专利名称：一种基于抗原-抗体反应的可控的金纳米棒组装的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于抗原-抗体反应的可控的金纳米棒组装的方法，属于纳米免
疫技术领域。
背景技术：
金纳米棒由于具有丰富的表面等离子共振所衍生出来的许多性质，当今分散的金 纳米棒广泛的应用于许多领域。例如用于光学数据存储、纳米传感器、生物成像、控制基因 输送和光热治疗肿瘤等。 抗原-抗体免疫反应是最为常见的生物识别反应之一，常常应用于免疫反应。当 今，科学和技术的发展要求用到组装的金纳米棒，一维、二维，甚至三维功能化结构。因为组 装的金纳米棒不仅拥有单一金纳米棒的性质，更衍生出许多群体性质。这些光学和电子学 的性质是单个金纳米棒所不具有的，这些性质的产生是由于组装后的金纳米棒每个单体和 其相邻的金纳米棒所作用产生的。 金纳米棒组装有2种方式(1)端面对端面组装，(2)侧面靠侧面组装。组装的方 法主要是通过静电作用或共价偶联；通过核酸分子的杂交；金纳米棒上修饰高聚物在选择 性溶剂下自我作用；最后就是通过生物识别的方法，如生物素_亲和素，抗原_抗体作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作方法简单并快速的金纳米棒实现可控组装的方法， 用于端面对端面组装及侧面靠侧面组装。 通过不同方法将抗原抗体定向的偶联到金纳米棒的端面或侧面，在通过抗原抗体
间的识别反方实现金纳米棒的组装。实验以庆大霉素抗原及抗体来阐述。包括以下内容 (1)庆大霉素抗体及包被原与金纳米棒的侧面偶联； (2)金纳米棒在抗原抗体作用下的侧面靠侧面组装； (3)抗体与金纳米棒的顶端偶联修饰； (4)包被原与金纳米棒的顶端偶联修饰； (5)金纳米棒在抗原抗体作用下的端面对端面的组装。
本发明的技术方案一种基于抗原-抗体反应的可控的金纳米棒组装的方法，包 括金纳米棒侧面组装或金纳米棒端面组装；
(l)金纳米棒侧面组装 a抗体修饰金纳米棒100ii g/mL的庆大霉素抗体O. 5mL逐滴加入用0. lmol/L 的碳酸钾预调至pH 8. 5-8.8、0. 5mL、2n mol/L金纳米棒溶液中，室温震荡混匀，37。C反应 lh，反应结束6000rpm离心20min，去除未结合的抗体，重悬在pH 7. 4、含0. 5%聚乙二醇 PEG20000的0. 01mol/L PBS中，制得庆大霉素抗体修饰的金纳米棒探针；
b.包被原修饰金纳米棒方法与抗体修饰金纳米棒偶联类似，100 ii g/mL的庆大 霉素包被原O. 5mL逐滴加入用0. lmol/L的盐酸预调至pH5、0. 5mL、2n mol/L金纳米棒溶液中，室温震荡混匀，37t:反应lh，反应结束6000rpm离心20min，去除未结合的包被原，重悬 在pH 7. 4、含0. 5% PEG20000的0. Olmol/L PBS中，制得庆大霉素包被原修饰的金纳米棒 探针； c.在抗原-抗体作用下的金纳米棒侧面靠侧面组装 10 ii L修饰庆大霉素包被原的金纳米棒溶液中加入10 ii L修饰庆大霉素抗体的金 纳米棒溶液，漩涡混匀，37t:孵育0. 5h后反应结束，取10 ii L反应液稀释5倍后透射电镜表 征产物； 或(2)金纳米棒端面组装
a.抗体的修饰 抗体的修饰采用碳二亚胺法进行硫辛酸和庆大霉素抗体的结合，操作步骤如下
①含1. 625mg硫辛酸的乙醇溶液0. 3mL与0. 4mL的庆大霉素抗体混合；
②将75 ii L的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述步骤①溶液中后室温 反应4h ; ③用pH 7. 4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液；
④将硫辛酸修饰的庆大霉素抗体放在fC备用；
b.抗体修饰金纳米棒端面 采用晶种生长法合成金纳米棒首先要经过7500rpm离心15min去除溶液中多余 的Vc、 AgN03和小的球形粒子金纳米棒后，利用pH 3. 8、含有0. 1%聚乙二醇PEG20000的 0. 005mol/L十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液进行重悬，重悬液用lmol/L HC1调整至pH 3. 8，在金纳米棒的制备过程中CTAB起着非常关键的作用，CTAB主要是分布在金纳米棒的 侧面从而金纳米棒的侧面带有正电荷而金纳米棒的端面的分布很少，因此采用硫辛酸修饰 的抗体会修饰到金纳米棒的端面而非侧面上。0. 5mL、2n mol/L重悬后的金纳米棒溶液GNRs 逐滴滴加到由50 ii L稀释到lmL的硫辛酸修饰的庆大霉素抗体稀释液中，室温搅拌反应4h， 反应结束后6000rpm离心10min，运用pH 3. 8、含有0. 1% PEG20000的0. 005mol/LCTAB溶 液lmL中进行重分散，用该溶液洗涤两遍，最后用pH3. 8、含0. 1% PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液50 ii L进行重分散，此偶联物置于4t:保存；
