抗CD1d的抗体的制作方法

抗CD1d的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供结合CD1d的分离的抗体或其抗原结合部分。这些抗体及其抗原结合部分具有在治疗涉及NKT细胞效应子功能的病况中的应用。
【专利说明】抗CD1d的抗体
[0001] 提交数据
[0002] 本申请与2011年10月14日提交的澳大利亚专利申请号2011904190和2011年 10月14日提交的美国专利申请号61/547, 307相关并要求其优先权，这些申请各自的全部 内容经此引用并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及结合⑶Id并抑制⑶Id介导的生物学功能(例如活化⑶Id限制性T细 胞、自然杀伤T (NKT)细胞）的抗体。
[0004] 发明背景
[0005] 按照字母顺序在说明书结尾处收集了作者在本说明书中提及的出版物的书目细 节。
[0006] 在本说明书中提及任何现有技术不被也不应视为是承认或以任何形式暗示现有 技术在任何国家构成公知常识的一部分。
[0007] CDld是对触发细胞群体(例如NKT细胞）以释放高水平的细胞因子(与某些炎性疾 病相关的活性）必不可少的反受体。因此阻断CDld介导的作用具有潜在的治疗益处。
[0008] ⑶Id蛋白质显示于许多抗原呈递细胞（APC)亚群上,包括朗氏细胞(皮肤中的主 要树突状抗原呈递细胞)、活化B细胞、淋巴结中的树突细胞、活化的血单核细胞。经CDld刺 激的一个细胞群体是NKT细胞--与多种通常与NK细胞相关的分子标记物例如CD161和 NKG2D-起表达alpha/beta (α β)Τ细胞受体（TCR)的T细胞亚群。抗原呈递细胞（APC) 经⑶Id呈递脂质或糖脂刺激ΝΚΤ细胞。大多数人⑶Id限制性ΝΚΤ细胞表达包含与νβ 11 配对的 Va 24Ja 18 的半不变 TCR (Brigl, Μ 等人，2004Annu. Rev. Immunol. , 22:817-890)。 ⑶ld-TCR相互作用快速诱导许多Thl-或Th2-样细胞因子，例如干扰素（IFN) - γ和肿瘤 坏死因子（TNF)-a，以及白细胞介素（IL)-4、IL-5和IL-13。已知Thl/Th2细胞因子响应 的平衡在编排免疫反应性质方面起重要的作用。
[0009] 迄今已经在人体内识别了五种⑶1基因：⑶la、⑶lb、⑶lc、⑶Id和⑶le。⑶1蛋 白被表达为与β2-微球蛋白（β2Μ)非共价相关的大的亚单位(重链）（Van Agthoven，A. 和 Terhorst，C·，1982J. Immunol. 128:426-432 ;Terhorst，C.等人，1981Cell23:771-780)。 ⑶Id的胞外域由三个域组成：α 1域(残基20-108)、α 2域(残基109-201)和α 3域(残基 202-295) (Pellicci，D.G.等人，2009Immunity31:47-59)。
[0010] 多种具有不同结构的脂质已经显示：以在⑶Id分子的两个疏水性结合口袋（A' 和F)各个中提供脂肪酸链的独特方式结合CDld分子。能够结合CDld分子的脂质物类包 括分枝菌酸类、二酰甘油类、鞘脂类、类聚异戊二烯类、脂肽类、phosphomycoketides和小 的疏水性化合物（Venkataswamy, Μ· M.和 Porcelli, S. A.，201 OSeminTmmunol 22:68-78)。 用于研究体内和体外的NKT细胞激活的原型化合物是KRN7000，一种衍生自海绵 Agelasmauritianus的α -半乳糖苷神经酰胺(" a GalCer")。附加的激动剂包括但不限 于异球三己糖基神经酰胺（"iGb3")，据报道其是内源性鞘糖脂，以及一类衍生自微生物 的α-葡糖醒酸基神经酰胺（glycuronosylceramides)的成员与多种人类糖脂如溶血磷 脂醜胆喊（lysophophatidylcholine)和溶鞘憐脂（lysosphingomyelin) (Fox，L.M.等 人，2009Plos Bi〇17:el000228)。某些天然存在的β-连接的糖鞘脂例如β-D-吡喃葡 萄糖基神经酰胺的C24:1形式也是ΝΚΤ细胞的弱激动剂（Brennan，P. J.等人，201 INat Immunol12:1202-1211)。
[0011] ΝΚΤ细胞过度产生细胞因子可能会贡献于某些自身免疫性或炎性疾病的病理，例 如重症肌无力（Reinhardt, C.等人，1999Neurology52:1485-87)、牛皮癣（Bonish, Β. D.等 人，2000J. Immunol. 165:4076-85)、溃瘍性结肠炎（Saubermann, L. J.等人，2000Gastroen terologyll9:119-128)、原发性胆汁性肝硬变（Kita, Η·等人，2002Gastroenterologyl23 :1031-43)、结肠炎（Heller, F.等人，2002Immunityl7, 629-638)、脂肪性肝炎（Syn，W.等 人，（2010) Hepatology, 51 (6) : 1998-2007)、自身免疫性肝炎（Santodomingo-Garzon，T.和 Swain，M.G. (2011)Autoimmunity Reviewsl0:793_800)、动脉粥样硬化（Kyriakakis，E.等 人，EurJImmunol201040:3268-79)或与镰状细胞病相关的肺部炎症或机能障碍（Wallace 等人，2009Bloodll4:667-676)。越来越多的证据表明ΝΚΤ细胞在哮喘中施加了有害影响 (Iwamura，C.和 Nakayama，Τ.，2010Curr0pinImmunol22:807-13)。
[0012] 哮喘是慢性炎性肺疾病，其特征是慢性局部炎症引起的可逆的气道阻塞、粘 液阻塞和响应于非特异性刺激的支气管痉挛（Murdoch, J. R.和Lloyd, C. M. 20lOMutat Res690:24-39)。高哮喘患病率，越来越高的发病率和庞大的相关医疗保健开支使哮喘 成为主要公共卫生问题（Holgate，S.T.和 Polosa，R.2008Nat Rev Immunol8:218_30; Bahadori，K.，Doyle_WatersM.M·等人，2009BMC Pulm Med9:24)。在患有严重形式的哮喘， 例如皮质类固醇难治性哮喘的患者的治疗方面存在显著的未满足的医疗需求。患有严重哮 喘的患者不能对标准治疗产生响应，并占全部哮喘人群的约5-10%。这仅在美国就包括约 850, 000例患者。
[0013] 在过敏性哮喘的小鼠模型中，NKT细胞已经显示使疾病加重（Akbari，0.等 人，2003NatMed9:582-8)。NKT细胞可以被CDld限制性糖脂抗原激活并释放细胞因子例如 IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13,这些细胞因子激活在哮喘中重要的嗜酸性粒细胞和其它细胞 亚群（Chuang，Y.H.等人，2011J Immunoll86:4687-92)。通过针对 NKT 细胞，施用抗-CDld 抗体或⑶Id-依赖性拮抗剂在实验中抑制了诱发的气道炎症（LiSb〇nne，M.等人，2003J Immunoll71:1637-41 ;Pichavant，M.等人，2008JExpMed, 205:385-93)。NKT 细胞在哮喘 的非人类灵长类动物模型中是也有害的（Matangkasombut,P.等，2008J Allergy Clin Immun〇1121:1287-9)。这样的结果表明，肺中存在的低数量NKT细胞对人哮喘的发展和延 续非常重要。
[0014] 非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD)是其中过量脂肪堆积在无酗酒史的患者体内的一种 病况。NAFLD分为单纯性脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎（NASH)。在NASH中，存在脂肪变 性、小叶内炎症和肝细胞气球样，通常伴随着进行性纤维化。长期NASH会发展为肝硬化，并 且肝细胞癌（HCC)可能是一种结果。NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏表现。NAFLD在近数 十年来已经与增加流行的肥胖、2型糖尿病与高脂血症一起在世界范围内增力口。NAFLD/NASH 目前被认为是世界范围内最常见的慢性肝病。据估计，全部成年人的约20%患有NAFLD，而 2-3%的成年人患有NASH。非酒精性脂肪肝疾病是慢性肝病的主要原因。其涵盖组织病理 学的范围，包括肝脂肪变性(脂肪肝）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH)。
[0015] 肝脏包含可以调节先天性免疫应答的NKT细胞定居群体。例如，含有不变的T细 胞受体的NKT细胞，其包含小鼠肝脏中最多20%的T细胞。此类细胞也富集在包含更多样 化的NKT细胞的组成部分的人肝脏中（最多10%的T细胞)。在这两种物种体内，NKT细胞主 要存在于肝窦状隙中，在这里它们提供血管内的免疫监视。NKT细胞特异性地识别糖脂抗原 并可以在激活时产生细胞因子。该细胞亚群可能贡献于NASH的发病机理(参见例如Syn，W. 等人，（2010)Η印atology，51 (6) : 1998-2007)。因此，输送在体内阻断NKT细胞的功能的抗 ⑶Id抗体可以具有治疗益处。
[0016] 自身免疫性肝病的三个主要大类是自身免疫性肝炎（AIH)、原发性胆汁性肝硬变 (PBC)和原发性硬化性胆管炎（PSC)。这些疾病各自具有相对独特的临床、血清学和组织 学表现。这三种肝病在肝损伤的病理组织学形态方面也各不相同。AIH的特征在于肝实质 的进行性破坏，称为界面性肝炎。另一方面，PBC的特征在于小肝内胆管的特异性破坏，而 PSC主要涉及大胆管的破坏。尽管这些病况的表现不同，所有这些自身免疫性肝疾病共享 涉及T淋巴细胞(其识别和摧毁干细胞）的肝复原的免疫介导肝损伤的共同径路，并最终发 展为肝纤维化。NKT细胞可能有助于自身免疫性肝病的病理（Santodomingo_Garzon，T.和 Swain, M. G. (2011)AutoimmunityReviewsl0:793-800)。激活的 NKT 细胞可以直接通过上调 细胞表面FasL表达和/或释放肿瘤坏死因子-a (TNF- α )与穿孔素/粒酶B诱导肝细胞 死亡。ΝΚΤ细胞可以通过释放促炎细胞因子例如IFN-γ间接诱导肝细胞死亡。ΝΚΤ细胞还 可以产生IL-4,其诱导Th2响应和随后的由浆细胞产生自身抗体。由于ΝΚΤ细胞的活化会 导致肝细胞破坏并最终导致肝硬化的发展。通过输送抗⑶Id抗体阻断NKT细胞功能可因 此具有治疗益处。除了细胞因子释放外，导致细胞溶解的NKT效应细胞功能,例如穿孔素释 放和粒酶释放以及Fas介导的细胞死亡，以及其它已知的NKT功能例如IL-2介导的旁观者 效应可能也与涉及NKT细胞的病况相关。阻断NKT细胞活化剂⑶ld，例如通过施用抗⑶Id 抗体，也可以调节这些NKT效应子功能。
[0017] 发明概述
[0018] 迫切需要抑制CDld介导的细胞活化并随后表现出在治疗炎性疾病(例如严重的 皮质类固醇难治性哮喘）中的益处的疗法。完全人抗体具有实现开发提高治疗效果的人用 药物的目的的多个优点。它们可以靶向结合高度有效的中和表位并在施用于人类时耐受良 好。虽然已经在现有技术中描述了结合CDld并与其反应的小鼠抗体，本发明描述了在抑制 CDld介导的NKT细胞活化和所得效应子功能方面表现出强大效力的人抗体。令人惊讶地， 在某些情况下，这些抗体的效力比现有技术抗体的当前状态高几个数量级。具有显著提高 的效力的此类抗体应当能够治疗CDld-介导的疾病，并应表现出优异的临床疗效。
[0019] 因此，在第一方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分， 其中该分离的抗体或其抗原结合部分与选自401. 11和402. 8的至少一种抗体竞争与CDld 的结合。
[0020] 在第二方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分结合与选自401. 11和402. 8的至少一种抗体所结合的表位 相同的表位。
[0021] 在第三方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含具有选自SEQ ID N01、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、 40、41、42、43、44和45的序列和至少95%与之相同的序列的VH域。
[0022] 在第四方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含具有选自SEQ ID勵2、4、6、46、49和62的序列和至少 95%与之相同的序列的VL域。
[0023] 在第五方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含VH域，该VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID NO:125)。
[0024] 在第六方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含VH域，该VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID NO:136)。
[0025] 在第七方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含VL域，该VL域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列 与 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 RASQHISSWLA (SEQ ID N0:141)或 ASSSGAVSSGNFPN (SEQ ID N0:142)〇
[0026] 在第八方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分结合具有如使用基于细胞的效价测定测得的小于20ng/ml 的EC50的CDld。在一个实施方案中，该分离的抗体或其抗原结合部分结合具有0. 5ng/ml 至 20ng/ml 的 EC50 的人 CDld。
[0027] 在第九方面中，本发明提供分离的DNA分子，其编码本发明的分离的抗体或其抗 原结合部分。
[0028] 在第十方面中，本发明提供在人类对象中治疗涉及NKT细胞效应子功能的病况的 方法，包括向该对象施用本发明的抗体或其抗原结合部分。
[0029] 在第^^一方面中，本发明提供检测样品中存在CDld的方法，该方法包括使怀疑含 有CDld的样品与本发明的分离的抗体或其抗原结合部分在允许该抗体或其抗原结合部分 结合CDld的条件下接触以形成复合物并检测样品中该复合物的存在。
[0030] 在第十二方面中，本发明提供检测细胞样品中CDld阳性细胞的存在的方法，该方 法包括将细胞群体与本发明的分离的抗体或其抗原结合部分接触以允许该抗体或其抗原 结合部分结合CDld阳性以形成复合物并检测该抗体或其抗原结合部分-细胞复合物的存 在。
[0031] 在第十三方面中，本发明提供从多种CDld结合蛋白中选择特异性地结合人CDld 并与选自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一种抗体竞争在⑶Id上的结合的⑶Id结合 蛋白的方法，该方法包括：
