对反式-白藜芦醇特异性的抗体及其应用的制作方法

对反式-白藜芦醇特异性的抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测或测量样品中反式-白藜芦醇(tRV)的方法，所述方法包括：使待测试的样品与针对tRV的抗体或该抗体的抗原结合片段相接触；以及检测或测量被所述抗体或抗体片段结合的任何tRV。本发明还提供了针对反式-白藜芦醇的抗体。
【专利说明】对反式-白藜芦醇特异性的抗体及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及针对反式-白藜芦醇的抗体，以及采用这种抗体进行的反式-白藜芦 醇的测定。

【背景技术】
[0002] 业内对反式-白藜芦醇（tRV)有很大的兴趣。认为饮用红葡萄酒的保健功效大 部分归功于反式-白藜芦醇的存在。这些功效包括与食用红葡萄酒相关的心血管心脏病 (CVD)的低发病率。另外，对反式-白藜芦醇的潜在抗衰老效果、抗癌效果以及抗糖尿病效 果进行了不断的研究。考虑到这些潜在的功效，非常期望生产具有高反式-白藜芦醇水平 的食品、饮料和食品补充剂。
[0003] 尽管在与反式-白藜芦醇相关的数以千计的出版物中均表明对反式-白藜芦醇的 高度兴趣及其在酿酒和制药工业中的效果，但是迄今为止用于测量反式-白藜芦醇的唯一 方法仍然是高效液相色谱质谱法（HPLC-MS)。虽然HPLC-MS是一种特异且灵敏的测定方法， 但是该方法具有明显的限制，主要是由于进行HPLC-MS的设备的成本以及低通过率。例如， 尽管葡萄酒的制造商想在生产葡萄酒的各个阶段中都能够评估反式-白藜芦醇的水平，并 且还想生产具有高水平的反式-白藜芦醇的葡萄，但是在法国仅有少数的HPLC-MS设施，这 就意味着分析是昂贵且缓慢的，从而难以随时间对反式-白藜芦醇进行分析。


【发明内容】

[0004] 本发明提供了一种检测和测量tRV的快很多且更便宜的方式。提供的这种方法为 用于这种检测的基于抗体的途径。具体地，本发明提供了一种检测或测量样品中反式-白 藜芦醇（tRV)的方法，所述方法包括：
[0005] ⑴使待测试的样品与针对tRV的抗体或该抗体的抗原结合片段相接触；以及
[0006] (ii)检测或测量被所述抗体或抗体片段结合的任何tRV。
[0007] 本发明进一步提供了 ：
[0008] 针对tRV的抗体或该抗体的抗原结合片段；
[0009] 杂交瘤，所述杂交瘤选自：以登记号VKPM H-121保藏的杂交瘤，以登记号VKPM H-122保藏的杂交瘤，以及产生与以登记号VKPM H-121和登记号VKPM H-122保藏的杂交瘤 产生的抗体相同的杂交瘤；以及
[0010] 用于检测或测量反式-白藜芦醇（tRV)的试剂盒，其中，所述试剂盒包括所述抗体 或抗体片段。

【专利附图】

【附图说明】
[0011] 图1示出了在生成抗-tRV抗体中使用的tRV偶联物的合成。
[0012] 图 2 示出 了利用布鲁克（Bruker)AM300，tRV在 300MHz 下、在 DMS0-d6 中的1H-NMR 谱图。
[0013] 图3示出了 1-tRV在乙腈（0. 0004mg/ml)中的吸收谱图；2-RV-BSA偶联物（9)在 水中的吸收谱图；以及3-BSA在水（lmg/ml)中的吸收谱图。
[0014] 图4示出了来自小鼠#1的血清、RV-BSA(用于免疫的抗原）、0VA-卵清蛋白、具有 0VA的tRV的RV-0VA-偶联物的滴度。
[0015] 图5示出了测量来自小鼠#1血清的针对tRV抗体的竞争分析的结果。
[0016] 图6示出了通过使用来自杂交瘤2H9和杂交瘤1B1的单克隆抗体进行的tRV竞 争分析的结果。
[0017] 图7示出了校准曲线样品中tRV浓度与Kin的关系曲线。
[0018] 图8示出了在实施例6中提到的t-RSV半抗原合成示意图。
[0019] 图9示出了在实施例6中提到的酯2在⑶CI3中的1H NMR谱图（A)和酸3在⑶CI3 中的1H NMR谱图（B)。
[0020] 图10示出了在注射有实施例6中所述的t-RSV-BSA偶联物的Balb/c小鼠中的免 疫应答。

【具体实施方式】