c.包被原的修饰 包被原的修饰采用碳二亚胺法进行硫辛酸和包被原的结合，步骤如下
①含1. 625mg的硫辛酸的乙醇溶液0. 3mL与0. 2mL的庆大霉素包被原溶液混合；
②将75 ii L的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述步骤①溶液中后室温 反应4h ; ③用pH 7. 4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换液3次；
④将硫辛酸修饰后的庆大霉素包被原放在4t:备用；
d.包被原修饰金纳米棒端面 包被原和金纳米棒的偶联与(b)抗体和金纳米棒的偶联相似，只是在包被原的量 上有区别，硫辛酸修饰的庆大霉素包被原60iiL用940iiL的pH 3.80、含有0. 1%PEG20000 的005mol/L CTAB溶液进行稀释； 将pH 3. 8、0. 5mL、2n mol/L重悬后的金纳米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修饰 的庆大霉素包被原的稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心10min，运用pH3. 8、含有0. 1 % PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液lmL中进行重分散，用该溶液洗涤两遍， 最后用pH 3. 8、含有0. 1 % PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液50 y L进行重分散，此偶联
物置于4t:保存； e.在抗原-抗体作用下的金纳米棒端面对端面的组装 10 L硫辛酸修饰的庆大霉素包被原的金纳米棒溶液中加入10 L硫辛酸修饰庆 大霉素抗体的金纳米棒溶液，漩涡混匀，37t:孵育0. 5h后反应结束，取lOii L反应液稀释5 倍后透射电镜表征产物。 本发明的有益效果本发明提供了一种新的金纳米棒组装的方法，通过不同方法 将抗原抗体定向的偶联到金纳米棒的端面或侧面，在通过抗原抗体间的识别反方实现金纳 米棒的组装。组装过程在液体环境中反应，操作方法简单，条件温和并快速的实现金纳米棒 的可控组装，在一定时间内就能生成大规模的组装产物。
图1基于抗原-抗体反应的组装金纳米棒的透射电镜图。A、金纳米棒的侧面对侧 面组装，B、金纳米棒的端面对端面组装。 图2基于抗原_抗体反应的组装金纳米棒的紫外可见图。
具体实施例方式
实施例1庆大霉素抗体及包被原与金纳米棒的侧面偶联 a.抗体与金纳米棒偶联0. 5mL、 100 ii g/mL的庆大霉素抗体逐滴加入用0. lmol/L 的碳酸钾预调至pH 8. 5-8. 8的0. 5mL、2n mol/L金纳米棒溶液中，室温震荡混匀，37"反应 lh，反应结束6000rpm离心20min，去除未结合的抗体，重悬在0. 01mol/L、pH 7. 4的PBS中 (含0. 5% PEG2000)，制得庆大霉素抗体修饰的金纳米棒探针； b.包被原与金纳米棒偶联方法与抗体与金纳米棒偶联类似，O. 5mL、100iig/mL 的庆大霉素包被原逐滴加入用0. lmol/L的盐酸预调至pH 5、0. 5mL、2n mol/L的金纳米棒 溶液中，室温震荡混匀，37t:反应lh，反应结束6000rpm离心20min，去除未结合的包被原， 重悬在0. 01mol/L、 pH 7. 4的PBS中(含0. 5% PEG20000)，制得庆大霉素包被原修饰的金 纳米棒探针； 实施例2在抗原抗体作用下的金纳米棒侧面靠侧面组装 10 L修饰庆大霉素包被原的金纳米棒溶液中加入10 L修饰庆大霉素抗体的金 纳米棒溶液，漩涡混匀，37t:孵育0. 5h后反应结束，取10 L反应液稀释5倍后透射电镜表 征产物。 实施例3抗体与金纳米棒的顶端偶联修饰
A.抗体的修饰 抗体的修饰采用碳二亚胺法进行硫辛酸和抗体的结合，具体操作步骤如下