[0032] 在足以允许⑶Id结合蛋白结合该突变蛋白以形成⑶Id结合蛋白-人⑶Id突变 蛋白复合物和排除的多种没有结合该人CDld突变蛋白的CDld结合蛋白的条件下，使多种 ⑶Id结合蛋白接触人⑶Id突变蛋白，在所述人⑶Id突变蛋白中SEQ ID N0:116的氨基酸 位置87至93和141-143已经被这些位置处的相应的小鼠氨基酸取代，并且
[0033] 从排除的多种CD 1 d结合蛋白中收集没有结合人CD Id突变蛋白的CD Id结合蛋白，
[0034] 其中收集的⑶Id结合蛋白特异性地结合人⑶Id并与选自401. 1U402.8和 401. 11. 158的至少一种抗体竞争在⑶Id上的结合。
[0035] 在第十四方面中，本发明提供从多种CDld结合蛋白中选择特异性地结合人CDld 的CDld结合蛋白的方法，该方法包括：
[0036] 在足以允许⑶Id结合蛋白结合h⑶ldmu以形成⑶Id结合蛋白-h⑶ldmu复合物 和排除的多种没有结合hCDldmu的CDld结合蛋白的条件下，使多种CDld结合蛋白接触其 中位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143处的氨基酸已经被这些位置 处的相应小鼠序列替代的h⑶ldmu(SEQIDN0 :119)，并且
[0037] 从排除的多种⑶Id结合蛋白中收集没有结合h⑶ldmu的⑶Id结合蛋白，
[0038] 其中收集的⑶Id结合蛋白特异性地结合人⑶Id (SEQ ID N0:116)或mCDldhu (SEQ ID N0:118)〇
[0039] 在任意上述方面的的一个实施方案中，该分离的抗体或其抗原结合部分还结合食 蟹猴和猕猴⑶Id。
[0040] 附图简述
[0041] 图1 :证明通过抗⑶Id抗体抑制四聚体结合的测定结果的图示。在使用α-半乳 糖苷神经酰胺（a -GalCer)脂质装载的CDld四聚体(其结合用ΝΚΤ细胞受体稳定转染的 J. RT3-T3. 5细胞）的测定中，由信号平均荧光强度降低，抗⑶Id抗体401. 11和402. 8与抗 体42和51. 1相比显示出提高的对CDld四聚体结合的抑制。不相关的特异性阴性对照物 没有显示出抑制。表2列举了所有受试抗体的EC50值。
[0042] 图2:证明通过抗⑶Id抗体抑制IL-2释放的测定结果的图示。在使用 a -GalCer-装载的CDld-阳性U-937细胞和NKT细胞受体稳定转染的J. RT3-T3. 5细胞的 测定中，如通过ELISA测定的那样，抗CDld抗体402. 8和401. 11与抗CDld抗体42和51. 1 相比在24小时后显示出提高的IL-2释放的抑制。在所有测定中，不相关的特异性阴性对 照物抗体没有显示出对IL-2释放的抑制。表3中提出了来自代表性试验的EC50值。
[0043] 图3 :通过流式细胞计量术证明抗⑶Id抗体结合初生外周血单个核细胞（PBMC)的 测定结果的图示。如通过流式细胞术测定的那样，作为本说明书中所述抗体实例而非不相 关的特异性对照物抗体的抗⑶Id抗体402. 8结合初生人PBMC中的⑶Id-阳性、⑶11c-阳 性群体。
[0044] 图4 :在使用THP-1细胞系作为抗原呈递细胞的基于初生NKT细胞的测定中证明 通过抗CDld抗体抑制初生NKT细胞功能的测定结果的图示。如通过ELISA测定的那样，与 抗⑶Id抗体42相比，抗体401. 11和402. 8分别表现出高达114倍和高达180倍的24小 时后的IFN-γ (A)、IL-4 (B)、IL-5 (C)和IL-13 (D)释放的提高的抑制。该结果来自于 使用a -GalCer-扩增的NKT细胞和a -GalCer-装载的THP-1细胞作为CDld阳性细胞的 测定。在所有测定中，不相关的特异性阴性对照物抗体没有抑制细胞因子释放。表4中给 出了来自代表性试验的EC50值。
[0045] 图5 :在使用初生⑶14+单核细胞作为抗原呈递细胞的基于初生NKT细胞的测定 中证明通过抗⑶Id抗体抑制初生NKT细胞功能的测定结果的图示。在使用a-GalCer-扩 增的NKT细胞和a -GalCer-装载的⑶14+单核细胞-衍生树突细胞作为⑶Id阳性细胞的 测定中，如通过ELISA测定的那样，与抗⑶Id抗体42和51. 1相比，抗体401. 11和402. 8证 实了在24小时后显著提高的IFN-γ (A)、IL-4 (B)、IL-5 (C)和IL-13 (D)释放的抑制。 在所有测定中，不相关的特异性阴性对照物抗体没有抑制细胞因子释放。表5中给出了来 自代表性试验的EC50值。
[0046] 图6 :证明高度有效的抗CDld抗体共享不同于通过较低效现有技术抗体所看到的 表位的类似中和表位的竞争ELISA的结果图示。根据实施例7,如通过对应于结合的生物素 化402. 8 (A)水平的450nm下吸光度读数与竞争转化度（百分比）值（B)所显示的那样，使 用基于竞争ELISA方法，抗⑶Id抗体402. 8与其本身和与401. 11竞争但不与抗⑶Id抗体 42和51. 1竞争结合人CDld。
[0047] 图7 :证明与重组食蟹猴⑶Id的交叉反应性的测定结果的图示。根据实施例8,抗 CDld抗体401. 11和402. 8结合人CDld (A)，并通过ELISA与食蟹猴CDld (B)是交叉反应 性的。
[0048] 图8 :证明与基于食蟹猴细胞的CDld的交叉反应性的测定结果的图示。根据实施 例9,如通过流式细胞术所示，抗CDld抗体402. 8而非不相关的特异性阴性对照物抗体结 合来自两只独立的食蟹猴供体的PBMC上的⑶Id。数据显示为筛选的活细胞（gated live cells)的流式细胞计量术柱状图，以柱状图形式划分CDld阳性细胞的百分比。
[0049] 图9 :证明食蟹猴CDld介导的初生NKT扩增的细胞基抑制的测定结果的图示。根 据实施例10,如通过流式细胞计量术通过量化CD3+V α 24+细胞所显示的那样，抗CDld抗 体402. 8而不是不相关的特异性阴性对照物抗体在a GalCer-装载的⑶Id-阳性PBMC的 存在下抑制食蟹猴NKT细胞的扩增。
[0050] 图10 :显示401. 11的可变区的序列的序列比对。框出区含有Kabat编号系统与增 强Chothia编号系统所定义的⑶R (如所示)。由Kabat编号系统定义的⑶R以粗体显示。 由增强Chothia编号系统定义的⑶R具有下划线。
[0051] 图11 :显示402. 8的可变区的序列的序列比对。框出区含有Kabat编号系统与增 强Chothia编号系统所定义的⑶R (如所示)。由Kabat编号系统定义的⑶R以粗体显示。 由增强Chothia编号系统定义的⑶R具有下划线。
[0052] 图12 :401. 11的变体的比对。根据实施例11，显示了 401. 11对IGHV-9. 01和 401. 11的变体的重链与轻链的氨基酸序列比对。
[0053] 图13 :401. 11的优化变体的比对。根据实施例11，显示了 401. 11及其变体的重 链与轻链的氨基酸序列比对。
[0054] 图14 :证明通过抗⑶Id抗体401. 11的增强变体对初生NKT细胞功能的提高 抑制的测定结果的图示。根据实施例11，401.11及其变体从lyg/mL滴定。在使用 a -GalCer-扩增NKT细胞与a -GalCer-装载的CD14+单核细胞-衍生的树突细胞作为 ⑶Id阳性细胞的测定中，401. 11抗体变体证实与401. 11相比通过ELISA测定的在24小时 后类似或提高的IFN- γ (A)与IL-4 (B)释放的抑制，以及与从10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗 体42和51. 1相比通过ELISA测定的在24小时后显著提高的IFN-γ (A)与IL-4 (B)释 放的抑制。在所有测定中，不相关的特异性阴性对照物抗体没有抑制细胞因子释放。表13 中给出了来自代表性试验的EC50值。
[0055] 图15 :402. 8的优化变体的比对。根据实施例11，显示了 402. 8对402. 8的变体 的重链的氨基酸序列比对。
[0056] 图16 :证明通过抗⑶Id抗体402. 8的增强变体抑制初生NKT细胞功能的测定结 果的图示。根据实施例11，在使用α-GalCer-扩增NKT细胞和α-GalCer-装载的CD14+ 单核细胞-衍生树突细胞作⑶Id阳性细胞的测定中，402. 8及其变体由10 μ g/mL滴定并 证实与由10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗体42相比，通过ELISA测定的在24小时后的类似的 IFN-γ (A)与IL-4 (B)释放的抑制，和通过ELISA测定的在24小时后显著提高的IFN-γ (A)与IL-4 (B)释放的抑制。在所有测定中，不相关的特异性阴性对照物抗体没有抑制细 胞因子释放。在表18中给出了来自代表性试验的EC50值。
[0057] 图17 :证明在使用α-GalCer的替代抗原的基于初生NKT细胞的测定中通过 抗CDld抗体对初生NKT细胞功能的提高抑制的测定结果的图示。根据实施例12,在使用 a -GalCer-扩增NKT细胞和C24:1 β -D-吡喃葡萄糖基神经酰胺-装载的⑶14+单核细 胞-衍生树突细胞作为⑶Id阳性细胞的测定中，由10 μ g/mL滴定的抗⑶Id抗体42和51 相比，由lyg/mL滴定的抗体401. 11. 158、401. 11和402. 8证实了通过ELISA测定的在24 小时后IFN-γ (A)和IL-4 (B)释放的显著提高的抑制。在所有测定中，不相关的特异性 阴性对照物抗体没有抑制细胞因子释放。在表20中给出了来自代表性试验的EC50值。
[0058] 图18 :证明在修正的条件下高度有效的抗⑶Id抗体共享不同于通过现有技术抗 体所看到的表位的类似中和表位的竞争ELISA的结果图示。根据实施例13,如通过450nm 下吸光度读数（A)与竞争转化度(百分比）值（B)所显示的那样，抗体402. 8与其本身和与 401. 11竞争但不与抗体42和51. 1竞争结合人⑶Id。
[0059] 图19 :证明是401. 11变体的高度有效的抗⑶Id抗体与402. 8共享类似中和表位 的竞争ELISA的结果图示。根据实施例13,如通过450nm下吸光度读数(A)与竞争转化度 (百分比）值（B)所显示的那样，抗⑶Id抗体402. 8与其本身并与作为401. 11抗体变体实 例的 401. 11. 160、40L 11. 161 和 401. 11. 165 强烈竞争结合人 CDld。
[0060] 图20 :证明衍生自402. 8的高度有效的抗⑶Id抗体与402. 8共享类似中和表位 的竞争ELISA的结果图示。根据实施例13,如通过450nm下吸光度读数(A)与竞争转化度 (百分比）值（B)所显示的那样，抗⑶Id抗体402. 8与其本身并与作为402. 8抗体变体实例 的 402. 8. 84、402. 8. 86 和 402. 8. 87 强烈竞争结合人 CDld。
[0061] 图21 :证明单克隆抗人⑶Id抗体不竞争402. 8的中和表位的竞争ELISA的结果 图示。如实施例13中所述，如通过吸光度读数(A)与竞争转化度(百分比）值（B)所显示的 那样，抗⑶Id抗体402. 8与其本身强烈竞争但不与其它单克隆抗人⑶Id抗体例如AD58E7、 C3D5和C-9竞争结合人CDld。
[0062] 图22 :证明单克隆抗小鼠⑶Id抗体不竞争402. 8的中和表位的竞争ELISA的结果 图示。如实施例13中所述，如通过450nm下吸光度读数（A)与竞争转化度（百分比）值（B) 所显示的那样，抗CDld抗体402. 8与其本身强烈竞争但不与其它单克隆抗小鼠 CDld抗体 例如HB-321、HB-322和HB-323竞争结合人CDld。
[0063] 图23 :证明多克隆抗人⑶Id抗体不竞争402. 8的中和表位的竞争ELISA的结果 图示。如实施例13中所述，如通过450nm下吸光度读数（A)与竞争转化度（百分比）值（B) 所显示的那样，抗CDld抗体402. 8与其本身强烈竞争但不与作为多克隆抗人CDld抗体的 实例的C-19、H70和Ab96515竞争结合人CDld。
[0064] 图24 :证明高度有效的抗⑶Id抗体共享不同于其它抗⑶Id抗体所结合表位的类 似中和表位的竞争ELISA的结果图示。如实施例13中所述，如通过450nm下吸光度读数 (A)与竞争转化度（百分比）值（B)所显示的那样，抗⑶Id抗体401. 11. 158与其本身并与 402. 8强烈竞争，但不与抗⑶Id抗体42和51. 1竞争结合人⑶Id。
[0065] 图25 :证明402. 8以及Fab或全长IgG形式的40L 1L 165结合至人CDld的ELISA 结果的图示。
[0066] 图26 :用于阐明抗⑶Id抗体结合的人⑶Id上的位置的⑶Id结构的序列比对。
[0067] 图27 :证明结合人⑶Id和已经向其中引入人序列的小鼠 ⑶Id (mCDldhu)的抗体 402. 8 (A)与401. 11. 158 (B)的滴定的ELISA结果的图示。两种抗体均没有结合小鼠 ⑶Id 和已经向其中引入小鼠序列的人⑶Id (h⑶ldmu)。
[0068] 图28 :证明抗人CDld抗体的表位的氢氘交换图谱实验结果的图示。（A)具有以黑 色显示的氨基酸89-94和141-14的人⑶Id (灰色)。注意：X射线结构是具有表面描述的 3HUJ。（B)与NKT细胞受体（α和β链)复合的人CDld(具有结合的α-GalCer)。人CDld 上的抗⑶Id抗体的表位(氨基酸89-94和141-142)的原子用深灰色着色。该抗⑶Id抗体 的表位位于该NKT细胞受体β -链的结合位点的附近。
[0069] 图29Α :优化的401. 11抗体的VH区的比对和共有序列。框出区含有Kabat编号系 统与增强Chothia编号系统所定义的⑶R (如所示)。由Kabat编号系统定义的⑶R以粗体 显示。由增强Chothia编号系统定义的⑶R具有下划线。
[0070] 图29B :优化的401. 11抗体的八区的比对和共有序列。框出区含有Kabat编号系 统与增强Chothia编号系统所定义的⑶R (如所示)。由Kabat编号系统定义的⑶R以粗体 显示。由增强Chothia编号系统定义的⑶R具有下划线。
[0071] 图30A:优化的402. 8抗体的VH区的比对和共有序列。框出区含有Kabat编号系 统与增强Chothia编号系统所定义的⑶R (如所示)。由Kabat编号系统定义的⑶R以粗体 显示。由增强Chothia编号系统定义的⑶R具有下划线。
[0072] 图30B :优化的402. 8抗体的八区的比对和共有序列。框出区含有Kabat编号系 统与增强Chothia编号系统所定义的⑶R (如所示)。由Kabat编号系统定义的⑶R以粗体 显示。由增强Chothia编号系统定义的⑶R具有下划线。
[0073] 发明详述
[0074] 本发明涉及结合CDld的特定表位的人和人源化的抗体及其抗原结合部分。本发 明人已经发现，结合CDld的这种表位的抗体在减轻CDld对NKT细胞的影响方面特别有效。 由于这种影响，据信这些抗体与其抗原结合部分将可用于治疗其中NKT细胞效应子功能 (例如NKT细胞过度产生细胞因子）起作用的病况，例如哮喘。
[0075] 因此，在第一方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分， 其中该分离的抗体或其抗原结合部分与选自401. 11和402. 8的至少一种抗体竞争与CDld 的结合。
[0076] 在第二方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分结合与选自401. 11和402. 8的至少一种抗体所结合的表位 相同的⑶Id表位。
[0077] 在第三方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含具有选自SEQ ID N01、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、 40、41、42、43、44和45的序列和至少95%与之相同的序列的VH域。