[0021] 应当理解地是，所公开的方法的不同应用可根据本领域中的具体需要而进行调 整。还应当理解地是，本文中所使用的术语仅用于描述本发明的【具体实施方式】的目的，并不 用于限制。此外，在本说明书和所附权利要求书中，单数形式"一（a)"、"一（an)"以及"该 (the) "包括复数形式，除非上下文另有清楚地限定。因此，例如，"一种化合物"包括"多种 化合物";"一种多肽"，包括两种或更多种这种多肽等。无论是上文还是下文，本文所引用的 所有出版物、专利和专利申请均通过引用而整体并入本文中。当本文中使用术语"包括"时， 本发明还提供了 "由特定成分组成"或"基本由特定成分组成"的实施方式。
[0022] 本发明基于本发明人所提出的针对反式-白藜芦醇（tRV)的抗体，尤其是针对tRV 的单克隆抗体。本发明还提供了采用所述抗体对反式-白藜芦醇进行的测定。与常规所采 用的高效液相色谱质谱法（HPLC-MS)相比，提供的基于抗体的测定是成本更有效的、更快 速的且显著更便宜的。优选地，本发明的测定是ELISA，但是抗体可用在其它基于抗体的测 定形式中。
[0023] 令人惊奇地是，先前并未开发基于抗体的测定来测量反式-白藜芦醇，并且，认为 这可能是由于提供这样的抗体具有很多技术难题，尤其难以获得：（i)自身非未免疫原性 的半抗原与带有免疫基体的反式-白藜芦醇的有效免疫原性复合物；以及（ii)通过有显著 活性的小鼠产生的反式-白藜芦醇杂交瘤且该杂交瘤克隆具有足够的稳定性。反式-白藜 芦醇分子具有两亲性，亲水性甚至强于疏水性，能够彼此之间形成集簇且与其它合适的结 构形成集簇的性质和能力，从而影响了免疫原性表位的暴露。尽管存在这些技术难题，但本 发明人已经成功地研究出针对反式-白藜芦醇的单克隆抗体，进一步得到了对反式-白藜 芦醇的有效测定。
[0024] 此外，本发明人还意外地发现，通过ELISA测量的血清中反式-白藜芦醇的总浓度 显著高于通过HPLC-MS测量的血清中反式-白藜芦醇的总浓度（表la和表lb)。使用常规 测定和本发明的基于抗体的测定所得到的结果之间的差异可能是以不同方式制备样品以 用于HPLC-MS分析和基于抗体的测定的结果。对于HPLC-MS，在分析之前，必须将蛋白部分 沉淀并且从血清中除去，而基于抗体的测定（尤其是ELISA)则不需要这样的沉淀。因此， 在HPLC-MS中，蛋白相关的tRV或结合的tRV (如果存在于样品中）可在沉淀步骤中被去除， 从而不会被测量到或者甚至不会被检测到，而在基于抗体的测定中会测量到这样的tRV。因 此，因为本发明的测定能够检测样品中的所有tRV而没有由于沉淀而带来的损失，所以本 发明的测定在检测和测量tRV时可能更精确。因此，用于本发明的测定的样品制备典型地 缺少沉淀步骤。
[0025] 本发明的测定的进一步优点是：本发明的测定能够检测血液和其它类型的分析 样品中的tRV的完全新的库（pool)，其中该tRV的完全新的库与脂蛋白相关。例如，利用 HPLC-MS分析来自志愿者的血清中存在的tRV根本不能检测在他们血清中任何水平的tRV 分子。同时，通过使用本发明的测定则可能在相同样品中测量到显著水平的tRV(参见下表 3)。因此，由于本发明的基于抗体的测定具有能够检测这样的tRV并且进一步可尤其有效 地用于分析生物样品（尤其是血液、血浆和血清，并且优选血浆）的能力，所以本发明的基 于抗体的测定可提供比HPLV-MS更有代表性的结果。
[0026] 提供本发明的基于抗体的测试意味着tRV检测便宜很多，并且还给出了用于含有 反式-白藜芦醇的葡萄酒和其它饮料、或者甚至食物的基于抗体的"tRV-量级（scale) "。 经由常规HPLC-MS测量不可能提供这种量级。事实上，本发明的基于抗体的测定是相对廉 价且易于进行的，这意味着各食物和饮料生产商能够自己进行这种测定，以快速得到结果 而不需要依赖昂贵的基于HPLC-MS的分析，其中该HPLC-MS的分析仅能在有限数目的地点 得到且从中得到结果需要一定的时间。
[0027] 抗体
[0028] 本发明提供了针对tRV的抗体。具体地，本发明提供了针对tRV的单克隆抗体。
