重链和轻链，其中重链和轻链包含图4中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)，前提是SEQ ID NO：15的C末端赖氨酸残基任选不存在。
在所述治疗方法、药物和用途的所有上述实施方案中，4-1BB激动剂与4-1BB的细胞外结构域结合，并且能够激动4-1BB。在上述治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，4-1BB激动剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述分离的抗体在位于SEQ ID NO：26的氨基酸残基115-156中的表位处结合人4-1BB。在一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：27的H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：28的H-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：29的H-CDR3氨基酸序列。在一些实施方案中，所述4-1BB激动剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：30的L-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：31的L-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：32的L-CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：20所示的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：19所示的重链可变区氨基酸序列，并且还包含如SEQ ID NO：20所示的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：21所示的重链氨基酸序列，并且还包含如SEQ ID NO：22所示的轻链氨基酸序列，条件是SEQ ID NO：21的C末端赖氨酸残基任选不存在。
在本发明的上述治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，所述个体是人，并且癌症是实体瘤，并且在一些实施方案中，实体瘤是膀胱癌，乳腺癌，透明细胞肾癌，结肠癌，头/颈鳞状细胞癌，直肠癌，肺鳞状细胞癌，甲状腺癌，膀胱癌，宫颈癌，子宫癌，子宫内膜癌，肺腺癌，卵巢癌，乳头状肾癌，恶性黑素瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾细胞癌，小细胞肺癌(SCLC)或三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是晚期实体瘤恶性肿瘤。
在本发明的上述治疗方法、药物和用途的其它实施方案中，所述个体是人，并且所述癌症是血红素恶性肿瘤，并且在一些实施方案中，所述血红素恶性肿瘤是急性成淋巴细胞白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性成淋巴细胞白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，EBV阳性DLBCL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，T细胞/组织细胞富集大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(HL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，多发性骨髓瘤(MM)，骨髓细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)，骨髓增生异常综合征(MDS)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
在任何上述治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，癌症对于CCR4的表达测试为阳性。在一些实施方案中，癌症具有升高的CCR4表达。
在任何上述治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，所述个体是人，并且所述癌症是对人CCR4测试为阳性的晚期实体瘤。
附图简述
图1描述了用于本发明的示例性抗CCR4单克隆抗体的轻链和重链CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-6)。
图2描述了用于本发明的另一个示例性抗CCR4单克隆抗体的轻链和重链CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO：7-12)。
图3描述了用于本发明的示例性抗CCR4单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)。
图4描述了抗CCR4单克隆抗体KW-0761的全长重链和轻链的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：15和16)，以及抗CCR4单克隆抗体KW-0761的重链和轻链可变区的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：17和18)。
图5描述了抗-PD-1抗体纳武单抗(nivolumab)的重链和轻链的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：23和24)。
图6描述了4-1BB激发型抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：19和20)。
图7描述了4-1BB激发型抗体的重链CDR序列(SEQ ID NO：27、28和29)和轻链CDR序列(SEQ ID NO：30、31和32)的氨基酸序列。
图8描述了PF-05082566的重链和轻链的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：21和22)。
图9描绘了显示在B16黑素瘤模型中CD4+T细胞耗竭对4-1BB激发型抗体治疗、PD-1拮抗剂抗体治疗和组合治疗的影响的图。
图10描述了显示在CT26结肠肿瘤模型中CD4+T细胞耗竭对4-1BB激发型抗体治疗、PD-1拮抗剂抗体治疗和组合治疗的影响的图。
详述
缩写。在本发明的详细描述和实施例中，将使用以下缩写：
BID 一个剂量，每日两次
CDR 互补决定区
CHO 中华仓鼠卵巢
DFS 无疾病存活
DLT 剂量限制性毒性
FFPE 经福尔马林固定、石蜡包埋的
FR 构架区
HNSC 头/颈鳞状细胞癌。
IgG 免疫球蛋白G
IHC 免疫组织化学或免疫组织化学的
MDSC 髓源性抑制细胞
MTD 最大耐受剂量
NCBI 国家生物技术信息中心
NCI 国家癌症研究所
OR 总体反应
OS 总体存活
PD 进行性疾病
PFS 无进展存活
PR 部分反应
Q1W 每一周一个剂量
Q2W 每两周一个剂量
Q3W 每三周一个剂量
Q4W 每四周一个剂量
QD 每天一个剂量
RECIST 实体肿瘤中的应答评价标准
SD 病情稳定
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
I.定义
为了使本发明更容易理解，某些技术和科学术语在下面具体定义。除非在本文的其它地方具体定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
当用于修饰数字限定的参数(例如，抗CCR4抗体或4-1BB激动剂的剂量或本文所述的组合治疗的治疗时间的长度)时，“约”意指参数可以在该参数的规定数值之上或之下多至10％上变化。例如，约5mg/kg的剂量可以在4.5mg/kg和5.5mg/kg之间变化。
如本文包括所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式的词例如“一种”、“一个”和“该”包括它们相应的复数形式。
当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，“施用”和“治疗”是指外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。“施用”和“治疗”还指通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。术语“受试者”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠，小鼠，狗，猫，兔)，最优选人。
术语“药学上可接受的载体”是指适合用于递送结合分子的制剂中的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂，粘合剂，包衣，崩解剂，填充剂或稀释剂，防腐剂(例如抗氧化剂，抗细菌剂或抗真菌剂)，甜味剂，吸收延迟剂，润湿剂，乳化剂，缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的实例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)右旋糖，植物油(例如橄榄油)，盐水，缓冲液，缓冲盐水，和等渗剂，例如糖，多元醇，山梨醇和氯化钠。
如本文所用，术语“抗体”是指表现出所需生物或结合活性的任何形式的免疫球蛋白分子。因此，其以最广泛的含义使用，并且具体涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，人源化、完全人抗体，嵌合抗体和骆驼化单域抗体。“亲本抗体”是通过在针对预期用途修饰抗体(例如用作人类治疗剂的抗体的人源化)之前将免疫系统暴露于抗原而获得的抗体。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且除非另有说明，还包括与完整抗体竞争特异性结合的其任何抗原结合部分，包含抗原结合部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗原结合部分包括例如Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv，结构域抗体(dAb，例如鲨鱼和骆驼抗体)，包含互补决定区(CDR)的片段，单链可变片段抗体(scFv)，最大抗体，微型抗体，胞内抗体，双抗体，三抗体，四抗体，v-NAR和双scFv，以及含有免疫球蛋白的至少一部分(足以赋予多肽特异性的抗原结合)的多肽。抗体包括任何类别的抗体，例如IgG，IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定类别。取决于其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以归于不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
本文所用的术语“4-1BB抗体”是指能够结合人4-1BB受体的如本文定义的抗体。