[0078] 在第四方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含具有选自SEQ ID勵2、4、6、46、49和62的序列和至少 95%与之相同的序列的VL域。
[0079] 在第五方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含VH域，该VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID NO:125)。
[0080] 在本发明的这一方面的实施方案中，⑶R3的序列是DMCSSSGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 126), DLCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 152), DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 153), DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 154), GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID NO: 127), GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID N0:128), GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO: 155), GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID NO: 156), GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)或GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。在进一步的实施 方案中，CDR2 的序列是 TIIWNSAIIGYADSVKG (SEQ ID N0:131)、EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:132)、EINPSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:133)或EINHAGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:134)。
[0081] 在第六方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含VH域，该VH域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID NO:136)。
[0082] 在本发明的第六方面的实施方案中，⑶R3的序列是DMCSSSGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 126), DLCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 152), DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID NO: 153), DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID NO: 154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID NO: 127)、GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID N0:128), GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO: 155), GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID NO: 156), GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)或GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。在进一步的实施 方案中，CDR2 的序列是 IWNSAI (SEQ ID N0:137)、NHSGS (SEQ ID N0:138)、NPSGS (SEQ ID NO:139)或 NHAGS (SEQ ID NO:140)。
[0083] 在第七方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分包含VL域，该VL域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列 与 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列，并且其中 CDR1 的序列是 RASQHISSWLA (SEQ ID N0:141)或 ASSSGAVSSGNFPN (SEQ ID N0:142)〇
[0084] 在本发明的第七方面的实施方案中，⑶R3的序列是QQANRFPLT (SEQ ID N0:141) 或LLYFGDTQLGV (SEQ ID N0:142)。在进一步的实施方案中，CDR2的序列是AASSLQS (SEQ IDN0:145)*SASNKHS(SEQIDN0:146)。
[0085] 在第八方面中，本发明提供结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中该 分离的抗体或其抗原结合部分结合具有如使用基于细胞的效价测定测得的小于20ng/ml 的EC50的CDld。在实施方案中，该分离的抗体或其抗原结合部分结合具有0. 5ng/ml至 20ng/ml 的 EC50 的人 CDld。
[0086] 在本发明的实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO: 2的VH和VL序列对。
[0087] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 46 的 VH 和 VL 序列对。
[0088] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQID NO: 24 和 SEQ ID NO:47 的 VH 和 VL 序列对。
[0089] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的VH和VL序列对。
[0090] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 48 的 VH 和 VL 序列对。
[0091] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 26 和 SEQ ID NO: 49 的 VH 和 VL 序列对。
[0092] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 50 的 VH 和 VL 序列对。
[0093] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 28 和 SEQ ID NO: 51 的 VH 和 VL 序列对。
[0094] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 52 的 VH 和 VL 序列对。
[0095] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 30 和 SEQ ID NO: 53 的 VH 和 VL 序列对。
[0096] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 31 和 SEQ ID NO: 54 的 VH 和 VL 序列对。
[0097] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 32 和 SEQ ID NO: 55 的 VH 和 VL 序列对。
[0098] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 56 的 VH 和 VL 序列对。
[0099] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 34 和 SEQ ID NO: 57 的 VH 和 VL 序列对。
[0100] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 58 的 VH 和 VL 序列对。
[0101] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 36 和 SEQ ID NO: 59 的 VH 和 VL 序列对。
[0102] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQID NO: 37 和 SEQ ID NO: 60 的 VH 和 VL 序列对。
[0103] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 38 和 SEQ ID NO: 61 的 VH 和 VL 序列对。
[0104] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO :40 和 SEQ ID NO :62 的 VH 和 VL 序列对。
[0105] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 41 和 SEQ ID NO: 63 的 VH 和 VL 序列对。
[0106] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID N0:42 和 SEQ ID N0:64 的 VH 和 VL 序列对。
[0107] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列对。
[0108] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列对。
[0109] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列对。
[0110] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 4的VH和VL序列对。
[0111] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO :43 和 SEQ ID NO :65 的 VH 和 VL 序列对。
[0112] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO :44 和 SEQ ID NO :66 的 VH 和 VL 序列对。
[0113] 在本发明的一个实施方案中，提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO :45 和 SEQ ID NO :67 的 VH 和 VL 序列对。
[0114] 在任一上述方面的一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分结合人⑶Id (SEQ ID NO: 116)，但是不结合h⑶ldmu (SEQ ID NO: 119)。在任意上述方面的一个实施方案 中，该抗体或其抗原结合部分结合mCDldhu (SEQ ID N0:118)，但是不结合mCDld (SEQ ID N0:117)。
[0115] 在第九方面中，本发明提供分离的DNA分子，其编码本发明的分离的抗体或其抗 原结合部分。在一个实施方案中，该分离的DNA分子选自以下SEQ ID N0的任意种：10、 11、12、13、14、15、16、17、18、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115或至少95%与之相同的序列或在中等至高度严格条件 下与之杂交的序列。在一个实施方案中，分离的DNA分子选自以下SEQ ID N0的任一种：10、 11、12、13、14、15、16、17、18、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114 或 115。
[0116] 在第十方面中，本发明提供在人类对象中治疗涉及NKT细胞效应子功能的病况的 方法，包括向对象施用本发明的分离的抗体或其抗原结合部分。
[0117] 在第十一方面中，本发明提供检测样品中存在CDld的方法，其包括使怀疑含有 CDld的样品与本发明的分离的抗体或其抗原结合部分在允许该抗体或其抗原结合部分结 合CDld的条件下接触以形成复合物并检测样品中该复合物的存在。
[0118] 在第十二方面中，本发明提供检测细胞样品中CDld阳性细胞的存在的方法，该 方法包括将细胞群体与本发明的分离的抗体或其抗原结合部分接触以允许该抗体或其抗 原结合部分结合CDld阳性以形成复合物并检测该抗体或其抗原结合部分细胞复合物的存 在。
[0119] 在第十三方面中，本发明提供从多种CDld结合蛋白中选择特异性地结合人CDld 并与选自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一种抗体竞争在⑶Id上的结合的⑶Id结合 蛋白的方法，该方法包括：
[0120] 在足以允许CDld结合蛋白结合该突变蛋白以形成CDld结合蛋白-人CDld突变蛋 白复合物和排除的多种没有结合该人CDld突变蛋白的CDld结合蛋白的条件下使多种CDld 结合蛋白接触人⑶Id突变蛋白，在所述人⑶Id突变蛋白中SEQ ID NO: 116位置87至93 和141-143的氨基酸已经被这些位置处的相应的小鼠氨基酸取代，并且从排除的多种⑶Id 结合蛋白中收集没有结合人CDld突变蛋白的CDld结合蛋白，其中收集的CDld结合蛋白特 异性地结合人⑶Id并与选自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少一种抗体竞争在⑶Id上 的结合。
[0121] 在第十四方面中，本发明提供从多种CDld结合蛋白中选择特异性地结合人CDld 的CDld结合蛋白的方法，该方法包括：
[0122] 在足以允许⑶Id结合蛋白结合h⑶ldmu以形成⑶Id结合蛋白-h⑶ldmu复合物 和排除的多种没有结合hCDldmu的CDld结合蛋白的条件下，使多种CDld结合蛋白与其中 位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143处的氨基酸已经被相应于小鼠 的这些位置处的序列替代的h⑶ldmu (SEQ ID N0:119)接触，并从排除的多种⑶Id结合蛋 白中收集没有结合hCDldmu的CDld结合蛋白，其中收集的CDld结合蛋白特异性地结合人 CDld(SEQIDN0:116)或mCDldhu(SEQIDN0:118)。本发明的抗CDld抗体还可以用于 从血液中识别或选择CDld阳性细胞群体。抗CDld抗体可用于在人类患者的外周血中检测 CDld阳性细胞群，包括骨髓细胞如单核细胞，或淋巴样细胞如B细胞。该抗体可用于在其中 此类⑶Id阳性细胞导致疾病的病况中检测这些细胞，所述疾病例如是某些白血病，包括慢 性淋巴细胞白血病（CLL) (Metelitsa 等人，Leukemia(2003) 17, 1068 - 1077 ;Kotsianidis 等人，2011 ;AmJClinPathl36, 400-408)。