[0029] 本文中所提到的术语"抗体"包括完整的抗体和任何抗原结合片段（即"抗原结合 部分"）或它们的单链。抗体是指糖蛋白或其抗原结合部分，该糖蛋白包括通过二硫键相互 连接的至少两个重链（H)和两个轻链（L)。每个重链皆由重链可变区（在本文中缩写为V H) 以及重链恒定区组成。每个轻链皆由轻链可变区（在本文中缩写为和轻链恒定区组成。 重链的可变区和轻链的可变区包括与抗原相互作用的结合域。V H区和 '区能够被进一步 细分为超变区（称为互补决定区（CDR))、散布有更保守区域的区域（称为骨架区（FR))。
[0030] 本发明的抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。具体地，可使用单克隆抗体或多克 隆抗血清。尤其优选单克隆抗体。本发明的单克隆抗体可为嵌合抗体、CDR-移植抗体、单 域抗体、人或人源的抗体，或它们的任意抗原结合部分。对于生产单克隆抗体，实验动物典 型地为非人哺乳动物，诸如山羊、兔、大鼠或小鼠，但是抗体也可由其它物种（诸如骆驼科 动物）来提供。在一个优选实例中，本发明的单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。
[0031] 能够通过多种技术来生产本发明的单克隆抗体（mAb)，包括常规单克隆抗体的一 套方法，例如，科勒（Kohler)和米尔斯坦（Milstein)的标准体细胞杂交技术。用于制备杂 交瘤的优选动物体系是鼠源体系。根据本发明的单克隆抗体可通过如下方法来生产，该方 法包括：用偶联到半抗原上的tRV作为免疫原来免疫非人哺乳动物；获得来自所述哺乳动 物的抗体制备物；以及由此得到特异性识别tRV的单克隆抗体。在一个实例中，可采用本申 请的实施例中描述的tRV来产生本发明的抗体。
[0032] 可通过常规方法（诸如利用感兴趣的抗原来免疫合适的动物）来生产多克隆抗 体。随后，可将血液从由该血液中获得的多克隆抗血清中去除。当根据本发明产生多克隆 抗血清，并将该多克隆抗血清给予受试者以治疗或防止疼痛时，免疫典型地对非人哺乳动 物或鸟，例如马、绵羊、猪、山羊、兔、牛、猴、大鼠、小鼠或鸡进行。
[0033] 可通过本领域已知的标准技术，例如亲和色谱法来纯化本发明的抗体。
[0034] 术语抗体的"抗原结合部分"是指抗体的保留与tRV特异性结合能力的一个或多 个片段。已经表明，全长抗体的片段能够执行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语抗体的"抗 原结合部分"内的结合片段的实例包括Fab片段、F(ab'） 2片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片 段、dAb片段和经分离的互补决定区（CDR)。诸如scFv抗体的单链抗体也是在本发明意义 内的抗体。利用本领域技术人员已知的常规技术可得到这些抗体片段，并且对这些片段进 行筛选以找到能够以与完整抗体相同的方式起作用的片段。
[0035] 一旦鉴定和选择出合适的单克隆抗体，可通过本领域已知的方法鉴定该抗体的氨 基酸序列。例如利用简并引物，能够克隆编码该抗体的基因。随后，能够通过常规方法重组 生产单克隆抗体。本发明还提供了表达本发明的抗体的细胞系。例如，细胞系可为杂交瘤， 可为其中引入了编码本发明抗体的核酸序列的细胞系。
[0036] 在本发明的一个实例中，所采用的抗体将为2H9抗体，尤其是由杂交瘤2H9产生的 抗体。在本发明的另一个实例中，所采用的抗体将为来自1B1杂交瘤的1B1抗体。
[0037] 能够生产2H9抗体的杂交瘤已经被IP科技有限公司于2011年8月30日以登记 号VKPM H-121保藏在俄罗斯国立工业微生物（VKPM)保藏中心（FGUPGosNIIGenetika，俄罗 斯117545,莫斯科，第1街1号（lDorozhny proezdl))。相似地，能够生产1B1抗体的杂交 瘤细胞也被IP科技有限公司于2011年8月30日以登记号VKPM H-122保藏在俄罗斯国立 工业微生物（VKPM)保藏中心。
[0038] 本发明提供了能够产生2H9抗体的杂交瘤和能够产生IB 1抗体的杂交瘤。具体地， 本发明提供了 VKPM H-121杂交瘤和VKPM H-122杂交瘤，以及VKPM H-121和VKPM H-122 的等效杂交瘤细胞和衍生杂交瘤细胞。所述衍生杂交瘤细胞应能产生本文中所限定的抗体 中的一种，并且优选产生2H9抗体或1B1抗体。