如本文所用的“可变区”或“V区”或“V链”是指在不同抗体之间在序列上可变的IgG链的区段。它延伸到轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。抗体的“可变区”指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。通常，重链和轻链的可变区包含位于相对保守的构架区(FR)内的三个高变区，也称为互补决定区(CDR)。CDR通常通过构架区排列，以使得能够结合特定表位。一般来说，从N末端到C末端，轻链和重链可变结构域都包含FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。通常，每个结构域的氨基酸的分配符合Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；5th ed.；NIH出版号91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat,等人,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia,等人,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia,等人,(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文所用，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”(即轻链可变结构域中的CDRL1，CDRL2和CDRL3以及重链可变结构域中的CDRH1，CDRH2和CDRH3)的氨基酸残基。参见Kabat等人.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed。Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(通过序列定义抗体的CDR区)；也参见Chothia和Lesk(1987)Biol.196：901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。如本文所用，术语“构架”或“FR”残基指除本文定义为CDR残基的高变区残基外的那些可变结构域残基。
除非另有说明，否则本文所用的“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合由全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的多特异性抗体和纳米抗体。
“特异性结合”特定靶蛋白的抗体是与其它蛋白相比显示优先结合该靶的抗体，但该特异性不需要绝对的结合特异性。如果其结合决定了样品中靶蛋白的存在，例如没有产生不希望的结果如假阳性，则抗体被认为针对其预期靶是“特异性”的。本发明中有用的抗体将以是与非靶蛋白的亲和力的至少2倍，优选至少10倍，更优选至少20倍，最优选至少100倍的亲和力结合靶蛋白。如本文所用，抗体被认为特异性结合包含给定的氨基酸序列例如成熟人PD-1或人PD-L1分子的氨基酸序列的多肽，前提是其结合包含该序列的多肽但不结合缺少该序列的蛋白质。
“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种(例如，人)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种(例如小鼠)或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需的生物活性。
“人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，人抗体可以包含鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”是指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
“人源化抗体”是指包含来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。这样的抗体含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。当必要时将前缀“hum”，“hu”或“h”添加到抗体克隆名称中，以将人源化抗体与亲本啮齿动物抗体区分开。啮齿动物抗体的人源化形式通常包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，尽管可包括某些氨基酸取代以增加亲和力，增加人源化抗体的稳定性或出于其它原因。
术语“癌症”、“癌性”或“恶性”是指或描述哺乳动物中通常特征在于不受调节的细胞生长的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌，淋巴瘤，白血病，胚细胞瘤和肉瘤。这种癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌，肺腺癌，头/颈鳞状细胞癌，骨髓瘤，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，神经胶质瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，急性骨髓性白血病(AML)，多发性骨髓瘤，胃肠(道)癌，直肠癌，肾癌，卵巢癌，肝癌，成淋巴细胞白血病，淋巴细胞性白血病，结肠直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，前列腺癌，甲状腺癌，黑素瘤，软骨肉瘤，神经母细胞瘤，胰腺癌，多形性成胶质细胞瘤，骨癌，尤因氏肉瘤，宫颈癌，脑癌，胃癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，子宫癌，卵巢癌和头颈癌。涉及4-1BB或CCR4的多种癌症，无论是恶性的还是良性的，无论是原发性还是继发性的，可以通过本公开内容提供的方法治疗或预防。可根据本发明治疗的特别优选的癌症包括特征为在测试的组织样品中表达CCR4的那些癌症。
“生物治疗剂”是指在支持肿瘤维持和/或生长或抑制抗肿瘤免疫应答的任何生物学途径中阻断配体/受体信号传导的生物分子，例如抗体或融合蛋白。
除非另有说明，本文所用的“CDR”是指使用Kabat编号系统定义的免疫球蛋白可变区中的互补决定区。
“化疗剂”是指可以引起癌细胞死亡或干扰癌细胞的生长、分裂、修复和/或功能的化学或生物物质。化疗剂的实例包括公开于WO 2006/129163和US 20060153808中的那些，其公开内容通过引用并入本文。化疗剂的类别包括但不限于：烷化剂，抗代谢物，激酶抑制剂，纺锤体毒物植物生物碱，细胞毒性/抗肿瘤抗生素，拓扑异构酶抑制剂，光敏剂，抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，抗孕酮，雌激素受体下调剂(ERD)，雌激素受体拮抗剂，黄体生成素释放激素激动剂，抗雄激素，芳香酶抑制剂，EGFR抑制剂，VEGF抑制剂，抑制与异常细胞增殖或肿瘤生长相关的基因的表达的反义寡核苷酸。可用于本发明的治疗方法的化疗剂包括细胞抑制剂和/或细胞毒剂。
本公开内容提供的抗体和组合物可以通过任何合适的肠内施用途径或胃肠外施用途径施用。术语施用的“肠内途径”是指经由胃肠道的任何部分的施用。肠内途径的实例包括口服、粘膜、颊和直肠途径或胃内途径。“肠胃外途径”是指肠内途径以外的施用途径。肠胃外施用途径的实例包括静脉内，肌内，皮内，腹膜内，肿瘤内，膀胱内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，经气管，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内，皮下或局部施用。本公开内容的抗体和组合物可以使用任何合适的方法施用，例如通过口服摄取，鼻胃管，胃造口术管，注射，输注，可植入输注泵和渗透泵。施用的合适途径和方法可以根据许多因素而变化，所述因素例如是所用的特异性抗体，所需的吸收速率，所用的具体制剂或剂型，所治疗疾病的类型或严重程度，作用的具体位点，和患者的状况，并且可以由本领域技术人员容易地选择。
本文所用的关于药物施用的术语“同时施用”是指施用药物，以使得个体药物同时存在于受试者体内。除了同时施用药物(通过相同或替代途径)外，同时施用还可包括在不同时间施用药物(通过相同或替代途径)。
具有效应A和B的两种单一化合物的Bliss独立组合反应C为C＝A+B-A*B，其中每种效应表示为0和1之间的分数抑制。(参考：Bliss(1939)Annals of Applied Biology)被定义为实验响应和计算的Bliss独立值之间的差的Bliss值表明组合的两种化合物是否是加性的或协同的。
零(0)的Bliss值被认为是加性的。术语“加性的”是指两种靶向试剂的组合的结果是单独每种试剂的总和。
本文所用的“Chothia”是指在Al-Lazikani等，JMB 273：927-948(1997)中描述的抗体编号系统。
“保守性修饰的变体”或“保守性取代”是指用具有相似特征(例如电荷，侧链大小，疏水性/亲水性，骨架构象和刚性等)的其它氨基酸取代蛋白质中的氨基酸，以使得可以频繁地进行改变而不改变蛋白质的生物活性或其它所需性质，例如抗原亲和力和/或特异性。通常，本领域技术人员认识到，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见例如Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第4版))。此外，结构上或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。示例性保守取代列于下表1中。
表1.示例性保守氨基酸取代
在整个说明书和权利要求书中使用的“基本上由...组成”及其变体，例如“基本由...组成”或“大体上由...组成”表示包括任何列举的元素或元素组，以及任选地包括与所列举的元素具有相似或不同性质的其它元素，其不会实质上改变所指定的剂量方案、方法或组合物的基本或新颖性质。作为非限制性实例，基本上由所列举的氨基酸序列组成的抗CCR4抗体还可以包括一个或多个氨基酸(包括一个或多个氨基酸残基的取代)，其不会实质上影响结合化合物的性质。
“抗CCR4抗体”是指特异性结合CCR4的抗体。
如本文所用，抗人CCR4是指特异性结合人CCR4的抗体。一个示例性人CCR4分子由以下序列组成：
MNPTDIADTT LDESIYSNYY LYESIPKPCT KEGIKAFGEL FLPPLYSLVF VFGLLGNSVV VLVLFKYKRL RSMTDVYLLN LAISDLLFVF SLPFWGYYAA DQWVFGLGLC KMISWMYLVG FYSGIFFVML MSIDRYLAIV HAVFSLRART LTYGVITSLA TWSVAVFASL PGFLFSTCYT ERNHTYCKTK YSLNSTTWKV LSSLEINILG LVIPLGIMLF CYSMIIRTLQ HCKNEKKNKA VKMIFAVVVL FLGFWTPYNI VLFLETLVEL EVLQDCTFER YLDYAIQATE TLAFVHCCLN PIIYFFLGEK FRKYILQLFK TCRGLFVLCQ YCGLLQIYSA DTPSSSYTQS TMDHDLHDAL (SEQ ID NO：25)(UniProtKB/SWISS-PROT：P51679.1；GenBank登录号NM_005508.2)。
本文所用的“构架区”或“FR”是指排除CDR区的免疫球蛋白可变区。
“同源性”是指两个多肽序列在最佳比对时的序列相似性。当两个比较的序列两者中的位置被相同的氨基酸单体亚单位占据时，例如，如果两个不同Ab的轻链CDR中的一个位置被丙氨酸占据，则两个Ab在该位置是同源的。同源性百分比是由两个序列共有的同源位置的数目除以比较的位置的总数再×100。例如，如果两个序列中10个位置中的8个在序列最佳比对时匹配或同源，则两个序列是80％同源的。通常，当两个序列比对以产生最大百分比同源性时进行比较。例如，可以通过BLAST算法执行比较，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。