[0123] 该抗人CDld抗体还可以用于使用本领域公知的方法对组织切片进行染色用于免 疫组织化学。
[0124] 在本发明的某些具体实施方案中，该分离的抗体或其抗原结合部分可以包含人 kappa链恒定区或人lambda链恒定区。在某些实施方案中，该分离的抗体或其抗原结合部 分包含IgGl或IgG4恒定区。当该抗体包含IgG4恒定区时，其可以包括S228P突变。
[0125] 本发明还提供编码本发明的分离的抗体或其抗原结合部分的DNA分子。在某些实 施方案中，该DNA分子的序列选自SEQ ID N0. 10至18、SEQ ID N0S68至115或至少95%与 之相同的序列或在中等至高度严格条件下与之杂交的序列的任意一种。
[0126] 本发明还提供在人类对象中治疗涉及NKT细胞效应子功能的病况的方法，其包括 向该对象施用本发明的分离的抗体或其抗原结合部分。可以治疗的涉及NKT细胞效应子功 能例如NKT细胞过度产生细胞因子的病况实例包括牛皮癣、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性 肝硬化、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、哮喘和与镰 状细胞病相关的肺部炎症或机能障碍。
[0127] 如在下列实施例中描述的那样，本发明人已经开发了结合CDld的特定表位的有 效抗体。确定这个表位的性质是抗体和抗原提供（arm)的领域中的技术人员的常规技术。 本领域那些技术人员公知的可用于确定抗体401. 11和402. 8结合的⑶Id表位的方法包括 CDld丙氨酸扫描诱变、氢/氣交换图谱(mapping)、X射线晶体学、核磁共振和光亲和标记 法。
[0128] 丙氨酸扫描诱变（参见例如 Ausubel: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN047 150338, 1987，第 8 和 15 章；或 Cunningham 等 人，1989Science244 1081-5)在CDld分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变。随后对 所得突变分子测试它们结合该401. 11和/或402. 8抗体的能力。损失结合意味着已经变 为丙氨酸的特定残基可能包括在该表位中。
[0129] 在使用氢氘交换的表位图谱中，CDld中的氢在溶液中用氘交换。该401. 11和/或 402. 8抗体随后结合到CDld上，其随后在H20中交换回氢。在该方法中，存在于该表位中的 氘被抗体的结合保护。比较受该抗体结合保护和未受保护的CDld的交换模式揭示了作为 保留氣的CDld的氣基酸残基的该表位。
[0130] 在X射线晶体学中，将401. 11和/或402. 8抗体与之结合的⑶Id结晶，并通过 X射线衍射检查该晶体。这种方法提供了抗体与之结合的CDld的区的明确信息。核磁共 振或光亲和标记也可使用，如deVos等人，1992Science255 306-12 ;和Smith等人，1992J MolBiol224 899-904 中所述。
[0131] 如本领域技术人员将理解的那样，通过本发明的抗体或其抗原结合部分识别的表 位可以包含氨基酸的线性系列或可以是构象表位。
[0132] 在一方面中，本发明涉及与至少一种选自401. 11和402. 8的抗体竞争结合人⑶Id 的抗体。
[0133] 本文中所用的"竞争"指的是该抗体或其抗原结合部分以浓度依赖性方式降低了 选自 40L 11、40L 1L 28、402· 8、402· 8. 45、402· 8. 53 和 402. 8. 60 的至少一种抗体与 CDld 的结合。在下面给出的实施例7中提供了评估其的方式的一个实例。特别地，当选自401. 11 和402. 8的至少一种抗体与测试抗体的结合比与相同浓度使用的抗体42或51. 1结合极大 降低时，抗体或其抗原结合部分被称为与至少一种选自401. 11和402. 8的抗体"竞争"与 CDld的结合(现有技术的抗体42和5L 1描述在Exley等人，1997JExp Medl86, 109-120和 W003/092615 中）。
[0134] 如本文中所述，"竞争结合CDld"的抗体或其抗原结合部分在竞争ELISA的归一 化结果中表现出至少50%的竞争，其中40 μ g/mL的非生物素化测试抗体与结合到固定在固 体底物上的1. 〇 μ g/mL重组人⑶Id上结合的0. 2 μ g/mL生物素化抗⑶Id抗体402. 8或 40L 11 或 40L 1L 158 竞争。
[0135] 在某些实施方案中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合部分，其结合具有如使 用基于细胞的效价测定测得的小于20ng/ml的EC50的CDld。在某些实施方案中，该分离的 抗体或其抗原结合部分结合至具有〇. 5ng/ml至20ng/ml的EC50的⑶Id。如本文中所用， 如下文给出的实施例4中那样评估该抗体或其抗原结合部分的EC50。
[0136] 如上所述，该抗体或其抗原结合部分特异性地结合CDld。本文中所用的术语"特 异性地"指的是与CDld的结合是经由该抗体或其抗原结合部分的VH和VL域并且不是非特 异性结合(例如可以经Fc区发生的）。
[0137] 如在下列实施例中所述，本发明的抗体或其抗原结合部分与人CDld、和食蟹猴或 猕猴⑶Id结合。这与现有技术的抗体42和51. 1不同。
[0138] 人⑶Id的氨基酸序列可以是例如：
[0139] MGCLLFLLLWALLQAWGSAEVPQRLFPLRCLQISSFANSSffTRTDGLAffLGELQTHSffSNDSDTVRSLK PWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQG TSWEPTQEAPLffVNLAIQVLNQDKWTRETVQffLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAffLSRGPSPGPGRLLLV CHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQP⑶ILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYT SMGLIALAVLACLLFLLIVGFTSRFKRQTSYQGVL (SEQ ID 勵：157)人0)1(1的此1?1'(^登录号为 P15813。
[0140] 在另一方面，本发明涉及抗体，其结合与选自401. 11和402. 8(在某些实施方案中 为40. 11. 158)的至少一种抗体所结合的表位相同的⑶Id的表位。如上所述，通过特定抗 体结合的CDld的表位可以通过许多方法评估，并且随后可以与指定抗体所结合的表位进 行比较。
[0141] 在一个实施方案中，该表位包含SEQ ID N0:116的残基141至143或SEQIDN0:116 的残基87至93和141至143。
[0142] 本文中所用的术语"抗体"广泛地指由四条多肽链--两条重（H)链和两条轻（L) 链--组成的任何免疫球蛋白（Ig)分子，或其保留了 Ig分子的必需表位结合特征的任何 功能性片段、突变体、变体或其衍生物。此类突变体、变体或衍生物抗体形式是本领域已知 的。下面讨论其非限制性实施方案。
[0143] 在全长抗体中，各重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区 组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩 写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以 进一步细分为称作互补决定区（CDR)的超可变区，该超可变区点缀有称为框架区（FR)的更 保守的区。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其以下列次序从氨基端向羧基端排列： FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以具有任何类型(例如，IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA 和 IgY)、类别（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类。
[0144] 本文中所用术语抗体的"抗原结合部分"指的是保留了特异性地结合抗原(例如 CDld)的能力的抗体或蛋白质的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通 过全长抗体的片段来实施。此类抗体实施方案还可以是双特异性、双重特异性的或多重特 异性的形式；特异性地结合两个或多个不同的抗原。涵盖在术语抗体的"抗原结合部分" 中的结合片段的实例包括（i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；（ii) F (ab'）2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；（iii )由VH和 CH1结构域组成的Fd片段；（iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；（v)结构 域抗体（dAb) (Ward 等人，1989Nature341544_6，Winter 等人，PCT 公开 W090/05144,均 经此引用并入本文)，其包含单个可变结构域；和（vi)分离的互补决定区（⑶R)。此外，尽 管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可以使用重组方法，通过能够使其 制成单个蛋白质链的合成连接子，将它们接合，其中VL和VH区配对形成一价分子(称为 单链 Fv(scFv));(参见例如 Bird 等人，1988Science242 423-6 ;Huston 等人，1988Proc Natl Acad Sci USA85 5879-83)。此类单链抗体也意在涵盖在术语抗体的"抗原结合部 分"中。还涵盖了其它形式的单链抗体，例如也涵盖双抗体。双抗体是二价的、双特异性的 抗体，其中在单个多肽链上表达VH和VL结构域，但使用太短以至于不允许同一链上两个 结构域之间配对的连接子，由此迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗 原结合位点（参见例如 Holliger, Ρ·等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 ; Poljak，R.J.等人，1994, Structure2:1121-1123)。此类抗体结合部分在本领域中是已知 的（Kontermann和Dubel 编辑，Antibody Engineering2001Springer-Verlag.New York.第 790 页，ISBN3-540-41354-5)。
[0145] 本文中描述的抗体可以是人源化抗体。术语"人源化抗体"应理解为是指包含类人 可变区的蛋白质，其包括移植到或插入到来自人抗体的FR中的来自源于非人物种(例如小 鼠或大鼠或非人灵长目动物）的抗体的CDR (这种类型的抗体也称为"CDR移植抗体")。人 源化抗体还包括其中人蛋白质的一个或多个残基被一个或多个氨基酸置换改性和/或人 蛋白质的一个或多个FR残基用相应的非人残基替换的蛋白质。人源化抗体还可以包含既 非在人抗体中或也非在非人抗体中发现的残基。该蛋白质的任何附加区(例如Fc区)通常是 人的。人源化可以使用本领域已知的方法进行，例如US 5225539、US 6054297、US 7566771 或US5585089。术语"人源化抗体"还涵盖超人源化蛋白质，例如如在US 7732578中所述。
[0146] 本文中所述的抗体可以是人的。本文中所用的术语"人抗体"指的是具有在人类 中，例如在人类种系或体细胞中，发现的可变抗体区和任选恒定抗体区的蛋白质或来自使 用此类区制得的文库的蛋白质。"人"抗体可以包括并非由人序列编码的氨基酸残基，例如 通过在体外的随机或定点突变引入的突变(特别是包括在少量蛋白质残基中，例如在蛋白 质的残基的1、2、3、4、或5中的保守性置换或突变的突变)。这些"人抗体"不一定需要作为 人的免疫响应而产生，相反，它们可以使用重组手段(例如筛选噬菌体展示文库)和/或通过 包含编码人抗体恒定和/或可变区的核酸的转基因动物(例如小鼠）和/或使用定向选择 (例如如US5565332中所述)产生。该术语还涵盖此类抗体的亲和力成熟形式。就本公开目 的而言，人蛋白质还被认为包括含有来自人抗体的FR或包含来自人FR的共有序列的序列 的FR，其中CDR的一种或多种是随机或半随机的，例如如US6300064和/或US6248516中所 述。
[0147] 可以根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health，Bethesda，Md·，1987 和 1991 (在本文中也称为 "Kabat 编号系 统"）来限定指定给⑶R和FR的氨基酸位置。在其它实施方案中，根据Enhanced Chothia Numbering Scheme ( http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)限定指定给 CDR 和 FR 的 氨基酸位置。根据Kabat的编号系统，VHFR和⑶R可如下定位：残基1-30 (FRl)、31-35 (CDRl)、36-49 (FR2)、50-65 (CDR2)、66-94 (FR3)、95-102 (CDR3)和 103-113 (FR4)。 根据Kabat的编号系统，VLFR和CDR如下定位：残基1-23 (FRl)、24-34 (CDRl)、35-49 (FR2)、50-56 (CDR2)、57-88 (FR3)、89-97 (CDR3)和 98-107 (FR4)。本公开不限于通 过Kabat编号系统限定的FR和CDR,而是包括所有编号系统，包括规范的编号系统或 Chothia和Lesk，J.MolBiol. 196:901-917, 1987 ;Chothia等人，Nature342, 877-883, 1989 ; 和 / 或 Al-Lazikani 等人，JMolBiol273, 927-948, 1997 ;Honnegher 和 Pliikthun 的 编号系统 J. Mol. Biol. , 309:657-670, 2001 ;或在 Giudicelli 等人，Nucleic Acids Res.，25:206-2111997中所讨论的頂GT系统。在一个实例中，根据Kabat编号系统限定该 ⑶R。任选地，根据Kabat编号系统的重链⑶R2不包含本文中列举的五个C-端氨基酸，或者 这些氨基酸的任意一个或多个被另一天然存在的氨基酸置换。在附加的或替换的选项中， 轻链CDR1不包含本文中列举的四个N-端氨基酸，或者那些氨基酸的任意一个或多个被另 一天然存在的氨基酸置换。在这方面，Padlan等人，FASEBJ.，9:133-139, 1995证实了重链 CDR2的五个C端氨基酸和/或轻链CDR1的四个N端氨基酸通常不涉及抗原结合。
[0148] 本文中所用的术语"抗体构建体"指的是包含连接到连接多肽或免疫球蛋白恒定 结构域上的本发明的一个或多个抗原结合部分的多肽。连接多肽包含两个或多个通过肽键 接合的氨基酸残基并用于连接一个或更多抗原结合部分。此类连接多肽在本领域中是公知 的（参见例如 Holliger 等人，1993Proc Natl Acad Sci USA90 6444-8)。