①0. 3mL的硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1. 625mg)与0. 4mL的抗体混合。
②将75 ii L的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h。
③用pH 7. 4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液。
④将修饰后的抗体放在fC备用。
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B.抗体和金纳米棒端面偶联 采用晶种生长法合成金纳米棒首先要经过7500rpm离心15min去除溶液中多余的 Vc、 AgN03和小的球形粒子金纳米棒后利用pH 3. 8、0. 005M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 含有O. 1%聚乙二醇(PEG)的溶液进行重悬。重悬液的pH值用lmol/L HC1进行调整。在金 纳米棒的制备过程中CTAB起着非常关键的作用。CTAB主要是分布在金纳米棒的侧面从而 金纳米棒的侧面带有正电荷而金纳米棒的端面的分布很少，因此采用硫辛酸修饰的抗体会 修饰到金棒的端面而非侧面上。0. 5mL重分散的2n mol/L GNRs逐滴滴加到由50 y L修饰 后抗体稀释到lmL的抗体的稀释液中。室温搅拌反应4h。反应结束后6000rpm离心10min， 运用lmL的0. 005M CTAB(pH 3. 8)含有0. 1 % PEG20000的溶液进行重分散。用该溶液洗 涤两遍。最后用50 ii L的0. 005M CTAB(pH 3. 8)含有0. 1% PEG20000的溶液进行重分散。
此偶联物置于4t:保存。 实施例4包被原与金纳米棒的顶端偶联修饰
A.包被原修饰 包被原的修饰采用碳二亚胺法进行硫辛酸和包被原的结合，具体操作步骤如下
①0. 3mL的硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1. 625mg)与0. 2mL的庆大霉素包被原 溶液混合。 ②将75 ii L的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述溶液中后室温反应4h。
③用pH 7. 4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换液3次。
④将修饰后的包被原放在4t:备用。 B.包被原和金纳米棒端面偶联 包被原和金纳米棒的偶联与抗体和金纳米棒的偶联相似，只是在包被原的量上有 区别，即加入的包被原60 y L后用940 ii L的0. 005M CTAB(pH 3. 8)含有0. 1% PEG20000的
溶液进行稀释。 将pH 3. 8、0. 5mL、2n mol/L重悬后的金纳米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修饰 的庆大霉素包被原的稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心10min，运用pH 3. 8、含有0. 1 % PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液lmL中进行重分散，用该溶液洗涤两遍， 最后用pH 3. 8、含有0. 1 % PEG20000的0. 005mol/L CTAB溶液50 y L进行重分散，此偶联
物置于4t:保存。 实施例5在抗原抗体作用下的金纳米棒端面对端面的组装 10 ii L修饰庆大霉素包被原的金纳米棒溶液中加入10 ii L修饰庆大霉素抗体的金 纳米棒溶液，漩涡混匀，37t:孵育0. 5h后反应结束，取10 ii L反应液稀释5倍后透射电镜表 征产物。
权利要求