以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul,S.F.,等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.,等人,(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.,等人,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.,等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.,等人,(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.,等人,(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等人,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.,等人,"A model of evolutionary change in proteins."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.,等人,"Matrices for detecting distant relationships."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3."M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.,等人,(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.,等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.,等人,(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.,等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Karlin,S.,等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877；Dembo,A.,等人,(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；和Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments."in Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai,ed.),(1997)pp.1-14,Plenum,New York。
“分离的抗体”和“分离的抗体片段”是指纯化状态，并且在这样的上下文中是指所述分子基本上不含其它生物分子，例如核酸，蛋白质，脂质，碳水化合物或其它材料，例如细胞碎片和生长介质。通常，术语“分离的”不意指完全不存在这样的物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以基本上干扰如本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。
本文所用的“Kabat”是指由Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)开创的免疫球蛋白比对和编号系统。
如本文所使用的，“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指基本上同质的抗体群，即包含在氨基酸序列上除了可能的可少量存在的天然存在的突变以外是相同的群体的抗体分子。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括在其可变结构域特别是其CDR中具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，其通常特异于不同表位。修饰语“单克隆”表示如从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人(1975)Nature 256：495首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可以使用例如Clackson等人(1991)Nature 352：624-628和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。还参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。
“患者”或“受试者”是指需要治疗或正参与临床试验、流行病学研究或用作对照的任何单个受试者，包括人和哺乳动物兽医患者，例如牛、马、狗和猫。
结合人CCR4并且可用于本发明的治疗方法、药物和用途的mAb的实例描述于例如US8491902和US20110171210中。在本发明的治疗方法、药物和用途中用作抗CCR4抗体的特异性抗人CCR4 mAb包括：KW-0761，其具有CAS登记号1159266-37-1的人源化IgG1 mAb，并且包含图4所示的重链和轻链氨基酸序列；和US20110171210中描述的人源化抗体huCCR4，其包含图3所示的重链和轻链可变区氨基酸序列。
在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，抗CCR4抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)轻链CDR SEQ ID NO：1、2和3以及重链CDR SEQ ID NO：4、5和6；或(b)轻链CDR SEQ ID NO：7、8和9以及重链CDR SEQ ID NO：10、11和12。
在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，抗CCR4抗体是特异性结合人CCR4的单克隆抗体，并且包含(a)包含SEQ ID NO：13的重链可变区和(b)包含SEQ ID NO：14的轻链可变区。
在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，抗CCR4抗体是特异性结合人CCR4的单克隆抗体，并且包含(a)包含SEQ ID NO：15的重链和(b)包含SEQ ID NO：16的轻链。
下表2提供了用于本发明的治疗方法、药物和用途的示例性抗CCR4 mAb的氨基酸序列的列表，并且序列显示在图1-4中。
“持续反应”意指在停止用治疗剂或本文所述的组合疗法治疗后的持续治疗效果。在一些实施方案中，持续反应具有至少与治疗持续时间相同的持续时间，或为治疗持续时间的至少约1.5、2.0、2.5或3倍。
术语“协同作用”或“协同的”用于表示两种药剂的组合的反应大于每种药剂的单独反应的总和。更具体地，在体外设置中，协同作用的一种量度被称为“Bliss协同作用”。Bliss协同作用是指“超过Bliss独立性的过量(excess over Bliss independence)”，如通过上述Bliss值所确定的。当Bliss值大于零(0)，或更优选大于0.2时，认为其表示协同作用。当然，本文中“协同作用”的使用还包括通过其它和/或替代方法测量的体外协同作用。本文提及的组合的体外生物效应(包括但不限于抗癌作用，其大于或等于组合的单独组分的总和)可与Bliss值相关。此外，本文中的“协同作用”，包括组分的组合是否表现出等于或大于单独组分的总和的活性，可以通过另外的和/或替代的方法测量，并且是本领域技术人员已知的或将是明显的。
“组织切片”是指组织样品的单个部分或块，例如从正常组织或肿瘤的样品切割的薄切片组织。
本文所用的“治疗”或“医治”癌症是指对患有癌症或被诊断患有癌症的受试者施用抗CCR4抗体和4-1BB激动剂的组合疗法，以实现至少一种积极的治疗效果，例如癌细胞数目减少，肿瘤尺寸减小，癌细胞浸润到外周器官中的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长速率降低。癌症中的积极治疗效果可以以多种方式测量(参见，W.A.Weber，J.Nucl.Med.50：1S-10S(2009))。例如，对于肿瘤生长抑制，根据NCI标准，T/C≤42％是抗肿瘤活性的最低水平。T/C<10％被认为是高抗肿瘤活性水平，其中T/C(％)＝治疗的中值肿瘤体积/对照的中值肿瘤体积×100。在一些实施方案中，通过本发明的组合实现的治疗是PR、CR、OR、PFS、DFS和OS中的任一种。PFS(也称为“肿瘤进展时间”)表示治疗期间和之后癌症不生长的时间长度，并且包括患者经历CR或PR的时间量，以及患者经历SD的时间量。DFS是指治疗期间和治疗后患者保持无疾病的时间长度。OS是指与未处理或未治疗的个体或患者相比，寿命预期的延长。在一些实施方案中，对本发明组合的反应是使用RECIST 1.1反应标准评估的PR、CR、PFS、DFS、OR或OS中的任一种。用于本发明的组合的有效治疗癌症患者的治疗方案可以根据诸如患者的疾病状态、年龄和体重的因素以及治疗在受试者中引起抗癌反应的能力而变化。虽然本发明的任何方面的实施方案可能不能有效地在每个受试者中获得积极的治疗效果，但是它应该在统计学显著数量的受试者中如此，如通过本领域已知的任何统计学测试所确定的，例如学生氏t检验，chi2-检验，根据Mann和Whitney的U检验，Kruskal-Wallis检验(H检验)，Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验。
术语“治疗方案”、“给药方案”和“施用方案”可互换使用来指本发明的组合中的每种治疗剂的施用剂量和时间。
当应用于诊断患有或怀疑患有癌症的受试者时，“肿瘤”是指任何大小的恶性或潜在恶性肿瘤或组织块，并且包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常生长的组织块。不同类型的实体瘤根据形成它们的细胞类型来命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液癌症)通常不形成实体瘤(National Cancer Institute，Dictionary of Cancer Terms)。
“肿瘤负荷”也称为“肿瘤负担”，是指分布在整个身体中的肿瘤物质的总量。肿瘤负荷是指在整个身体包括淋巴结和骨髓中的癌细胞的总数或肿瘤的总大小。可以通过本领域已知的多种方法测定肿瘤负荷，例如，通过在从受试者移除后测量肿瘤的尺寸，例如使用测径器，或通过在体内时使用成像技术(例如超声，骨扫描，计算机断层摄影(CT)或磁共振成像(MRI)扫描)。
术语“肿瘤大小”是指可被测量为肿瘤的长度和宽度的肿瘤的总大小。肿瘤大小可以通过本领域已知的多种方法测定，例如，通过在从受试者移除后测量肿瘤的尺寸，例如使用测径器，或通过在体内时使用成像技术(例如骨扫描，超声，CT或MRI扫描)。
4-1BB包含信号序列(氨基酸残基1-17)，其后是胞外结构域(169个氨基酸)，跨膜区(27个氨基酸)和胞内结构域(42个氨基酸)(Cheuk ATC等人,2004Cancer Gene Therapy 11：215-226)。受体在细胞表面上以单体和二聚体形式表达，并且可能与4-1BB配体三聚化以传导信号。
在幼稚T细胞的表面上不能检测到4-1BB，但是在激活时表达增加。在4-1BB激活时，作为TNFR相关因子(TRAF)家族的促存活成员的TRAF-1和TRAF-2被募集到4-1BB胞质尾区，从而导致NFκB和有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶级联(包括ERK，JNK和p38MAP激酶)的下游激活。NFκB活化导致Bcl-2家族的促存活成员Bfl-1和Bcl-XL的上调。促凋亡蛋白Bim以TRAF1和Erk依赖性方式下调(24)。
术语“4-1BB”和“4-1BB受体”在本申请中可互换使用，并且指任何形式的4-1BB受体，以及保留4-1BB受体的至少部分活性的其变体、同种型和物种同源物。因此，如本文定义和公开的结合分子也可以结合来自除人之外的物种的4-1BB。在其它情况下，结合分子可以完全特异于人4-1BB并且可不表现物种或其它类型的交叉反应性。除非另有说明，例如通过特别提及人4-1BB，否则4-1BB包括天然序列4-1BB的所有哺乳动物物种(例如人，犬，猫，马和牛)。一个示例性人4-1BB是255个氨基酸的蛋白质(登录号NM_001561；NP_001552)。完整的人4-1BB氨基酸序列的一个实施方案提供于SEQ ID NO：26。
本文所用的“4-1BB激动剂”是指本文定义的任何化学化合物或生物分子，其在结合4-1BB时，(1)刺激或激活4-1BB，(2)增强、增加、促进、诱导或延长4-1BB的活性、功能或存在，或(3)增强、增加、促进或诱导4-1BB的表达。
可用于本发明的任何治疗方法、药物和用途的4-1BB激动剂包括特异性结合4-1BB的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。4-1BB的替代名称或同义词包括CD137和TNFRSF9。在其中治疗人类个体的本发明的任何治疗方法、药物和用途中，4-1BB激动剂增加4-1BB介导的反应。在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，4-1BB激动剂显著增强细胞毒性T细胞反应，从而在几种模型中导致抗肿瘤活性。
mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可以包含人恒定区。在一些实施方案中，人恒定区选自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4恒定区，并且在一些实施方案中，人恒定区是IgG1或IgG4恒定区。在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab，Fab'-SH，F(ab')2，scFv和Fv片段。
结合人4-1BB并且可用于本发明的治疗方法、药物和用途的mAb的实例描述于US 8,337,850和US 2013-0078240中。在本发明的治疗方法、药物和用途中用作4-1BB激动剂的特异性抗人4-1BB mAb包括PF-05082566。PF-05082566是靶向4-1BB的完全人源化IgG2激发型单克隆抗体。
在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，4-1BB激动剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)轻链CDR SEQ ID NO：30、31和32以及重链CDR SEQ ID NO：27、28和29。
在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，4-1BB激动剂是特异性结合人4-1BB的单克隆抗体或其抗原结合片段，并且包含(a)包含SEQ ID NO：19的重链可变区或其变体，和(b)包含选自SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区或其变体。重链可变区序列的变体与参照序列相同，除了在构架区(即，CDR外部)具有高达17个保守氨基酸取代，并且在构架区中优选具有少于十，九，八，七，六或五个保守氨基酸取代。轻链可变区序列的变体与参照序列相同，除了在构架区(即，CDR外部)具有多达五个保守氨基酸取代，并且在构架区中优选具有少于四个，三个或两个保守氨基酸取代。
在本发明的治疗方法、药物和用途的一些实施方案中，4-1BB激动剂是特异性结合人4-1BB的单克隆抗体，并且包含(a)如SEQ ID NO：21中所示的重链氨基酸序列和(b)如SEQ ID NO：22所示的轻链氨基酸序列，条件是SEQ ID NO：21的C末端赖氨酸残基任选不存在。
“PD-1拮抗剂”是指阻断癌细胞上表达的PD-L1与免疫细胞(T细胞，B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1结合的任何化学化合物或生物分子，其优选还阻断癌细胞上表达的PD-L2与免疫细胞表达的PD-1的结合。PD-1及其配体的替代名称或同义词包括：对于PD-1的PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；对于PD-1的PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；和对于PD-2的PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在其中治疗人类个体的本发明的任何治疗方法、药物和用途中，抗PD-1抗体阻断人PD-L1与人PD-1的结合，并且优选阻断人PD-L1和PD-L2结合人PD1。示例性人PD-1氨基酸序列可以在NCBI Locus No.:NP_005009中找到。示例性人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可以分别在NCBI Locus No.:NP_054862和NP_079515中找到。
可用于本发明的任何治疗方法、药物和用途的PD-1拮抗剂包括特异性结合PD-1或PD-L1以及优选特异性结合人PD-1或人PD-L1的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可以包括人恒定区。在一些实施方案中，人恒定区选自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4恒定区，并且在一些实施方案中，人恒定区是IgG1或IgG4恒定区。在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab，Fab'-SH，F(ab')2，scFv和Fv片段。
应当理解，无论何处在本文中用语言“包括”描述实施方案，否则也提供以术语“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的类似实施方案。
在本发明的方面或实施方案以马库什组或其它替代分组描述时，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，而且单独地包括该组的每个成员和主要组的所有可能的亚组，以及没有一个或多个组成员的主要组。本发明还设想明确排除所要求保护的发明中的任何组成员中的一个或多个。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”或其变形例如“含有”或“包含”将被理解为暗示包括所述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。术语“例如”或“诸如”之后的任何实例不意味着是穷尽的或限制性的。
本文描述了示例性方法和材料，尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。材料、方法和实例仅是举例说明性的，而不是限制性的。
II.方法、用途和药物
本文提供了用于治疗个体中癌症的方法，包括向个体施用包含抗CCR4抗体和4-1BB激动剂的组合疗法。在一些实施方案中，组合疗法包括抗CCR4抗体、4-1BB激动剂和PD-1拮抗剂。
组合疗法还可以包含一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂可以是例如化疗剂，生物治疗剂(包括但不限于针对VEGF，VEGFR，EGFR，Her2/neu，其它生长因子受体，CD20,CD40,CD-40L,CTLA-4,OX-40,4-1BB,PD-1,TIM-3,LAG-3,GITR,CD137,ICOS,CD28,CD27,HVEM,BTLA,VISTA,CCR8,TIGIT,CD4,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB，CD137)，CYBB和CTLA4)，免疫原性剂(例如，减毒的癌细胞，肿瘤抗原，抗原呈递细胞，例如用肿瘤衍生的抗原或核酸脉冲的树突细胞，免疫刺激细胞因子(例如IL-2，IFNα2，GM-CSF)，和用编码免疫刺激细胞因子例如但不限于GM-CSF的基因转染的细胞)。
化疗剂的实例包括烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯并多巴，卡波醌，meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和甲基蜜胺类包括六甲蜜胺，三乙撑蜜胺，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；番荔枝内酯类(特别是牛磺草胺和布地那新)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；cryptophycin(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；多卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；电穿孔素；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯磷酰胺，雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥，盐酸氧化氮芥，美法仑，诺维本，胆甾醇对苯乙酸氮芥，泼尼莫司汀，曲磷胺，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀，氯唑菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl。，33：183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；双膦酸盐，例如氯屈膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)，aclacinomysins，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博莱霉素，放线菌素c，卡拉霉素，caminomycin，嗜癌霉素，色霉素，放线菌素D，柔红霉素，地托比星，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(包括吗啉代-多柔比星，氰吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉5-多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星，依索比星，伊达比星，麻西罗霉素，丝裂霉素如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿嘧啶，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷；雄激素如卡普睾酮，丙酸甲雄烷酮，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯；抗肾上腺药如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂如糠酸；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；爱波喜龙；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼；丙卡巴肼；丙亚胺；根瘤菌素；西佐呋喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素，鞣花素A，杆孢菌素A和anguidine)；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素例如视黄酸；卡培他滨；以及任何上述的药学上可接受的盐，酸或衍生物。还包括用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，雷洛昔芬，LY117018，奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；抑制芳香酶(其调节肾上腺中的雌激素产生)的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑，氨鲁米特，乙酸甲地孕酮，依西美坦，福美斯坦，法曲唑，伏罗唑，来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的药学上可接受的盐，酸或衍生物。
本发明的组合疗法中的每种治疗剂可以单独或在药物(也称为药物组合物)中施用，所述药物包含治疗剂和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂，根据标准制药实践。
本发明的组合疗法中的每种治疗剂可以同时(即，在相同的药物中)、并行(即，在以任何顺序一个接一个地施用的单独的药物中)或以任何顺序相继施用。当组合治疗中的治疗剂是不同剂型(一种药剂是片剂或胶囊，另一种药剂是无菌液体)和/或以不同的给药方案(，例如至少每天施用的化疗剂和以更低频率例如每周一次、每两周一次或每三周一次施用的生物治疗剂)施用时，相继施用是特别有用的。
剂量单位可以以mg/kg(即mg/kg体重)或mg/m2表示。mg/m2剂量单位是指以毫克/平方米体表面积表示的量。
在一些情况下，将抗CCR4抗体和4-1BB激动剂组合或共配制在单一剂型中。
尽管可以在治疗或预防的整个期间维持抗CCR4抗体和4-1BB激动剂的同时施用，但是也可以通过随后单独施用一种化合物实现抗癌活性(例如，在组合治疗后，在没有4-1BB激动剂的情况下施用抗CCR4抗体，或者替代地，在组合治疗后，在没有抗CCR4抗体的情况下施用4-1BB激动剂)。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂在施用抗CCR4抗体之前施用，而在其它实施方案中，4-1BB激动剂在施用抗CCR4抗体之后施用。