[0149] 免疫球蛋白恒定结构域指的是重链或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结 构域氨基酸序列在本领域中是已知的，并且实例如下所示。
[0150] 人重链IgGl恒定域(或其衍生物，如NCBI登录号：P01857)
[0151] ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIΕΚΤISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:158)
[0152] 人重链IgG4恒定结构域(如NCBI登录号：P01861)
[0153] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:159)
[0154] 参入S228P突变的人重链IgG4恒定结构域
[0155] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:160)
[0156] 如US7, 083, 784中所述的参入S228P突变和YTE突变的人重链IgG4恒定结构域 也可以使用。
[0157] 人轻链kappa恒定结构域(如NCBI登录号：P01834)
[0158] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:161)
[0159] 人轻链lambda恒定结构域(如NCBI登录号：P01842)
[0160] QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASS YLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:162)
[0161] 如将被理解的，本发明中开发和描述的序列可以使用本领域公知的方法改性以提 高结合，例如通过亲和力成熟，或通过除去预测的MHCII类结合基序来降低免疫原性。可 以通过调节其功能特性，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)、补体依赖性细胞毒性 (⑶C)、血清半衰期、生物分布和与Fc受体结合或任意这些方法的组合来进一步增强本文 中开发和描述的序列的治疗实用性。这种调节可以通过蛋白质工程、糖工程或化学方法来 实现。取决于所需的治疗应用，可以有利地提高或降低这些活性的任意种。
[0162] 用于抗体的亲和力成熟的多种方法在本领域是已知的。这些方法许多基于通过诱 变并接着为提高的亲和力而选择和/或筛选生成变体蛋白的组或文库的一般策略。诱变通 常在0嫩水平进行，例如通过易错？0?法（111丨6!1200916丨11〇(18]\1〇18丨〇1.525:309-22)，通 过基因改组（Kolkman 和 Stemmer2001Nat Biotechnol. May; 19 (5) :423_8)，通过使用诱变 化学物质或辐射，通过使用具有易错复制机制的"突变子"株（Green er1996)或通过利用天 然亲和力成熟机制的体细胞超突变方法（Peled，Kuang等人，2008)。还可以在RNA水平下进 行诱变，例如通过使用Q3复制酶（Kopsidas，Roberts等人，2006)酶。允许筛选提高的变 体蛋白的基于文库的方法可以基于各种展示技术，如噬菌体、酵母、核糖体、细菌或哺乳动 物细胞，并且在本领域是公知的（Benhar2007)。亲和力成熟可以通过更有针对性/更有预 测性的方法来实现，例如通过定点诱变或通过来自3D蛋白质建模的发现所指导的基因合 成(参见例如Queen, Schneider等人，1989或美国专利6, 180, 370或美国专利5, 225, 539)。
[0163] 用于调节抗体血清半衰期和生物分布的多种方法基于改变抗体与新生Fc受体 (FcRn)之间的相互作用，所述新生Fc受体是在保护IgG免受分解代谢并保持高血清抗 体浓度中起关键作用的受体。Dali' Acqua等人描述了在IgGl的Fc区中增强与FcRn的 结合亲和力的置换，由此提高血清半衰期（Dali' Acqua，Woods等人，2002)，并用M252Y/ S254T/T256E (YTE突变）的三重置换进一步证实了增强的生物利用率与ADCC活性的 调节（Dali，Acqua, Kiener 等人，2006)。还参见美国专利号 6, 277, 375 ;6, 821，505 ;和 7, 083, 784。Hinton等人已经描述了赋予提高的体内半衰期的在位置250和428处的恒 定结构域氨基酸置换（Hinton, Johlfs等人，2004) (Hinton, Xiong等人，2006)。还参见 美国专利号7, 217, 797。Petkova等人已经描述了赋予提高的体内半衰期的在位置307、 380和434处的恒定结构域氨基酸置换（Petkova, Akilesh等人，2006)。还参见Shields 等人（511丨61(18，似111611业等人，2001)和冊2000/42072。抗体恒定区还可以改性以去除 效应子功能。位置297处的天冬酰胺（N)突变为谷氨酰胺（Q)去除了介导Fc向Fc受体 的结合的N-联碳水化合物。此类糖基化抗体不结合到人Fc γ RI并且不会激活补体途径 (complementpathway) (Tao和Morrisonl989)。调节与Fc受体的结合以及随后通过这些 受体介导的功能(包括FcRn结合和血清半衰期）的恒定结构域氨基酸置换的其它实例描述 在美国专利申请号 20090142340 ;20090068175 ;和 20090092599 中。
[0164] 在包含Fc区的本发明的分子中，在某些实施方案中工程设计置换L235E中以 减少或消除Fc结合和Fc相关效应子功能是有利的，如在Lund, Winter等人，（1991) J Immunologyl47:2657-2662 和 Alegre 等人，（1992) J Immunologyl48:3461-3468 中所述。 该抗体可以是IgGl，和IgG3或IgG4。
[0165] 在包含Fc区的本发明的分子中，在某些实施方案中工程设计或以其它方式选择 其中C端赖氨酸（K447)被删除的Fc是有利的。优选这种修改通过降低表达的分子的异质 性而提高可制造性。
[0166] 连接抗体分子的多糖已知会影响抗体与Fc受体和多糖受体的相互作用并由此影 响抗体活性，包括血清半衰期（Kaneko, Nimmer jahn等人，2006Jones, Papac等人，2007 ; 和Kanda，Yamada等人，2007)。因此，调节期望的抗体活性的某些糖形可以赋予治疗优 势。产生工程的糖形的方法是本领域已知的，并且包括但不限于美国专利号6, 602, 684 ; 7, 326, 681 ;7, 388, 081 ;和 W02008/006554 中描述的那些。
[0167] 通过添加聚乙二醇（PEG)延长半衰期已经广泛用于延长蛋白质的血清半衰期，如 例如由Fishburn2008所综述的。
[0168] 本发明还提供包含至少一种本发明的分离的抗体或其抗原结合部分的组合物。这 种组合物通常将包含至少一种配制剂，所述配制剂选自无菌水、无菌缓冲水和/或至少一 种防腐剂，所述防腐剂选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基 酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或其在水性稀释剂中的混合物，任选地，其 中蛋白质的浓度为约〇. lmg/ml至约200mg/ml，进一步包含至少一种等渗剂或至少一种生 理可接受的缓冲剂。
[0169] 本发明的抗体组合物可以任选进一步包含有效量的至少一种化合物或蛋白质， 其选自抗感染药、心血管（CV)系统药、中枢神经系统（CNS)药、自主神经系统（ANS)药、呼 吸道药、胃肠（GI)道药、激素药、用于体液或电解质平衡的药、血液学药、抗肿瘤药、免疫 调节药、眼、耳或鼻药、局部用药、营养药等等的至少一种。这些药在本领域是公知的，包 括各种本文中提出的制剂、指征、剂量和给药(参见例如Nursing2001Handbook of Drugs, 第 21 版，Springhouse Corp. , Springhouse, Pa.,2001 ；Health ProfessionalJ s Drug Guide2001,编辑Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N. J.； Pharmcotherapy Handbook, Wells 等人编辑，Appleton&Lange, Stamford, Conn.,其各自经 此引用全文并入本文)。
[0170] 本发明的组合物可以进一步包含任何合适的助剂的至少一种，例如但不限于稀 释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等等。优选药学上可接受 的助剂。此类无菌溶液的非限制性实例及其制备方法在本领域是公知的，例如但不限 于 Gennaro 编辑，Remington, sPharmaceutical Sciences,第 18 版，Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990。可以如本领域中公知或如本文中所述那样常规选择适于给药方式、 抗体组合物的溶解性和/或稳定性的药学可接受载体。
[0171] 可用于本组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质 和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如糖醇类、醛糖酸 类、酯化糖类等等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合地存在，单独或组合地构成 1-99. 99重量％或体积％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，如人血清白蛋白（HSA)、重 组人白蛋白（rHA)、明胶、酪蛋白等等。也可以在缓冲能力方面起作用的代表性的氨基酸包 括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等等。一种优选的氨基酸是组氨酸。第二 优选的氨基酸是精氨酸。
[0172] 适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括例如单糖类，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、 葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖类，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维素二糖等等；多糖 类，例如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇类，例如甘露糖醇、木糖 醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（山梨醇)、肌醇等等。用于本发明的优选的碳水化合 物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和蜜三糖。
[0173] 抗体组合物还可以包括缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是由有机酸或碱制备的 盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙 酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、盐酸氨丁三醇（tromethamine)或磷酸盐缓冲剂。用于本组合 物的优选缓冲剂是有机酸盐，如柠檬酸盐。
[0174] 此外，本发明的组合物可以包含聚合赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮、菲可 (一种聚合糖)、葡萄糖结合剂(例如，环糊精，如2-羟丙基-β -环糊精)、聚乙二醇、调味剂、 抗微生物齐?、甜味齐?、抗氧化齐?、抗静电齐?、表面活性剂(例如聚山梨酯，例如" TWhHN? 20"和" TWEEN? 80")、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇）和螯合剂(例如 EDTA)。
[0175] 适用于本发明的抗体组合物的这些和其它已知药物赋形剂和/或添加剂在 本领域中是己知的，例如如在"Remington:The Science&Practice of Pharmacy"， 第 19 版，Williams&Williams, (1995)和在 "Physician，sDesk Reference"，第 52 版，MedicalEconomics, Montvale, N. J. (1998)中所列举的，其公开内容经此引用全部并入 本文。优选的载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或 聚合剂。
[0176] 本发明还提供了治疗涉及NKT细胞效应子功能的病况的方法，其包括施用该抗体 或其抗原结合部分。本文中所用的术语"NKT细胞效应子功能"意在包括由致使NKT细胞的 CDld限制性糖脂活化所产生的NKT细胞功能。此类功能包括但不必要限于以下的任意一种 或多种：由NKT细胞的肿瘤坏死因子a (TNF- α )、IFN- γ、IL-4、IL-5或IL-13释放，NKT 细胞表面FasL表达的上调、释放穿孔素以及由ΝΚΤ细胞释放粒酶Β。
[0177] 给药途径可以选自宽范围的给药途径，包括肠胃外、肌内、静脉内、推注（bolus)、 腹膜内、皮下、呼吸、吸入、局部、鼻、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、真皮下和经皮。但是目 前据信最合适的途径是肠胃外或吸入。关于吸入蛋白质的附加信息可以在Borish LC等 人，1999Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160(6)，1816-1823 中找到。
[0178] 对于肠胃外给药，该抗体或其抗原结合部分可以配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干 粉末，与药学上可接受的肠胃外载体结合或单独地提供。此类载体的实例是水、盐水、林格 氏溶液、右旋葡萄糖溶液和1-10%的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，如不 挥发油。载体或冻干粉末可含有保持等渗性的添加剂(例如氯化钠、甘露糖醇）和保持化学 稳定性的添加剂(例如，缓冲剂和防腐剂)。通过已知的或合适的技术将该制剂灭菌。
[0179] 本发明的分离的核酸分子可以包括包含开放阅读框（0RF)的核酸分子，任选具有 一个或多个内含子，例如但不限于分别具有至少一个重链或轻链的至少一个⑶R (如⑶R1、 CDR2和/或CDR3)的至少一个特定部分；包含抗体或其抗体结合部分的编码序列的核酸分 子；和包含基本上不同于上述那些的核苷酸序列但其因遗传密码简并仍编码本文中所述的 和/或本领域已知的至少一种抗体或抗体结合部分的核酸分子。当然，遗传密码在本领域 中是公知的。因此，产生编码本发明的特异性抗体或其抗体结合部分的此类简并核酸变体 对本领域技术人员而言是常规的。参见例如Ausubel等人(上文)，并且此类核酸变体包括 在本发明中。