一种基于抗原-抗体反应的可控的金纳米棒组装的方法，其特征是包括金纳米棒侧面组装或金纳米棒端面组装；(1)金纳米棒侧面组装a.抗体修饰金纳米棒100μg/mL的庆大霉素抗体0.5mL逐滴加入用0.1mol/L的碳酸钾预调至pH 8.5-8.8、0.5mL、2n mol/L金纳米棒溶液中，室温震荡混匀，37℃反应1h，反应结束6000rpm离心20min，去除未结合的抗体，重悬在pH 7.4、含0.5％聚乙二醇PEG20000的0.01mol/L PBS中，制得庆大霉素抗体修饰的金纳米棒探针；b.包被原修饰金纳米棒100μg/mL的庆大霉素包被原0.5mL逐滴加入用0.1mol/L的盐酸预调至pH 5、0.5mL、2n mol/L金纳米棒溶液中，室温震荡混匀，37℃反应1h，反应结束6000rpm离心20min，去除未结合的包被原，重悬在pH 7.4、含0.5％PEG20000的0.01mol/L PBS中，制得庆大霉素包被原修饰的金纳米棒探针；c.在抗原-抗体作用下的金纳米棒侧面靠侧面组装10μL修饰庆大霉素包被原的金纳米棒溶液中加入10μL修饰庆大霉素抗体的金纳米棒溶液，漩涡混匀，37℃孵育0.5h后反应结束，取10μL反应液稀释5倍后透射电镜表征产物；或(2)金纳米棒端面组装a.抗体的修饰抗体的修饰采用碳二亚胺法进行硫辛酸和庆大霉素抗体的结合，操作步骤如下①含1.625mg硫辛酸的乙醇溶液0.3mL与0.4mL的庆大霉素抗体混合；②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述步骤①溶液中后室温反应4h；③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液；④将硫辛酸修饰的庆大霉素抗体放在4℃备用；b.抗体修饰金纳米棒端面采用晶种生长法合成金纳米棒首先要经过7500rpm离心15min去除溶液中多余的Vc、AgNO3和小的球形粒子金纳米棒后，利用pH 3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液进行重悬，重悬液用1mol/L HCl调整至pH 3.8，0.5mL、2n mol/L重悬后的金纳米棒溶液GNRs逐滴滴加到由50μL稀释到1mL的硫辛酸修饰的庆大霉素抗体稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心10min，运用pH 3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L CTAB溶液1mL中进行重分散，用该溶液洗涤两遍，最后用pH3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L CTAB溶液50μL进行重分散，此偶联物置于4℃保存；c.包被原的修饰包被原的修饰采用碳二亚胺法进行硫辛酸和包被原的结合，步骤如下①含1.625mg的硫辛酸的乙醇溶液0.3mL与0.2mL的庆大霉素包被原溶液混合；②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入上述步骤①溶液中后室温反应4h；③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换液3次；④将硫辛酸修饰后的庆大霉素包被原放在4℃备用；d.包被原修饰金纳米棒端面硫辛酸修饰的庆大霉素包被原60μL用940μL的pH 3.80、含有0.1％PEG20000的005mol/L CTAB溶液进行稀释；将pH 3.8、0.5mL、2n mol/L重悬后的金纳米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修饰的庆大霉素包被原的稀释液中，室温搅拌反应4h，反应结束后6000rpm离心10min，运用pH 3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L CTAB溶液1mL中进行重分散，用该溶液洗涤两遍，最后用pH 3.8、含有0.1％PEG20000的0.005mol/L CTAB溶液50μL进行重分散，此偶联物置于4℃保存；e.在抗原-抗体作用下的金纳米棒端面对端面的组装10μL硫辛酸修饰后的庆大霉素包被原的金纳米棒溶液中加入10μL硫辛酸修饰庆大霉素抗体的金纳米棒溶液，漩涡混匀，37℃孵育0.5h后反应结束，取10μL反应液稀释5倍后透射电镜表征产物。
全文摘要
一种基于抗原-抗体反应的可控的金纳米棒组装的方法，属于纳米免疫技术领域。本发明通过不同方法将抗原抗体定向的偶联到金纳米棒的端面或侧面，在通过抗原抗体间的识别反方实现金纳米棒的组装。组装过程在液体环境中反应，操作方法简单，条件温和并快速的实现金纳米棒的可控组装，在一定时间内就能生成大规模的组装产物。
文档编号B82B3/00GK101696972SQ20091003579
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者彭池方, 徐丽广, 朱颖越, 胥传来, 陈伟, 马伟 申请人:江南大学;