在一些实施方案中，组合治疗中的至少一种治疗剂使用当药剂用作治疗相同癌症的单一疗法时通常使用的相同剂量方案(剂量，频率和治疗持续时间)来施用。在其它实施方案中，患者在组合治疗中接受至少一种治疗剂的比当药剂用作单一疗法时的更低的总量，例如较小剂量、较低频率的剂量和/或较短的治疗持续时间。
本发明的组合治疗可以在手术除去肿瘤之前或之后使用，并且可以在放射治疗之前、期间或之后使用。
在一些实施方案中，将本发明的组合治疗施用于先前未用生物治疗剂或化疗剂治疗的患者(即，是第一次治疗的)。在其它实施方案中，将组合疗法施用给在用生物治疗剂或化疗剂进行预先治疗后未能实现持续反应的患者(即，是经历了治疗的)。
本发明的组合疗法通常用于治疗足够大以通过触诊或通过本领域熟知的成像技术例如MRI、超声或CAT扫描发现的肿瘤。在一些实施方案中，本发明的组合治疗用于治疗尺寸为至少约200mm3，300mm3，400mm3，500mm3，750mm3或高达1000mm3的晚期肿瘤。
本发明的组合治疗优选施用于患有对CCR4表达测试为阳性的癌症的人类患者。在一些实施方案中，在免疫组织化学(IHC)测定中，使用诊断性抗人CCR4抗体在从患者取出的肿瘤样品的FFPE或冷冻组织切片上检测CCR4表达。通常，患者的医生将进行诊断测试以在开始用抗CCR4抗体和4-1BB激动剂治疗之前确定从患者取出的肿瘤组织样品中的CCR4表达，但是设想了医生可以在开始治疗之后的任何时间(例如在治疗周期完成后)进行第一次或随后的诊断测试。
在一个实施方案中，以对于任何治疗是常规的方式来定制剂量方案以适应特定患者的病况、反应和联合治疗，并且剂量方案可能需要响应于病况的变化和/或鉴于其它临床条件来调整。
在一些实施方案中，为本发明的组合治疗选择剂量方案(本文中也称为施用方案)取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率，症状水平，实体的免疫原性，以及被治疗个体中靶细胞、组织或器官的可及性。优选地，剂量方案使递送给患者的每种治疗剂的量最大化，与可接受的副作用水平一致。因此，组合中每种生物治疗剂和化疗剂的剂量和给药频率部分地取决于特定的治疗剂、所治疗的癌症的严重程度和患者特征。选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指导是可获得的。参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602；Physicians'Desk Reference 2003(Physicians'Desk Reference,57th Ed)；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(November 2002)。合适的剂量方案的确定可以由临床医生例如使用本领域已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素进行，并且将取决于例如患者的临床病史(例如，先前的治疗)、待治疗的癌症的类型和阶段以及在组合治疗中对一种或多种治疗剂的反应的生物标志物。
本发明的组合疗法中的生物治疗剂可以通过连续输注施用，或以例如每天、每隔一天、每周三次或每周、每两周、每三周、每月、每两月一次等的间隔的剂量施用。总的每周剂量通常为至少约0.05μg/kg，0.2μg/kg，0.5μg/kg，1μg/kg，10μg/kg，100μg/kg，0.2mg/kg，1.0mg/kg，2.0mg/kg，10mg/kg，25mg/kg，50mg/kg体重或更多。参见，例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:133-144。
在采用抗人CCR4 mAb作为组合治疗中的抗CCR4抗体的一些实施方案中，施用方案将包括在整个治疗过程中以约7天(±2天)或14天(±2天)或约21天(±2天)或约30天(±2天)的间隔施用约0.5、1、2、3、5或10mg/kg剂量的抗人CCR4 mAb。
在使用抗人CCR4 mAb作为组合治疗中的抗CCR4抗体的一些实施方案中，施用方案将包括以约0.005mg/kg至约10mg/kg的剂量施用抗人CCR4 mAb，其中患者内剂量逐渐上升。在其它递增剂量实施方案中，剂量之间的间隔将逐渐缩短，例如第一和第二剂量之间约30天(±2天)，第二和第三剂量之间约14天(±2天)。在某些实施方案中，对于第二剂量之后的剂量，施用间隔将是约14天(±2天)。在某些实施方案中，对于第二剂量后的剂量，施用间隔为约7天(±2天)。
在一些实施方案中，将向受试者静脉内(IV)输注包含本文所述的任何抗CCR4抗体的药物。
在一些实施方案中，组合治疗中的抗CCR4抗体是KW-0761，其以选自以下的剂量静脉内施用：约0.5mg/kg Q2W,1mg/kg Q2W,2mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg/kg Q2W,1mg/kg Q3W,2mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg/kg Q3W。在一些实施方案中，抗CCR4抗体作为液体药物施用，其包含在pH 4-7的0.1-50mM柠檬酸盐缓冲液中的0.01-150mg/mL KW-0761、10-30mg/mL甘氨酸，并且所选药物剂量通过在约2小时的时间段内溶解在200-250mL盐水中的IV输注来施用。在另一个实施方案中，抗CCR4抗体作为液体药物施用，其包含在pH 5.2-5.8的柠檬酸盐缓冲液中的4mg/mL KW-0761、22.5mg/mL甘氨酸、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所选药物剂量通过在约2小时的时间段内溶解在200-250mL盐水中的IV输注来施用。
在一些实施方案中，组合治疗中的抗CCR4抗体是KW-0761，其在液体药物中以选自下列的剂量施用：0.5mg/kg Q1W,0.5mg/kg Q2W,1mg/kg Q1W,1mg/kg Q2W,2mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg/kg Q2W,1mg/kg Q3W,2mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg/kg Q3W。在一些实施方案中，KW-0761作为液体药物施用，其包含在pH 5.5的10mM组氨酸缓冲液中的25mg/mL KW-0761、7％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所选的药物剂量通过在约30分钟的时间段内静脉内输注来施用。在另一个实施方案中，KW-0761作为液体药物施用，其包含在pH 4-7的0.1-50mM柠檬酸盐缓冲液中的0.01-150mg/mL KW-0761、10-30mg/mL甘氨酸，并且所选择的药物剂量通过在约2小时的时间段内溶解在200-250mL盐水中的IV输注来施用。在另一个实施方案中，KW-0761作为液体药物施用，其包含在pH 5.2-5.8的柠檬酸盐缓冲液中的4mg/mL KW-0761、22.5mg/mL甘氨酸、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所选的药物剂量通过溶解在200-250mL盐水中的IV输注在约2小时的时间段内施用。
在一些实施方案中，组合治疗中的4-1BB激动剂是PF-05082566，其在液体药物中以选自下列的剂量施用：0.24mg/ml Q2W,1.2mg/kg Q2W,2.4mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg Q2W,0.24mg/ml Q3W,1.2mg/kg Q3W,2.4mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg Q3W，包括等效的固定剂量。在一些实施方案中，PF-05082566作为液体药物施用，并且所选剂量的药物通过IV输注在约60分钟的时间段内施用。
KW-0761与PF-05082566组合的最佳剂量可以通过这些药剂中的一种或两种的剂量递增来鉴定。
在一个实施方案中，KW-0761以1.0mg/kg Q2W的起始剂量施用，PF-05082566以0.24mg/kg，0.3mg/kg，0.6mg/kg，1.2mg//kg，2.4mg/kg，5mg/kg，10mg/kg或等效的固定剂量Q4W施用。
在另一个实施方案中，KW-0761以0.5mg/kg Q3W的起始剂量施用，PF-05082566以0.3mg/kg，0.6mg/kg，1.2mg/kg，2.4mg/kg，5mg/kg或10mg/kg的起始剂量Q3W施用。
在另一个实施方案中，PF-05082566以0.3mg/kg Q4W的起始剂量施用，并且KW-0761以1mg/kg Q2W的起始剂量施用，并且如果患者对起始剂量组合不耐受，则KW-0761的剂量减少至0.5mg/kg Q2W和/或PF-05082566的剂量减少至0.3mg/kg Q4W。
在一些实施方案中，以4周的周期施用治疗。在一些实施方案中，在每个周期的第1天每4周(Q4W)施用PF-05082566。在一些实施方案中，PF-05082566作为1小时静脉内(IV)输注施用。在一些实施方案中，PF-05082566的起始剂量为1.2mg/kg。
在一些实施方案中，每周(QW)施用KW-0761进行连续4周(第1、8、15和22天)，随后每两周一次施用(第1和15天)，剂量为1mg/kg。在一些实施方案中，PF-05082566作为1小时IV输注施用。
在一些实施方案中，在其中共同施用药物的每个给药周期的第1天，KW-0761输注在PF-05082566输注完成后30分钟(±10分钟)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前的PK血样后开始。
在一些实施方案中，在第一周期中，每周施用KW-0761作为1小时静脉内输注(即，在第1、8、15、22天)。在另一个实施方案中，从周期2开始，每2周施用KW-0761(即，在每个周期的第1天和第15天)。在一些实施方案中，在第1天，在PF-05082566输注完成后30分钟(±10分钟)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前的药代动力学血样后开始KW-0761输注。
在一些实施方案中，剂量方案是下表3中所示的剂量组合之一。
表3
在一些实施方案中，使用研究药物的治疗持续直到完成24个月的治疗(大约24个周期)、证实的疾病进展、患者拒绝、不可接受的毒性(无论哪个首先发生)，研究可能过早地终止。
在显著毒性的情况下，给药可以延迟和/或减少。在一些实施方案中，剂量修改可以在一个周期内发生。例如，可以中断给药直到足够的恢复，并且如果需要，在给定的治疗周期期间可以减少给药。在另一个实施方案中，可以在周期之间修改给药。例如，当新周期应该开始时，下一周期施用可能由于持续毒性而延迟。在另一个实施方案中，可以在下一个周期中改变给药。例如，在后续周期中可能需要基于先前周期中经历的毒性减少剂量。在一些实施方案中，在所有毒性恢复到本文所述的限度内之后，可以恢复用PF-05082566和/或KW-0761的治疗。
在一些实施方案中，低于前述范围的下限的剂量水平可能是足够的，而在其它情况下，可以使用如本领域技术人员确定的更大的剂量。
在一些实施方案中，治疗周期从组合治疗的第一天开始，持续3周或4周。在共同施用药物的治疗周期的任何一天，KW-0761 IV输注优选在PF-05082566输注完成后30分钟开始。或者，在PF-05082566输注完成后通过IV输注施用KW-0761。本发明还考虑了PF-05082566和KW-0761的同时IV输注。
在一些实施方案中，组合疗法优选在患者实现CR后施用至少12周(3个4周周期或4个3周周期)，更优选至少24周，甚至更优选至少2至4周。