[0180] 如本文中所示，包含编码抗体或其抗体结合部分的核酸的本发明的核酸分子可以 包括但不限于自身编码抗体或其抗体结合部分的氨基酸序列的那些；整个抗体或其抗体结 合部分的编码序列；抗体或其抗体结合部分的编码序列以及附加序列，例如至少一个信号 前导或融合肽的编码序列，含有或不含有前述附加编码序列，例如至少一个内含子，以及附 加的非编码序列，包括但不限于非编码5'和3'序列，如在转录、mRNA加工(包括剪接和多 腺苷酸化信号--例如核糖体结合和mRNA的稳定性）中起作用的转录、未翻译的序列；编 码附加氨基酸的附加编码序列，例如提供附加功能的那些。由此，编码抗体或其抗体结合部 分的序列可以融合成标记序列(例如编码有助于纯化该融合抗体或其抗体结合部分的肽的 序列)。
[0181] 本发明提供了在选择性杂交条件下与编码本发明的抗体或其抗体结合部分的多 核苷酸杂交的分离的核酸。因此，该具体实施方案的多核苷酸可以用于分离、检测和/或量 化包含此类多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可以用于识别、分离或扩增保藏文 库中的部分或全长克隆。在某些具体实施方案中，该多核苷酸是从人或哺乳动物核酸文库 分离的基因组或cDNA序列，或者是与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补的基因组或 cDNA序列。
[0182] 该cDNA文库优选包含至少80%的全长序列，优选至少85%或90%的全长序列，更 优选至少95%的全长序列。可以将cDNA文库标准化以提高罕见序列的呈现。通常，但不限 于，与相对于互补序列具有降低的序列同一性的序列，使用低或中等严格杂交条件。对于同 一性较高的序列，任选使用中等和高度严格条件。低严格条件允许具有约70%的序列同一 性的序列的选择性杂交，并可以用于识别直系同源序列或旁系同源序列。
[0183] 任选地，本发明的多核苷酸将编码由本文中所述多核苷酸编码的抗体或其抗原结 合部分的至少一部分。本发明的多核苷酸包括可用于与编码本发明的抗体或其抗原结合部 分的多核苷酸选择性杂交的核酸序列（参见例如Ausubel,上文)。
[0184] 可以使用本领域公知的（a)重组方法，（b)合成技术，和（c)纯化技术，或其组合来 制备本发明的分离的核酸。
[0185] 该核酸可以方便地包含除本发明的多核苷酸外的序列。例如，可以将包含一个或 多个限制性核酸内切酶位点的多克隆位点插入到该核酸中以帮助多核苷酸的分离。此外， 可以插入可翻译序列以帮助分离本发明的翻译的多核苷酸。例如，六-组氨酸标记序列提 供方便的手段以纯化本发明的蛋白质。除该编码序列外，本发明的核酸任选是用于克隆和 /或表达本发明的多核苷酸的载体、接头或连接区。
[0186] 可以将附加序列添加到此类克隆和/或表达序列中以优化它们在克隆和/或表达 中的功能，以便帮助多核苷酸的分离，或改善将多核苷酸引入到细胞中。克隆载体、表达载 体、接头和连接区的使用在本领域中是公知的(参见例如Ausubel,上文)。
[0187] 可以使用任何数量的本领域技术人员已知的克隆方法，从生物来源获得本发明的 分离的核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或其任意组合。在一些具体实施方案中，在 严格条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于在cDNA或基因组DNA文 库中识别所需序列。RNA的分离以及cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员公知 的(参见例如Ausubel,上文)。
[0188] 可以使用基于本发明的多核苷酸序列（如本文公开的那些）的探针来筛选cDNA或 基因组文库。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同生物体中的 同源基因。本领域技术人员将认识到在测定中可以使用各种严格程度的杂交；并且杂交或 洗涤介质可以是严格的。当杂交条件变得更严格时，用于发生双链体形成的探针与靶标之 间的互补程度必须更高。可以通过温度、离子强度、pH和存在部分变性溶剂(例如甲酰胺） 的存在中的一种或多种来控制严格程度。例如，通过经由在0%至50%范围内控制甲酰胺 浓度来改变反应物溶液的极性，由此方便地改变杂交的严格性。可检测结合所需的互补性 (序列同一性)程度将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而变化。互补性程度最适宜为 100%，或90-100%，或其中任何的范围或值。但是，应当理解的是，探针和引物中较小的序列 变化可以通过降低杂交和/或洗涤介质的严格性来补偿。
[0189] RNA或DNA的扩增方法在本领域中是公知的，并且可以基于本文中提供的教导 和指导根据本发明使用，而无需过度试验。已知的DNA或RNA的扩增方法包括但不限 于聚合酶链式反应（PCR)和相关的扩增方法(参见例如授予Mullis等人的美国专利号 4, 683, 195、4, 683, 202、4, 800, 159、4, 965, 188 ;授予 Tabor 等人的美国专利号 4, 795, 699 和4, 921，794 ;授予Innis的美国专利号5, 142,033 ;授予Wilson等人的美国专利号 5, 122,464 ;授予Innis的美国专利号5,091，310 ;授予Gyllensten等人的美国专利号 5, 066, 584 ;授予Gelfand等人的美国专利号4, 889, 818 ;授予Silver等人的美国专利号 4, 994, 370 ;授予Biswas的美国专利号4, 766, 067 ;授予Ringold的美国专利号4, 656, 134) 和使用作为用于双链DNA合成的模板的目标序列的反义RNA的RNA介导扩增(授予Malek等 人的美国专利号5, 130, 238,商标名为NASBA)，参考文献的全部内容经此引用并入本文(参 见例如Ausubel,上文）。
[0190] 例如，PCR技术可以用于扩增本发明的多核苷酸序列和直接来自基因组DNA或 cDNA文库的相关基因。PCR和其它体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达蛋白质的 核酸序列、制造用作检测样品中所需mRNA的存在、用于核酸测序或用于其它目的的探针 的核酸。通过体外扩增方法足以指导技术人员的技术实例可以在下列参考文献中找到： Ausubel,上文，以及Mullis等人，美国专利号4,683,202 (1987);和Ihnis等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds, Academic Press Inc. , San Diego, Calif. (1990)。用于基因组PCR扩增的市售试剂盒在本领域中是已知的。参见例如 Advantage?-GC Genomic PCR Kit (Clontech)QT4 基因 32 蛋白（Boehringer Mannheim) 可以用于提高长PCR产物的产率。
[0191] 还可以通过已知方法通过直接化学合成来制备本发明的分离的核酸(参见例如 Ausubel等人，上文)。化学合成通常产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列的杂交，或 通过使用单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合，转化成双链DNA。本领域技术人员将认识 至IJ，虽然DNA的化学合成限于约100个或更多个碱基的序列，但是通过较短序列的连接可以 获得更长的序列。通过重叠寡核苷酸的组装来合成更长的序列在本领域中是常规的。
[0192] 本发明进一步提供了包含本发明的核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如， 编码本发明的抗体或其抗原结合部分的cDNA或基因组序列，可以用于构建重组表达盒，该 重组表达盒可以被引入至少一个所需宿主细胞中。重组表达盒通常包含可操作地连接至转 录起始调控序列的本发明的多核苷酸，所述转录起始调控序列将指导多核苷酸在预期的宿 主细胞中转录。可以使用异源和非异源（即内源）启动子来指导本发明核酸的表达。
[0193] 在一些实施方案中，可以在本发明的非异源形式的多核苷酸的合适位置中（上游、 下游或内含子中）引入用作启动子、增强子或其他元件的分离的核酸，以上调或下调本发明 的多核苷酸的表达。例如，可以通过突变、删除和/或置换在体内或体外改变内源性启动 子。
[0194] 本发明还涉及包括本发明的分离的核酸分子的载体、用该重组载体遗传工程化的 宿主细胞和如本领域中公知的那样通过重组技术生产至少一种抗体或其抗原结合部分。参 见例如Ausubel等人，上文。可以任选将该多核苷酸接合到含有可选标记的载体上用于在 宿主中繁殖。通常，在沉淀物如磷酸钙沉淀物中或在与带电荷的脂质的复合物中引入质粒 载体。如果载体是病毒，可以使用合适的包装细胞系在体外将其包装并随后转导到宿主细 胞中。
[0195] DNA插入物应当可操作地与合适的启动子连接。表达构建体将进一步含有用于 转录起始、终止的位点，并且在转录区中，含有用于翻译的核糖体结合位点。通过构建体表 达的成熟转录本的编码部分优选将包含适当位于待翻译的mRNA末端的开始和终止密码子 (例如UAA、UGA或UAG)上的翻译起始，UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞的表达。
[0196] 表达载体优选但任选包括至少一个可选择的标记。此类标记包括但不限于对真 核细胞培养具有抗性的氨甲蝶呤（MTX)、二氢叶酸还原酶（DHFR，美国专利号4, 399, 216 ; 4, 634, 665 ;4, 656, 134 ;4, 956, 288 ;5, 149, 636 和 5, 179, 017)、氨苄青霉素、新霉素 (G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶（GS，美国专利号5, 122,464 ;5, 770, 359和5, 827, 739)， 以及对于在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中的培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因（上 述专利经此引用全文并入本文)。用于上述宿主细胞的合适的培养基和条件在本领域中是 已知的。合适的载体对于技术人员是显而易见的。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介 导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法实现将载体构建体 引入宿主细胞中。此类方法描述在本领域中，例如Ausubel,上文，第1、9、13、15、16章。
[0197] 可以以改进的形式，例如融合蛋白，来表达本发明的至少一种抗体或其抗原结合 部分，并且不仅可以包括分泌信号，而且还包括附加的异源功能区。例如，可以将附加氨基 酸(特别是带电荷的氨基酸)区，添加至抗体或其抗原结合部分的N-端以提高纯化过程或随 后的操作和存储过程中在宿主细胞中的稳定性和持久性。此外，可以将肽部分添加到本发 明的抗体或其抗原结合部分中以促进纯化。在抗体或其至少一个片段的最终制备之前，可 以将此类区除去。此类方法描述在许多标准实验手册中，例如Ausubel，上文，第16、17和 18章。本领域普通技术人员可以得知可用于编码本发明的蛋白质的核酸的表达的许多表达 系统。
[0198] 可选地，通过在含有编码本发明的抗体或其抗原结合部分的内源DNA的宿主细胞 中启始(通过操纵)，可以在宿主细胞中表达本发明的核酸。此类方法在本领域中是公知的， 例如如美国专利号5, 580, 734、5, 641，670、5, 733, 746和5, 733, 761中描述，其通过参考全 文并入本文。
[0199] 用于生产抗体、其特定部分或变体的说明性细胞培养物是哺乳动物细胞。哺乳动 物细胞系统通常是单层细胞的形式，尽管也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。 本领域已经研发了许多能够表达完整糖基化蛋白质的合适宿主细胞系，并且包括cos-ι (例 如 ATCCCRL1650)、C0S-7 (例如 ATCCCRL-1651)、HEK293、BHK21 (例如 ATCCCRL-10)、CH0 (例 如 ATCCCRL1610 )和 BSC-1 (例如 ATCCCRL-26 )细胞系、C0S-7 细胞、CH0K1SV 细胞、h印G2 细 胞、P3X63Ag8. 653、SP2/0-Agl4、293细胞、海拉细胞等等，其可以容易地获自例如American Type Culture Collection, Manassas, Va。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，例如骨髓 瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是CH0K1 (ATCC:CRL-9618)或CH0K1SV (例如Lonza Biologies)。
[0200] 用于这些细胞的表达载体包括一个或多个以下的表达控制序列，例如但不限于， 复制起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子，CMV启动子；美国专利号5, 168, 062 ; 5,385,839)，HSVtk启动子，pgk启动子(磷酸甘油酸激酶）启动子，EF-la启动子(美国专 利号5, 266, 491)，至少一种人免疫球蛋白启动子；增强子，和/或加工信息位点，如核糖体 结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点（例如，SV40大TAgpolyA添加位点）和转录终止 子序列。参见例如Ausubel等人，上文。用于生产本发明的核酸或蛋白质的其它细胞是已 知的和/或可获自例如美国典型培养物中心的细胞系和杂交瘤目录(WWW. atcc. org)或其 它已知或商业来源。
[0201] 使用真核宿主细胞时，通常将聚腺苷酸化或转录终止子序列参入到该载体 中。终止子序列的一个实例是来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。还可以包含 用于精确剪接转录本的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子（Sprague等 人，1983JVir 〇145773-81)。此外，如本领域已知的那样，可以将控制宿主细胞中复制的基因 序列参入到载体中。
[0202] 如将要看到的那样，本说明书使用术语" ％相同"来描述大量序列。要理解的是，术 语"％相同"指的是在特定区的两个序列的比较中，两个序列在相同位置具有特定数目的相 同残基。同一性水平可以使用具有缺省参数的CLUSTALW来确定。
[0203] 还应当指出的是，该序列与比较序列"至少95%相同"。在某些实施方案中，优选该 序列与比较序列至少96%或至少97%或至少98%或至少99%相同。
[0204] 本文中所用的与杂交条件相关的术语"中等严格"指的是在2XSSC缓冲液， 0. l%(w/v)SDS中在45°C至65°C温度下或等价条件下进行的杂交和/或洗涤。本文中所用 的与杂交条件相关的术语"高度严格"指的是在0. 1XSSC缓冲液，0. l%(w/v)SDS或更低盐 浓度中并在至少65 °C的温度下或等价条件下进行的杂交和/或洗涤。本文中提到特定水平 的严格性包括使用本领域技术人员已知的除SSC之外的洗涤/杂交溶液的等价条件。例如， 计算双链核酸的链分解时的温度(也称为熔融温度，或Tm)的方法在本领域是已知的。类似 于(例如在5°C内或在10°C内）或等于核酸的Tm的温度被认为是高度严格的。中等严格性 被认为在核酸的计算Tm的10°C至20°C内或10°C至15°C内。