[0039] 本发明所采用的抗体可为如下的抗体，该抗体的重链和/或轻链与2H9抗体或1B1 抗体的重链和/或轻链具有至少70 %，优选至少75 %，更优选至少80 %且甚至更优选至少 85 %的序列一致性。在一些实例中，序列一致性的水平可为至少85 %，优选至少90 %，更优 选95 %，并且进一步更优选为至少96 %、97 %、98 %或99 %。
[0040] 可使用多种程序来计算同源百分比和序列一致性。UWGCG程序包提供了能够 用于计算同源性的BESTFIT程序（例如，以其默认设定使用）（Devereux等人，（1984) Nucleic Acids Researchl2，p387-395)。PILEUP 和 BLAST 算法能够用于计算同源性或 排队序列（line up sequence)(典型为其默认设定），例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300;Altschul，S，F 等人，（1990)J Mol Biol215:403-10 中所述。
[0041] 通过国家生物技术信息中心（National Centre for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)能够公开获得执行 BLAST 分析的软件。 这种算法涉及当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，通过鉴定在查询系列中匹配 或者满足某种正值阈值得分T的长度为W的短字（short word)，来首先鉴定高分序列对 (HSP)。T 被称为邻字得分阈值（neighbourhood word score threshold) (Altschul 等人， 同上）。这些最初的邻字命中（neighbourhood word hit)用作起始查询的种子以发现含 有它们的HSP。这些字命中沿每一序列双向延伸，直到累积比对得分能够增加为止。当出 现以下情况时，每一方向上的字命中延伸停止：累积比对得分从其最大获得值减小数量X ; 由于一个或多个负分残基比对的积累而导致累积得分变为零或以下；或到达任一序列的 末端。BLAST算法的参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序采用默认的11 字长（W)，BL0SUM62 得分矩阵（参见 Henikoff 和 Henikoff (1989)Proc. Natl, AcacL Sci. USA89:10915)50比对⑶，期望值（E)为10，M = 5，N = -4,以及对两条链进行比较。
[0042] BLAST算法进行两条序列之间相似性的统计分析，参见，例如Karlin和 Altschul (1993) Proc. Natl. AcacL ScL USA90:5873-5787。BLAST算法提供的对相似性的一种 衡量单位是最小和概率（P(N))，最小和概率（P(N))提供了指示对两个核苷酸序列或两个 氨基酸序列之间偶然会出现匹配的概率。例如，如果第一序列与第二序列比较的最小和概 率小于约1、优选小于约〇. 1、更优选小于约〇. 01，且最优选小于约〇. 001，则认为一序列与 另一序列类似。
[0043] 在一个实例中，采用的抗体应具有来自抗体2H9的至少三个⑶R、优选至少四个 ⑶R、更优选至少五个⑶R且进一步更优选全部六个⑶R。或者，抗体可具有来自抗体1B1的 上述数量的⑶R。
[0044] 在进一步的实例中，抗体可具有⑶R，该⑶R与1B1抗体或2H9抗体的一个⑶R具 有上述具体水平的序列一致性。在一个实例中，所采用的抗体可具有至少三个、优选至少四 个、更优选五个这样的CDR。在特别优选的实施方式中，抗体可具有六个CDR，该六个CDR均 与来自1B1抗体或2H9抗体的相应CDR具有上述水平的序列一致性。在本发明的进一步的 实例中，所采用的抗体为本文中所提及的抗体片段类型的其中一种类型，该类型的抗体片 段具有上述所限定的CDR。