在另一个实施方案中，使用RECIST 1.1版和irRC评估对组合疗法的反应。肿瘤评估将包括所有已知或疑似的疾病部位。在一个实施方案中，成像可包括胸部、腹部和骨盆CT或MRI扫描；脑CT或MRI扫描和骨扫描(如果需要)。在另一个实施方案中，使用造影剂进行CT扫描，除非由于医学原因而禁忌。在另一个实施方案中，用于在基线处表征每个被识别和报告的损伤的相同成像技术用于以下肿瘤评估。在另一个实施方案中，通过在基线处，然后每3个月以及当怀疑有疾病进展(例如，症状恶化)时进行放射学肿瘤评估来评估每8周至多1年的治疗的抗肿瘤活性。在另一个实施方案中，在初始反应后至少4周进行反应确认(CR/PR)。在一些实施方案中，从C1D1开始，用于疾病评估的可允许时间窗口为对于筛选的至多-7天(即，筛选时间窗口为登记之前至多35天)和对于治疗的±7天。在另一个实施方案中，时间选择遵循日历日，并且不应针对周期开始中的延迟进行调整。
在一些实施方案中，选择用本发明的组合疗法治疗的患者已被诊断为晚期实体恶性肿瘤。优选地，患者没有接受晚期肿瘤的先前全身治疗。
本发明还提供了包含如上所述的抗CCR4抗体和药学上可接受的赋形剂的药物。当抗CCR4抗体是生物治疗剂(例如mAb)时，可以使用常规细胞培养和回收/纯化技术在CHO细胞中产生拮抗剂。
在一些实施方案中，包含抗CCR4抗体作为抗CCR4抗体的药物可以作为液体制剂提供或通过在使用前用无菌注射用水重构冻干粉末来制备。在一些实施方案中，在包含约50mg KW-0761的玻璃小瓶中提供包含KW-0761的药物。
本发明还提供了包含4-1BB激发型抗体和药学上可接受的赋形剂的药物。4-1BB激发型抗体可以如美国专利号8,337,850中所述制备。
在一些实施方案中，4-1BB激发型抗体可以以10mg/mL的浓度配制以允许静脉内(IV)。商业制剂可以包含pH5.5的具有α,α-海藻糖二水合物、乙二胺四乙酸二钠二水合物和聚山梨醇酯80的L-组氨酸缓冲液。
本文所述的抗CCR4和4-1BB药物可以作为试剂盒提供，所述试剂盒包括第一容器和第二容器以及包装插页。第一容器含有至少一个剂量的包含抗CCR4抗体的药物，第二容器含有至少一个剂量的包含4-1BB激动剂的药物，以及包装插页或标签(其包括用于使用药物治疗患者的癌症的说明书)。第一和第二容器可以包括相同或不同的形状(例如，小瓶，注射器和瓶)和/或材料(例如塑料或玻璃)。试剂盒可以进一步包含可用于施用药物的其它材料，例如稀释剂，过滤器，IV袋和线，针和注射器。在试剂盒的一些实施方案中，抗CCR4抗体是KW-0761，并且说明书指出，所述药物旨在用于治疗患有对CCR4表达测试为阳性的癌症的患者。
本发明的这些和其它方面，包括下面列出的示例性具体实施方案，根据本文所包含的教导将是明显的。
本发明的示例性具体实施方案
1.一种治疗个体中的癌症的方法，包括向所述个体施用包含抗CCR4抗体和4-1BB激动剂的组合疗法。
2.包含抗CCR4抗体的药物，用于与4-1BB激动剂组合用于治疗个体中的癌症。
3.包含4-1BB激动剂的药物，用于与抗CCR4抗体组合用于治疗个体中的癌症。
4.实施方案3或4的药物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
5.抗CCR4抗体在制备用于当与4-1BB激动剂组合施用时治疗个体中的癌症的药物中的用途。
6.4-1BB激动剂化合物在制备用于当与抗CCR4抗体组合施用时治疗个体中的癌症的药物中的用途。
7.抗CCR4抗体和4-1BB激动剂在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途。
8.一种试剂盒，其包括第一容器、第二容器和包装插页，其中所述第一容器包含至少一个剂量的包含抗CCR4抗体的药物，所述第二容器包含至少一个剂量的包含4-1BB激动剂的药物，并且所述包装插页包含用于使用所述药物治疗个体的癌症的说明书。
9.根据实施方案8所述的试剂盒，其中所述说明书指出，所述药物旨在用于治疗具有对CCR4表达测试为阳性(通过例如免疫组织化学(IHC)测定)的癌症的个体。
10.实施方案1至9中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述个体是人，并且所述抗CCR4抗体是特异性结合人CCR4并耗竭CD4+细胞的单克隆抗体。
11.实施方案9的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗CCR4抗体是KW-0761或huCCR4。
12.实施方案1至9中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述个体是人，并且所述抗CCR4抗体是特异性结合人CCR4的单克隆抗体。
13.实施方案12的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗CCR4抗体耗竭CD4+细胞。
14.实施方案13的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO：1、2和3的轻链CDR和SEQ ID NO：4、5和6的重链CDR；或(b)SEQ ID NO：7、8和9的轻链CDR和SEQ ID NO：10、11和12的重链CDR。
15.实施方案13的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：7、8和9的轻链CDR和SEQ ID NO：10，11和12的重链CDR。
16.实施方案13的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗CCR4抗体包含重链和轻链，并且其中所述重链包含SEQ ID NO：15，所述轻链包含SEQ ID NO：16。
17.实施方案13的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗CCR4抗体包含重链和轻链可变区，并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：17，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：18。
18.实施方案10-17中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是实体瘤。
19.实施方案10-17中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是膀胱癌，乳腺癌，透明细胞肾癌，头/颈鳞状细胞癌，直肠癌，肺鳞状细胞癌，恶性黑素瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾细胞癌，小细胞肺癌(SCLC)或三阴性乳腺癌。
20.实施方案10-17中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述个体先前未曾针对晚期实体恶性肿瘤进行治疗。
21.实施方案10-17中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述癌症是急性成淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性髓性白血病(CML)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，滤泡性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(HL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，多发性骨髓瘤(MM)，骨髓细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)，骨髓增生异常综合征(MDS)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
22.实施方案10-21中任一个的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述4-1BB激动剂是单克隆抗体，其包含分别地SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的重链和轻链可变区。
23.实施方案10-21的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述4-1BB激动剂是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO：30、31和32的轻链CDR和SEQ ID NO：27、28和29的重链CDR。
24.实施方案10-21的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述4-1BB激动剂是包含重链和轻链的单克隆抗体，并且其中所述重链包含SEQ ID NO：21，轻链包含SEQ ID NO：22。
25.实施方案10-22中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，所述癌症对人CCR4测试为阳性。
26.实施方案23的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述人CCR4表达升高。
27.实施方案14的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗CCR4抗体是KW-0761或huCCR4。
28.实施方案25的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述KW-0761配制为液体药物，其包含在pH 5.2-5.8的柠檬酸盐缓冲液中的4mg/mL抗CCR4抗体，22.5mg/mL甘氨酸，0.02％(w/v)聚山梨醇酯80。
29.实施方案1至26中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述4-1BB激动剂是PF-05082566。
30.实施方案1至26中任一项的方法、药物、用途或试剂盒，其中所述抗CCR4抗体以约0.5、1、2、3、5或10mg/kg的剂量施用。
31.实施方案1至26中任一项的试剂盒的方法、药物、用途，其中所述抗CCR4抗体是KW-0761，所述4-1BB激动剂是PF-05082566，所述个体被诊断患有晚期恶性实体瘤，并且抗CCR4抗体和4-1BB激动剂的剂量选自下表中的组合之一：
表4
一般方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&1989第2版,2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)中。标准方法也出现在Ausbel,等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述了在细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)，在哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)，糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
描述了蛋白质纯化方法，包括免疫沉淀，层析，电泳，离心和结晶(Coligan,等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析，化学修饰，翻译后修饰，融合蛋白的产生，蛋白质的糖基化(参见例如Coligan,等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel,等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化(Coligan,等人(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow and Lane，同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的(参见例如Coligan,等人(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。