[0205] 在整个说明书中，词语"包含"（或变形如"comprises"或"comprising"）将理解 为意味着包括所述要素、整体（integer)或步骤，或要素、整体或步骤的组，但不排除任何其 它要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。
[0206] 本说明书中提及的所有出版物经此引入并入本文。本说明书中已经包括的文献、 法案、材料、装置、论文等等的任何讨论仅是用于提供本
【发明内容】
的目的。并未视为允许这 些内容的任一或全部构成现有技术基础的一部分或者是本发明相关领域中的公知常识，如 在本申请的每个权利要求的 优先权日:之前，其存在于澳大利亚或别处。
[0207] 必须注意，如本说明书中所用的单数形式"一个"、"一种"和"该"包括复数指代物， 除非上下文另行明确指出。因此，例如，"一个"的提法包括单个以及两个或多个；"一种"的 提法包括单种以及两种或多种；"该"的提法包括单个以及两个或多个，等等。
[0208] 已经概括地描述了本发明，通过参考下列实施例将更容易理解本发明，下列实施 例以说明的方式提供，且不是限制性的。
[0209] 本发明的实施例
[0210] 一般方法
[0211] HEK293/pTT5 表达系统
[0212] 对于涉及HEK293E/pTT5表达系统的所有转染，HEK293E细胞在完全细胞生长介 质（1 升的 F17 培养基（Invitrogen)，9 毫升的 PluronicF68 (Invitrogen)，含有 20%(w/v) TryptoneNI (Organotechnie)和 50 μ L/100mL 培养液的 Geneticin (50mg/mL, Invitrogen) 的2mMGlutamine)中培养。在转染之前的那天，通过离心采集细胞并重新悬浮在不含 Geneticin的新鲜培养基中。第二天，将DNA与市售转染试剂混合，并将该DNA转染混合物 逐滴添加到培养物中。在没有Geneticin的情况下将培养物在37°C、5%C02和120rpm下培 养整夜。第二天，每500毫升培养物添加12. 5毫升的Tryptone和250微升的Geneticin。 该培养物在37°C、5%C02和120rpm下培养七天，随后收集上清液并纯化。
[0213] CDld/P2M 蛋白质
[0214] 使用与编码β2Μ的DNA表达构建体（SEQ ID N0:20)共转染的、编码具有位于HIS 标签的C端（SEQ ID N0:19)的CDld胞外域的DNA表达构建体，在哺乳动物的HEK293E/pTT5 表达系统中生产人⑶Id/ β 2M。通过2000g下离心10分钟采集含有分泌的⑶Id/ β 2M蛋白 质的培养物上清液以除去细胞。使用His Trap TM HP柱（GE Healthcare)经His8亲和标 签由该上清液提纯该CDld/β 2M蛋白质复合物。洗脱的蛋白质用HiL〇adl6/60Superdex200 制备级柱（GEHealthcare)缓冲交换到PBS中，并在HiLoad26/60Superdex200制备级柱 (GE Healthcare)上通过凝胶过滤分离?50kDa的级份。以类似方式单独制造人β 2M并 纯化。采取类似的纯化方法纯化其它物种的CDld (例如小鼠 CDld)和CDld的合成构建体 (如 hCDldmu 和 mCDldmu)。
[0215] 为了确定食蟹猴⑶Id的序列，从Biochain获得来自猴脾脏的cDNA。下列底物用 于扩增基于猕猴 CDld mRNA 的 CDld DNA (PubMed 登录号：NM_001033114):
[0216] FI-GTGCCTGCTGTTTCTGCTG (SEQ ID NO:120)
[0217] R1-TGCCCTGATAGGAAGTTTGC (SEQ ID NO:121)
[0218] 建立扩增了 lkbDNA产物的PCR。使用M13正向与反向引物将该DNA连接到 pGEM-TEasy (Promega)中并测序。该序列与称猴⑶Id (UniProt登录号：Q4AD67)的序列 比对并发现是相同的。随后合成该基因序列，添加 C端HIS标签，亚克隆到pTT5载体中并 使用该ΗΕΚ-293Ε/ρΤΤ5系统表达。使用Ni层析经引入的HIS标签纯化该蛋白质。
[0219] 对于噬菌体展示试验，使用EZ-linkSulfo-NHS-LC-生物素试剂盒（Pierce)以3:1 的biotin:⑶Id/β 2M比率将重组人⑶Id/β 2M生物素化。使用具有3. 5kDa分子量筛截 的Slide-A-Lyzer透析盒通过在PBS中的透析从蛋白质制剂中除去游离生物素。对于活动 (campaign) 2,也如上所述制备生物素化重组食蟹猴⑶Id/ β 2M。
[0220] 表达抗体的载体的构建
[0221] 表达具有人恒定区(人IgG4重链CH1、铰链、CH2和CH3结构域）（例如在S228P处 具有置换的NCBI登录号P01861)的VH氨基酸链。这可以通过将氨基酸序列反向翻译为 DNA序列并随后重新合成和组装合成的寡核苷酸来实现。在基因合成后，将整个序列亚克隆 到PTT5重链载体的多个克隆位点中（Durocher, Y.等人，2002, NucleicAcidsRes, 30, E9)。 通过将该序列亚克隆到pTT5轻链载体的多个克隆位点中，表达具有人kappa或lambda轻 链恒定区(如NCBI登录号AAI10395和C6KXN3)的VL氨基酸链。
[0222] 抗体的表达和纯化
[0223] 将重链和轻链DNA载体共转染到HEK293/pTT5表达系统中并培养七天。在装载到 HiTrapProteinA柱（5毫升，GEHealthcare)上之前将获自这些转染的上清液调节至ρΗ7· 4。 该柱用50毫升的1XPBS (ρΗ7. 4)洗涤。使用0. 1Μ柠檬酸ρΗ2. 5进行洗脱。洗脱的抗体用 Zeba脱盐柱（Pierce)脱盐到1XPBS (ρΗ7·4)中。该抗体用SDS-PAGE分析。抗体浓度使用 BCA测定试剂盒（Pierce)测定。
[0224] 实施例1--生成抗⑶Id抗体
[0225] 噬菌体展示
[0226] 从首次用于试验的噬菌粒文库中分离与人和食蟹猴CDld/ β 2M结合的FAbs。
[0227] 在两次淘选"活动"（即具有不同试剂或淘选条件的分离的噬菌体展示试验）过程 中从噬菌体展示文库中分离抗⑶Id/ β 2MFAbs。一般试验规程遵循Marks等人概述的方法 (Marks, J. D. &Bradbury, A. , 2004, MethodsMolBiol, 248, 161-76)〇
[0228] 各噬菌体展示活动包含三轮淘选。对每一轮，通过与封闭缓冲液(在磷酸盐缓冲盐 水中的5%脱脂奶，pH7. 4) 1:1混合并在室温下培育1小时，将?IX 1013噬菌体粒子封闭。 封闭的噬菌体文库随后通过用100微升链霉亲和素偶联的Dynabead (Invitrogen)培育45 分钟来预排除链霉亲和素结合剂，将该链霉亲和素偶联的Dynabead如对文库所述进行封 闭。在培育步骤后将该珠粒（以及连接于其上的链霉亲和素结合剂）丢弃。
[0229] 通过捕获至链霉亲和素偶联的Dynabead (Invitrogen)表面来制备重组⑶Id/ β2Μ抗原用于淘选。为此，10-100皮摩尔的生物素化⑶Id/β2Μ用100微升珠粒在室温下 培育45分钟。将所得CDld/ β 2Μ-珠粒复合物用PBS洗涤以除去游离的CDld/ β 2Μ并随即 用于随后的淘选反应。
[0230] 通过将封闭的和预排除的文库与该⑶Id/ β 2Μ-珠粒复合物在1. 5毫升微量离心 管中混合并在室温下旋转2小时来进行文库淘选。用一系列洗涤除去非特异性结合的噬菌 体。每次洗涤包括用磁架将珠粒复合物由溶液中牵引到管壁上，吸取上清液，并随后将珠粒 再次悬浮在新鲜的洗涤缓冲液中。该洗涤用PBS洗涤缓冲液(含有0. 5%脱脂奶的PBS)或 PBS-T洗涤缓冲液(含有0. 05%吐温20 (Sigma)和0. 5%脱脂奶的PBS)重复多次。通过用 〇. 5毫升的100mM三乙胺（TEA)(Merck)在室温下培育20分钟，将洗涤过程后保持结合的噬 菌体从⑶Id/ β 2M-珠粒复合物中洗脱。通过添加0. 25毫升的lMTris-HClpH7. 4 (Sigma) 来中和洗脱的"输出"噬菌体。
[0231] 在第一和第二轮淘选结束时，将该输出噬菌体添加到10毫升指数增长的TG1 大肠杆菌(酵母-胰胨（YT)生长培养基）的培养物中，并通过在37°C下在无摇振的情况 下培育30分钟并随后在250rpm的摇振下30分钟以感染该细胞。将编码该噬菌体展 示输出的噬菌粒随后根据标准试验计划再活化（rescued)作为噬菌体粒子（Marks, J. D.&Bradbury，A.，2004, Methods Mol Biol, 248, 161-76)。在第三轮淘选结束时，用输出噬 菌体感染该TG1细胞，但是细胞以足够的稀释度在固体YT生长培养基(补充有2%的葡萄糖 和100微克/毫升的羧苄青霉素）上铺板以制备离散的大肠杆菌菌落。这些菌落用于接种 1毫升液体培养物以允许表达用于筛选试验的FAb片段。
[0232] 用于⑶Id结合的基于ELISA的筛选
[0233] 各单独的大肠杆菌菌落用于表达FAb，筛选该FAb的⑶Id/ β 2M结合活性。将菌 落接种到96孔深孔板（Costar)中的1毫升ΥΤ起子培养物(补充有100微克/毫升的羧苄 青霉素和2%的葡萄糖)并在以650rpm摇振的情况下在30°C下培育整夜。这些起子培养物 以1:50稀释为1毫升表达培养物(仅用100微克/毫升的羧苄青霉素补充的YT)并生长至 600nm下0. 8-1. 0的光学密度。通过添加异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷至ImM的最终浓 度来诱导FAb表达。培养物在20°C下培育16小时。
[0234] 通过离心（2500g，10分钟）采集细胞并进行周质提取来制备FAb样品。将细胞 聚合体再悬浮于75微升提取缓冲液（30mM Tris-HCl，pH8.0，lmM EDTA，20%蔗糖）中并 以lOOOrpm在4°C下摇振10分钟。通过添加225微升的H20,在lOOOrpm下摇振1小时 并通过在2500g下离心10分钟以澄清提取物，由此完成提取物制备。将上清液回收，经 AcropreplOOkDa分子量筛截板（Pall Corporation)过滤并在4°C下储存直到下一次试验 需要的时候。
[0235] 为了通过ELISA筛选由噬菌体展示产生的潜在人⑶Id-结合剂，将人⑶Id/β 2M (如上所述在ΗΕΚ293Ε细胞中制得并生物素化）以1微克/毫升捕获在涂布链霉亲和素的 ELISA板（Pierce)上。随后洗涤该板并将单独的FAb样品(如上所述制备)添加到ELISA板 上的单个孔中。让FAb在室温下结合捕获的⑶Id/β 2M两小时，随后用PBS-T洗涤三次和 用PBS洗涤三次。使用针对融合到FAb重链C端的V5亲和标签（Sigma)的HRP-缀合抗体 检测结合的FAb。检测抗体在室温下培育1.5小时。洗涤该板以除去未结合的抗体，并通 过用50微升3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺（KPL)培育并用50 μ L1MHC1猝灭以显现测定信号。 测定信号使用酶标仪（Bio-Tek)在A450nm下读数。结果表示为原始A450nm值，其中任何 大于平均测定背景2倍的信号定义为"阳性"。
[0236] 在后面的测定中，制备单独涂布未生物素化的人⑶Id/β 2M、食蟹猴⑶Id/β 2M或 的β2Μ的MaxisorpELISA板（Nunc)以检测FAb样品的结合。洗漆和检测步骤如上所述。
[0237] 对CD 1 d/ β 2M结合的FAb的SPR基筛选
[0238] 使用BIAcore4000Biosensor (GEHealthcare)以单一浓度分析物通过测定进 行SPR筛选。使用标准胺偶联化学在pH5. 5下在四个流动池各个的点1、2、4和5上将约 10, 000RU 的抗 V5 抗体（Invitrogencat#R960CUS)固定在 CM5Series S Sensor 芯片上，留 下点3未修饰。所用运行缓冲液是HBS-EP+ (GE Healthcare)，所有相互作用在25°C下测 得，并将数据收集速率设定为10Hz。在各流动池的点1或5上以10微升/分钟的流速捕获 100秒(通常捕获约200RU的FAb)之前，将V5-标记的FAbs的粗周质制剂在运行缓冲液中 稀释两倍。在短暂的稳定期后，人或食蟹猴CDld/ β 2M同时以30微升/分钟的流速在所有 四个流动池的所有点上通过100秒。在使用lOOmM磷酸的30秒脉冲再生回抗V5抗体之前 测量相互作用的解离100秒。产生的传感图参考每个流动池的相邻抗V5抗体点，并用1:1 朗缪尔方程拟合以确定ka、kd和KD。
[0239] 噬菌体展示活动的结果
[0240] 通过SPR测定对于与人和食蟹猴⑶Id/ β 2M的结合筛选了超过4400个克隆。发 现总计51种FAbs具有对人和食蟹猴CDld的高选择性。
[0241] 实施例2--证实IgG结合CDld
[0242] 将人-食蟹猴⑶Id反应性FAb转化为IgG4格式，将其如一般方法中所述表达并 纯化。使用实施例1中描述的改进版本的测定通过ELISA和SPR测试纯化抗体与人和食蟹 猴⑶Id的结合。简而言之，对于ELISA测定，用合适的抗原以1微克/毫升涂布Maxisorp ELISA板（Nunc)。随后洗涤该板，并将纯化的IgG样品添加到ELISA板的单个孔中。让IgG 与捕获的⑶Id/β 2M在室温下结合一小时，并随后用PBS-T洗涤三次和用PBS洗涤三次。使 用针对人Fc (Sigma)的HRP-缀合抗体检测结合的IgG。检测抗体在室温下培育30分钟。 洗涤该板以除去未结合的抗体，并通过用50微升3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（KPL)培育并 用50μ?1Μ HC1猝灭以显现测定信号。测定信号使用酶标仪（Bio-Tek)在A450nm下读数。 结果表示为原始A450nm值，其中任何大于平均测定背景2倍的信号定义为"阳性"。
[0243] 还使用Biacore T100生物传感器（GE Healthcare)对纯化抗体进行全动力学表 征（full kinetic)。在Biacore T100生物传感器的流动池（FC)1和FC2 (或者FC3和 FC4)中使用标准胺偶联化学将约10, 000RU的抗人IgG (Invitrogen cat#H10500)固定在 CM5Series S Sensor芯片上。所用运行缓冲液是HBS-EP+ (GE Healthcare)，相互作用在 25°C下测得。将峰值纯化IgG在运行缓冲液中稀释至10nM，并以10微升/分钟的流速在 FC2 (或者FC4)上捕获以捕获50-80RU的IgG。在适当的稳定期后，该目标一人或食蟹猴 CDld/ β 2M在33. 3nM至0. 4nM (使用三倍稀释的CDld/ β 2M)浓度下以60微升/分钟的流 速通过FC1和FC2 (或FC3和FC4)。用于缔合的接触时间为120秒，对于最高浓度在20分 钟测得解离，对该系列中所有其它浓度在240秒测得解离。从FC1中减去来自FC2的传感 图数据，缓冲液仅为对照物。用1:1朗缪尔方程拟合曲线以生成ka、kd和KD值(表1)。
[0244] 表1 :噬菌体展示抗体的ELISA和SPR结果
[0245]
【权利要求】
1. 结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合 部分与选自401. 11和402. 8的至少一种抗体竞争与⑶Id的结合。
2. 如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原 结合部分与抗体401. 11. 158竞争与⑶Id的结合。