[0045] 在一个实例中，所采用的抗体具有来自1B1抗体或2H9抗体的骨架区，或具有与 1B1抗体或2H9抗体的骨架区具有上述具体水平的序列一致性的骨架区。在优选的实例中， 上述⑶R可采用这样的骨架区。在一个实例中，采用来自1B1抗体或2H9抗体的整个重链 可变序列和/或整个轻链可变序列。在另一实例中，可变区具有与1B1抗体或2H9抗体的 重链可变区和/或轻链可变区具有上述具体水平的序列一致性的可变区。
[0046] 在一个实例中，除了高达50个氨基酸替代、优选高达40个替代、更优选仅高达30 个这样的替代并且甚至更优选仅高达20个这样的替代之外，所采用的抗体可具有2H9抗体 或1B1抗体的重链和/或轻链的可变区的完整序列。在一个实例中，抗体具有高达15个替 代，优选高达10个替代，更优选高达5个替代。在一些实例中，序列可仅具有4个、3个、2 个或1个这样的改变。在一个实例中，氨基酸改变的数目可在前述多个具体值的任意两值 之间的范围内。可能的是，抗体可具有1至1〇、1至8、1至6或1至4个氨基酸改变。在一 些实例中，抗体在其可变区中会具有这些数目的序列改变。在优选的实例中，该替代应是保 守的。
[0047] 例如，可根据下表进行保守替代。在第二列的相同组中的氨基酸，以及优选在第三 列的相同行中的氨基酸可彼此替代。
[0048]

【权利要求】
1. 一种检测或测量样品中的反式-白藜芦醇（tRV)的方法，包括： (i) 使待测试的样品与针对tRV的抗体或该抗体的抗原结合片段相接触；以及 (ii) 检测或测量被所述抗体或抗体片段结合的任何tRV。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中： (a) (i)中的所述抗体或抗体片段被结合到支撑体上； (b) (i)中的所述抗体或抗体片段是单克隆抗体；和/或 (c) tRV与（i)中的所述抗体或片段的结合是利用针对tRV的第二抗体或该第二抗体的 抗原结合片段来检测的。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法为ELISA方法，或者为使用基于抗 体的芯片或传感器进行的方法。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述待测试的样品为农业样品、药物 样品、营养品样品或美容品样品，或者所述待测试的样品为来自人的生物样品。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述生物样品为人的血清。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，（i)中的所述抗体或抗体片段为：从 以登记号VKPM H-121保藏的杂交瘤得到的抗体或抗体片段，或从以登记号VKPM H-122保 藏的杂交瘤得到的抗体或抗体片段。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法提供了对通过参考反 式-白藜芦醇的标准量级、表、得分来限定的反式-白藜芦醇的测量。
8. -种针对tRV的抗体或该抗体的抗原结合片段，其中，所述抗体或抗体片段如前述 权利要求中任一项中所限定的。
9. 一种杂交瘤，选自：以登记号VKPM H-121保藏的杂交瘤，以登记号VKPM H-122保藏 的杂交瘤，以及产生与以登记号VKPM H-121和登记号VKPM H-122保藏的杂交瘤相同的抗 体的杂交瘤。
10. -种用于检测或测量反式-白藜芦醇（tRV)的试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利 要求8所述的抗体或抗体片段。
11. 根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括： (a) 支撑体，用于使所述抗体固定在该支撑体上； (b) tRV的标准样； (c) 用于检测tRV与所述抗体或抗体片段的结合的构件；和/或 (d) 用于进行测定的操作指南。
【文档编号】G01N33/53GK104093737SQ201280066303
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月11日
【发明者】伊万·佩蒂娅, 瓦列里·特塞比佐 申请人:Ip科技有限公司