可以制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见例如Sheperd and Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann and Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow and Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter,等人(2000)J.Immunol.165:6205；He,等人(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；Foote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利号6、329、511)。
人源化的替代方案是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或在转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1:837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom and Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等人(2001)Phage Display:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
抗原的纯化对于产生抗体不是必需的。可以用携带目标抗原的细胞免疫动物。然后可以从免疫的动物中分离脾细胞，并且脾细胞可以与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见例如Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290；Wright等人(2000)Immunity 13:233-242；Preston等人,同上；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
抗体可以缀合至例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其它目的，并且包括偶联至例如染料、放射性同位素、酶或金属(例如胶体金)的抗体(参见例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing and Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。
用于流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选(FACS)，是可获得的(参见例如Owens,等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,2nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。适用于修饰用于例如作为诊断试剂的核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体的荧光试剂是可获得的(Molecular Probesy(2003)Catalog，Molecular Probes，Inc.，Eugene，-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO)。
描述了免疫系统的标准组织学方法(参见例如Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt,等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis,等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可获得的(参见例如GenBank,VectorSuite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne,等人(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne,等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren,等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
实施例
实施例1.组合治疗
本实施例举例说明了CD4+T细胞耗竭对4-1BB激发型抗体在动物癌症模型中的抗肿瘤活性的影响。
为了评价组合免疫治疗对建立的B16F10肿瘤的抗肿瘤功效，基于在CT26模型中显示功效的先前研究选择抗4-1BB给药方案(Escuin-Ordinas等人，J Immunother Cancer，2013；1：14)和如先前报道选择抗PD-1和抗LAG-3给药方案(Woo等人，Cancer Research，2012；72：917-27；Curran等人，PloS One.2011；6：e19499)。与公开的结果一致，当这些单一药剂治疗在50-154mm3大小的肿瘤中开始时，单独的抗4-1BB、抗PD-1或抗LAG-3不能一致地抑制B16F10肿瘤生长(数据未显示)。组合抗PD-1与抗LAG-3相对于同种型对照导致54％的肿瘤生长抑制(TGI)(p<0.001)，尽管在该治疗后没有小鼠是无肿瘤的。相比之下，当动物同时施用抗4-1BB和抗PD-1抗体时，相对于同种型对照，产生85％TGI的显著效力(p<0.0001)，并且10只治疗的动物中有7只无肿瘤(数据未显示)。这种显著的组合效力是可重复的：在不同实验者的独立研究(肿瘤大小在64-209mm3之间)中，组合治疗组中的平均肿瘤负荷降低，2/10只动物完全无肿瘤，4/10只动物在研究结束时具有正在进行的部分消退(数据未显示)。此外，当对非常大的肿瘤(大小在126-350mm3之间)进行治疗时，仅观察到抗4-1BB/抗PD-1组合的显著TGI(相对于对照组为51％，p<0.0001)，而抗PD-1/抗LAG-3组合无效(数据未显示)。
同样，在MC38结肠癌模型中观察到抗4-1BB/抗PD-1组合的强健抗肿瘤效果(数据未显示)。在研究结束时(肿瘤植入后第21天)，组合治疗的TGI相对于PBS对照为63％。当与单一试剂单独治疗相比时，抑制也是显著的(p<0.05相对于单独的抗4-1BB，和p<0.001相对于单独的抗-PD-1)。
为了测定抗4-1BB/抗-PD-1组合治疗所需的免疫细胞亚群，使用抗体同时耗竭具有B16F10的小鼠中的CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+和CD8+T细胞。在第0天，将C57BL/6小鼠皮下接种1×106B16F10。将小鼠随机分成每组10只动物的组，平均肿瘤体积为约80mm3(第10天)。如先前所述(Butler等，Nature Immunology，2012；13：188-95)，具有B16F10的小鼠接受抗CD4(GK1.5，BioXcell)和/或抗CD8(53.5.8，BioXcell)。简言之，在第11、16和21天腹膜内施用一百(100)μg同种型对照IgG或抗CD4和/或抗CD8mAb。在第12、17和22天给予抗4-1BB(1mg/kg)/抗PD-1(10mg/kg)mAb。每周2-3次测量肿瘤尺寸。
比较抗4-1BB激发型抗体+抗-PD-1拮抗型抗体组合治疗后的肿瘤生长(图9)。每个治疗组的平均值±SEM显示于图9中。在不存在CD8+T细胞时，肿瘤抑制完全消除。有趣的是，CD4+T细胞的耗竭导致增强的抗肿瘤活性(p<0.05，相对于抗4-1BB/抗PD-1组)。这些数据表明Treg细胞耗竭增强4-1BB激动剂的抗肿瘤活性。
在单独的实验中，评估了在CT26结肠肿瘤模型中CD4+T细胞耗尽对抗4-1BB/抗PD-1组合治疗的影响(图10)。在不存在CD8+T细胞的情况下，肿瘤抑制被完全消除。如在B16黑素瘤模型中的，CD4+T细胞的耗竭导致增强的抗肿瘤活性。
这些结果证明4-1BB激发型抗体的抗肿瘤活性可以通过肿瘤模型中Treg细胞或CD4+T细胞的耗竭来增强。
材料和方法
小鼠。6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠购自The Jackson Laboratories。根据由Institutional Animal Care and Use Committee of Rinat,South San Francisco和Worldwide Research and Development(WRD),La Jolla,Pfizer Inc.批准的方案批准的方案维持小鼠和进行所有动物实验。
细胞系。B16F10黑素瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。MC38结肠癌细胞系由UCLA,Los Angeles,California的Antoni Ribas博士友情提供。在37℃，在5％CO2的空气氛围中，在补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养细胞，并在Research Animal Diagnostic Laboratory(RADIL)(Columbia，MO)进行测试病原体的IMPACT。收获在指数生长期生长的无病原体细胞并用于肿瘤接种。
用于免疫治疗和流式细胞术的抗体。治疗性大鼠抗小鼠4-1BB mAb(克隆MAB9371)购自R&D systems。大鼠抗小鼠PD-1mAb(克隆RMP1-14)和大鼠IgG2a同种型对照购自BioXcell。大鼠抗小鼠LAG-3 mAb(克隆eBioC9B7W)购自eBioscience。
用于细胞表面或细胞内染色的单克隆抗体购自BD Biosciences或eBioscience。用于表征T细胞的单克隆抗体是仓鼠抗小鼠CD3ε-Alexa Fluor 488(克隆145-2C11)，大鼠抗小鼠CD4-PerCP-Cy5.5(克隆RM4-5)，大鼠抗小鼠CD8α-APC-H7(克隆53-6.7)，大鼠抗小鼠CD25-BD Horizon V450(克隆PC61)，仓鼠抗小鼠CD137(4-1BB)-APC(克隆17B5)，仓鼠抗小鼠CD279(PD-1)-BD Horizon PE-CF594(克隆J43)，大鼠抗小鼠FoxP3-Alexa Fluor 700(克隆FJK-16s)，大鼠抗小鼠Eomes-PE(克隆：Dan11mag)，仓鼠抗小鼠KLRG1-PerCP-Cy5.5(克隆2F1)和大鼠抗小鼠NK-1.1-PE-Cy7(克隆PK136)。对于MDSC表征，mAb是大鼠抗小鼠CD45-APC-Cy7(克隆30-F11)，大鼠抗小鼠CD11b-Alexa Fluor 488(克隆M1/70)，大鼠抗小鼠Ly-6G(Gr-1)-PerCP-花青5.5(克隆RB6-8C5)和大鼠抗小鼠F4/80-PE(克隆BM8)。使用LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain试剂盒(Invitrogen)将活细胞与死细胞分离。
使用流式细胞术的免疫细胞分型。收获来自荷瘤小鼠的脾，并在冰冷的PBS中机械解离为单细胞悬浮液。脾细胞用红血细胞裂解缓冲液Hybri-Max(Sigma-Aldrich)处理以除去红血细胞，用PBS洗涤两次，并重悬浮于补充有2％FBS和0.9％NaN3的PBS中。将～1×106个脾细胞的等分试样与10μg/mL的小鼠BD Fc Block(BD Biosciences)预温育10分钟，之后加入分型mAb混合物以特异性染色免疫细胞。
使用小鼠肿瘤解离试剂盒和GentleMACS Dissociator根据制造商的说明(Miltenyi Biotec)制备肿瘤浸润淋巴细胞。
通过在4℃孵育细胞30分钟来标记细胞表面抗原。使用根据制造商的方案(eBioscience)设定的FoxP3/转录因子染色缓冲液进行细胞内染色。使用LSR Fortessa(BD Biosciences)获得流式细胞术数据并使用FlowJo(TreeStar Inc.)分析。
体内肿瘤功效研究。C57BL/6小鼠在右侧皮下接种在0.1ml无血清DMEM培养基或PBS中的1×106个B16F10或MC38细胞。当肿瘤达到50-154mm3的尺寸时开始治疗。单独或组合的针对4-1BB(1mg/kg)、PD-1(10mg/kg)和LAG-3(10mg/kg)的抗体腹膜内(i.p.)施用两次，间隔5天。在治疗较大肿瘤(范围为126-350mm3)的研究中，腹膜内给予抗体四次，间隔为3天。使用测径器在二维中测量肿瘤大小，并且使用下式以mm3表示体积：V＝0.5L×W2其中L和W分别是肿瘤的长径和短径。