3. 结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合 部分结合与选自401. 11和402. 8的至少一种抗体所结合的表位相同的⑶Id表位。
4. 如权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位包含SEQ ID NO: 116 的残基 141 至 143。
5. 如权利要求3或4所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位包含SEQ ID NO: 116的残基87至93和141至143。
6. 结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合 部分包含具有选自 SEQ ID 勵1、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、40、41、42、43、44和45的 序列和至少95%与之相同的序列的V H域。
7. 如权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述VH域的所述序列是 SEQIDN0:148*SEQIDN0:150。
8. 结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合 部分包含具有选自SEQ ID N02、4、6、46、49和62的序列和至少95%与之相同的序列的VL 域。
9. 如权利要求8所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述VL域的序列是SEQ ID NO:149 或 SEQ ID NO:4。
10. 结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合 部分包含VH域，所述V H域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述 CDR1 序列是 DYAMH (SEQ ID N0:124)或 GYYWS (SEQ ID N0:125)。
11. 如权利要求10所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR3序列是 DMCSSSGCPDGYFDS(SEQ ID N0:126)、DLCSSGGCPEGYFDS(SEQ ID N0:152)、DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID N0:153)、DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID N0:154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID N0:127)、 GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID NO:128),GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO:155),GEIYDFYKSYMDV (SEQ IDN0:156)、GEIYDFWKSYLDV(SEQIDN0:129)*GEIYDFYNSYMDV(SEQIDN0:130)。
12. 如权利要求10或11所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR2序 列是 TIIWNSAIIGYADSVKG (SEQ ID N0:131)、EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N0:132)、 EINPSGSTNYNPSLKS(SEQIDN0:133)*EINHAGSTNYNPSLKS(SEQIDN0:134)。
13. 结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合 部分包含VH域，所述V H域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述 CDR1 序列是 GFTFDDY (SEQ ID N0:135)或 GGSFSGY (SEQ ID N0:136)。
14. 如权利要求13所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR3序列是 DMCSSSGCPDGYFDS(SEQ ID N0:126)、DLCSSGGCPEGYFDS(SEQ ID N0:152)、DMCSSGGCPDGYFDS (SEQ ID N0:153)、DMCSSGGCPEGYFDS (SEQ ID N0:154)、GEIYDFWNSYMDV (SEQ ID N0:127)、 GEIYDFWKSYMDV (SEQ ID NO:128)、GEIYDFYKSYLDV (SEQ ID NO:155)、GEIYDFYKSYMDV (SEQ ID N0:156)、GEIYDFWKSYLDV (SEQ ID N0:129)或 GEIYDFYNSYMDV (SEQ ID N0:130)。
15. 如权利要求13或14所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR2序列是 IWNSAI(SEQIDN0:137)、NHSGS(SEQIDN0:138)、NPSGS(SEQIDN0:139)*NHAGS(SEQ ID NO:140)。
16. 结合人CDld的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合 部分包含八域，所述八域包含人FR1、FR2、FR3和FR4框架序列以及CDRUCDR2和CDR3序 列，并且其中所述CDR1序列是RASQHISSWLA(SEQIDN0:141)或ASSSGAVSSGNFPN(SEQID NO:142)。
17. 如权利要求16所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR3序列是 QQANRFPLT(SEQIDN0:143)*LLYFGDTQLGV(SEQIDN0:144)。
18. 如权利要求16或17所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR2序列是 AASSLQS(SEQIDN0:145)*SASNKHS(SEQIDN0:146)。
19. 如权利要求6至18中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离 的抗体或其抗原结合部分包含选自以下的VH和VL序列对：SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2、 SEQIDN0:23和SEQIDN0:46、SEQIDN0:24和SEQIDN0:47、SEQIDN0:5和SEQID N0:6、SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:26和 SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:27和SEQ IDN0:50、SEQIDN0:28和SEQIDN0:51、SEQIDN0:29和SEQIDN0:52、SEQIDN0:30 和 SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:34 和 SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:58、 SEQ ID NO :36 和 SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :37 和 SEQ IDNO :60、SEQ ID NO :38 和 SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:40 和 SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:41 和 SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:42 和 SEQIDN0:64、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4、SEQIDN0:7和SEQIDN0:4、SEQIDN0:8和 SEQIDN0:4、SEQIDN0:9和SEQIDN0:4、SEQIDN0:43和SEQIDN0:65、SEQIDN0:44 和 SEQ ID N0:66 与 SEQ ID N0:45 和 SEQ ID N0:67。
20. 如权利要求1至19中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离 的抗体或其抗原结合部分结合具有如使用基于细胞的效价测定测得为〇· 5ng/ml至20ng/ ml 的 EC50 的人 CDld。
21. 如权利要求1至20中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离 的抗体或其抗原结合部分包含人kappa链恒定区。
22. 如权利要求1至21中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离 的抗体或其抗原结合部分包含人lambda链恒定区。
23. 如权利要求1至22中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离 的抗体或其抗原结合部分包含IgGl或IgG4恒定区。
24. 如权利要求23所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗 原结合部分含有包含S228P突变的IgG4恒定区。
25. 如权利要求1至24中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离 的抗体或其抗原结合部分是抗体。
26. 如权利要求1至24中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离 的抗体或其抗原结合部分是Fab、F (ab) 2、scFv或结构域抗体。
27. 如权利要求1至26中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中修饰所述 抗体或其抗原结合部分以调节功能特性，所述功能特性选自抗体依赖性细胞毒性、补体依 赖性细胞毒性、血清半衰期、生物分布和与Fc受体结合。
28. 组合物，其包含如权利要求1至26中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分， 和药学上可接受的载体。
29. 分离的DNA分子，其编码如权利要求1至26任一项所述的分离的抗体或其抗原结 合部分。
30. 如权利要求29所述的分离的DNA分子，其中所述DNA分子的序列选自SEQ ID NO. 10至18和68至115或至少95%与之相同的序列或在中等至高度严格条件下与之杂交 的序列。
31. 转化细胞，其产生如权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
32. 如权利要求31所述的转化细胞，其中所述细胞用如权利要求29或30所述的DNA 分子转化。
33. 在人类对象中治疗涉及NKT细胞效应子功能的病况的方法，其包括向所述对象施 用如权利要求1至27中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分或如权利要求28所述 的组合物。
34. 如权利要求33所述的方法，其中所述病况选自牛皮癣、溃疡性结肠炎、原发性胆汁 性肝硬变、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝炎、自身免疫性肝炎、缺血再灌注损伤、与镰状细 胞病相关的肺部炎症或机能障碍、和哮喘。
35. 如权利要求1至27中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分用于制备用于治 疗涉及NKT细胞效应子功能的病况的药物的用途。
36. 检测样品中存在人或食蟹猴CDld的方法，所述方法包括使怀疑含有CDld的样品与 如权利要求1至27中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，在允许所述抗体或其抗 原结合部分结合CDld的条件下接触，以形成复合物并检测所述样品中所述复合物的存在。
37. 如权利要求36所述的方法，其中样品中的所述CDld是细胞膜结合的CDld。
38. 如权利要求1至27中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其用于治疗涉 及NKT细胞效应子功能的病况。
39. 检测细胞样品中人CDld阳性细胞的存在的方法，所述方法包括将细胞群体与如权 利要求1至27中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分接触，以允许所述抗体或其抗 原结合部分结合CDld阳性细胞以形成复合物，并检测所述抗体或其抗原结合部分-细胞复 合物的存在。
40. 如权利要求39所述的方法，其中所述细胞样品是外周血样品或细胞系样品。
41. 从多种CDld结合蛋白中选择特异性结合人CDld的CDld结合蛋白的方法，所述 ⑶Id结合蛋白与选自401. 1U402. 8和401. 11. 158的至少一种抗体竞争在⑶Id上的结合， 所述方法包括： 在足以允许CDld结合蛋白结合所述突变蛋白以形成CDld结合蛋白-人CDld突变蛋 白复合物和允许排除多种没有结合所述人CD 1 d突变蛋白的CD 1 d结合蛋白的条件下，使所 述多种⑶Id结合蛋白接触人⑶Id突变蛋白，在所述人⑶Id突变蛋白中SEQ ID NO: 116的 位置87至93和141至143的氨基酸已经被这些位置处的相应的小鼠氨基酸取代，并且从 所述排除的多种CDld结合蛋白中收集没有结合人CDld突变蛋白的CDld结合蛋白，其中所 述收集的⑶Id结合蛋白特异性结合人⑶Id并与选自401. 11、402. 8和401. 11. 158的至少 一种抗体竞争在⑶Id上的结合。
42.从多种CDld结合蛋白中选择特异性结合人CDld的CDld结合蛋白的方法，所述方 法包括： 在足以允许⑶Id结合蛋白结合h⑶ldmu以形成⑶Id结合蛋白-h⑶ldmu复合物和允 许排除多种没有结合hCDldmu的CDld结合蛋白的条件下，使所述多种CDld结合蛋白与其 中位于人⑶Id (SEQ ID N0116)的位置87至93和141至143处的氨基酸已经被这些位置 处的相应小鼠序列替代的h⑶ldmu (SEQIDNO: 119)接触，并从所述排除的多种⑶Id结合蛋 白中收集没有结合至所述hCDldmu的CDld结合蛋白，其中所述收集的CDld结合蛋白特异 性结合人CDld(SEQIDNO:116)或mCDldhu(SEQIDNO:118)。
【文档编号】C07K16/28GK104144700SQ201280050432
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2012年10月15日 优先权日:2011年10月14日
【发明者】J.K.纳姆比亚尔, L.D.波顿, A.克拉克, A.J.波, D.塔姆瓦基斯, G.科普斯达斯, A.G.多伊勒, M.波拉德, H.穆斯塔发 申请人:特瓦制药澳大利亚私人有限公司