实施例2.基因表达分析：在人肿瘤中分析与FOXP3 mRNA相关的人基因
本实施例举例说明人肿瘤中CCR4 mRNA与FOXP3 mRNA的相关性。
分析来自癌症基因组集(TCGA)的RNA-Seq数据以鉴定人肿瘤中人基因和FOXP3 mRNA之间的相关性。下表5提供了人基因的列表，其按照在三种肿瘤类型中其与FOXP3 mRNA(肿瘤RNAseq数据)的平均相关系数的顺序列出。更高的相关系数值表明在耗竭Treg中潜在更高的功效。黑体表示的基因是与活化的Treg细胞相关的公知基因。
基于来自TCGA的跨多个实体肿瘤RNA-Seq数据的与FOXP3的相关性分析，CCR4被鉴定为用于耗竭Treg细胞的有吸引力的靶标。CCR4在HNSC肿瘤、结肠肿瘤和直肠肿瘤中分别具有0.857、0.837和0.856的相对高的FOXP3相关系数值(表5)。在本研究中鉴定的用于耗竭Treg细胞的其它靶包括：CCR8,ICOS,TIGIT,CD4,CD28,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB,CD137),CYBB和CTLA4。
表5
实施例3.基因表达分析：适用于抗CCR4抗体的治疗的癌症类型的鉴定
本实施例举例说明了人类肿瘤中人基因mRNA和FOXP3 mRNA的相关性。
分析来自癌症基因组集(TCGA)的RNA-Seq数据以鉴定人肿瘤中CCR4 mRNA与FOXP3 mRNA以及CTLA4 mRNA与FOXP3 mRNA之间的相关性。下表6提供了在TCGA中可获得的所有肿瘤类型中的相关系数。
基于该分析，指示用抗CCR4抗体和4-1BB激动剂治疗的癌症类型包括：头/颈鳞状细胞癌，直肠癌，结肠癌，鳞状细胞肺癌，甲状腺癌，膀胱癌，黑素瘤，宫颈癌，前列腺癌，乳腺癌，子宫/子宫内膜癌，胰腺癌，肺腺癌，卵巢癌和乳头状肾癌。
表6
实施例4.将抗CCR4抗体和4-1BB激动剂并行施用至荷瘤小鼠。
本实施例举例说明在动物癌症模型中与4-1BB激动剂组合的抗CCR4抗体治疗。
在一项研究中，C57BL6小鼠皮下植入1×106个MC38鼠结肠癌细胞。监测肿瘤生长，当肿瘤达到150mm3的平均大小将动物随机化至4个8只动物的组，并且腹膜内给予同种型对照、1mg/kg大鼠抗小鼠4-1BB激发型单克隆抗体(R&D Systems#MAB9371)、10mg/kg抗小鼠CCR4抗体或两者的同时组合，每5天一次，共两次剂量。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并且使用下式以mm3表示体积：V＝0.5L×W2其中L和W分别是肿瘤的长径和短径。当对照的肿瘤大小达到1000mm3时，终止研究。通过比较用4-1BB激发型单克隆抗体、抗小鼠CCR4抗体或两者的同时组合治疗的动物来评价组合治疗的功效。
实施例5.优先指示：追求患者选择策略
本实施例举例说明了用于抗CCR4抗体/4-1BB激动剂组合治疗的患者选择的策略。
抗CCR4治疗耗竭抑制抗肿瘤反应的Treg。4-1BB扩大抗肿瘤T细胞活性。基于上述实施例1证明的效果，抗CCR4抗体与4-1BB激动剂组合将导致比单一药剂更强的反应。
这些研究优先考虑具有高Treg(FOXP3+)含量的肿瘤。通过在配对的给药前和给药后新鲜活检中评估肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来选择患者。进行免疫组织化学分析以确定肿瘤浸润性T细胞位置和活化状态。在基线和治疗后评估4-1BB/CCR4比率。平行评估CD4、CD8、FoxP3、PD-1和PD-L1。
表7提供了序列表中的序列的简要描述。
表7
实施例6.组合治疗
本实施例举例说明了使用抗CCR4抗体/4-1BB激动剂的组合治疗。
在每个周期的第1天，PF-05082566将作为1小时静脉内(IV)输注每4周(Q4W)施用。PF-05082566的起始剂量为1.2mg/kg。
KW-0761将作为1小时IV输注每周(QW)施用，进行连续4周(第1、8、15和22天)，随后每两周一次给药(第1和15天)，剂量为1mg/kg。
在其中共同施用药物的每个给药周期的第1天，KW-0761输注将在PF-05082566输注完成后30分钟(±10分钟)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前PK血液样品后开始。
本文引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被具体地和单独地指明通过引用并入。根据37C.F.R.§1.57(b)(1)，申请人旨在将此通过引用并入的声明涉及每一个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，其每一个都按照37C.F.R.§1.57(b)(2)清楚指出，即使这种引用与通过引用并入的专门声明不直接相邻。在说明书中包括通过引用并入的专门声明(如果有的话)不以任何方式削弱通过引用并入的该一般声明。本文引用的参考文献不意在承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。
序列
<110> PFIZER INC.
KYOWA HAKKO KIRIN, CO., LTD.
<120> 用于治疗癌症的抗CCR4抗体和4-1BB激动剂的组合
<130> PC72128A
<150> 62/001,534
<151> 2014-05-21
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
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130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 21
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 22
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
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Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
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Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
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100 105 110
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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210
<210> 25
<211> 360
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr
1 5 10 15
Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu
20 25 30
Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu
35 40 45
Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu
50 55 60
Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly
85 90 95
Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met
100 105 110
Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val
115 120 125
Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe
130 135 140
Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala
145 150 155 160
Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser
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Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile
195 200 205
Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met
210 215 220
Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala
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Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr
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Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val
260 265 270
Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala
275 280 285
Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr
290 295 300
Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys
305 310 315 320
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Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met
340 345 350
Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu
355 360
<210> 26
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
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20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
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Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 27
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 27
Ser Thr Tyr Trp Ile Ser
1 5
<210> 28
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 28
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1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>29
Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 30
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 31
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 32
Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val
1 5 10
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