抗ctla-4/pd-1双特异性抗体、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类双特异性抗体和其制备 方法，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] T细胞的活化启动和效应发挥的过程中至少需要两种信号存在，第一种信号是抗 原特异性的，由主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex, MHC)以及 与其结合的抗原肽被T细胞受体（T cell rec印tor，TCR)识别并结合后，由TCR复合物向 T细胞内传导激活信号；第二种激活信号是抗原非特异性的，是由抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC)和T细胞上多种辅助分子之间的配对和相互作用而提供的，能够提 供第二种激活信号的一类T细胞膜蛋白又被称为共刺激分子，其中CD28是一种表达在T细 胞表面的重要共刺激分子，在T细胞活化中发挥重要作用。当TCR与MHC-抗原肽复合物 结合后，如果共刺激分子缺乏，将导致T细胞对特异的抗原表现为无能状态，不仅不能被激 活，而且对抗原特异性的活化信号均不应答；如果共刺激分子如CD28与B7分子结合并激活 后，可在多个水平上介导T细胞的活化。活化的T细胞可以自分泌和旁分泌的形式产生白 细胞介素 2 (interleukin2 ;IL-2)，作用于细胞表面的受体IL2R，进一步刺激T细胞的增 殖，从而为发挥效应功能做好准备。
[0003] 细胞毒T淋巴细胞相关抗原 4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4， CTLA-4)又名⑶152,属于白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与⑶28共同享有 B7分子配体（B7-1/CD80, B7-2/CD86)，而CTLA-4与B7分子结合后能负下调T细胞的反应 活性，参与免疫反应的负向调节，因此是一种免疫共抑制分子。APC上的B7家族分子和T细 胞上的配基CTLA4的结合对T细胞的活动起着重要的负向调节作用，阻断此信号通路，可以 促进T细胞的活化。CTLA-4与B7的亲和力显著高于⑶28,可以和⑶28竞争结合APC表面 的B7分子，阻断CD28与B7的共刺激信号传导，抑制T细胞抗原识别第二信号的产生，从而 发挥免疫抑制效应。通常情况下，CTLA-4合成后储存于T细胞胞质中的囊泡里，激活信号 能够诱导CTLA-4转位到细胞膜上，膜表面的CTLA-4从而与CD28竞争结合相应配体并发挥 抑制作用，这是指一种正常的负反馈机制。
[0004] 大量研究表明，肿瘤在形成过程中，可通过多重机制，逃避免疫系统的监视，我们 将这一过程称之为肿瘤组织的免疫逃逸或免疫编辑。肿瘤细胞可通过以下途径逃逃脱免 疫系统的攻击：①肿瘤抗原的抗原调变导致免疫原性降低；②肿瘤细胞表面MHC分子表达 缺陷或表达量降低，如提呈抗原肽处理与递呈相关基因（如LMP/TAP基因）的缺陷；③肿瘤 细胞通过非经典的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA)等分子(如HLA-G和 HLA-E)抑制NK细胞和部分细胞毒性T细胞的杀伤作用；④肿瘤细胞可自分泌或旁分泌一 些免疫抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β等，这些因子可以削弱免疫系统对肿瘤的杀伤作 用，也可激活调节性T细胞的免疫抑制作用；⑤肿瘤细胞共刺激分子配体及黏附分子表达 下降，或肿瘤细胞高表达共抑制分子的配体；⑥肿瘤细胞释放出肿瘤抗原分子，与抗体结合 成复合物，通过抗体的Fe段与淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞的Fe受体结合，从而封闭ADCC 效应；⑦肿瘤细胞分泌可溶性活化受体的配体，如NK细胞活化受体的配体，下调免疫细胞 表面活化受体的表达，使免疫效应细胞功能下调；⑧肿瘤死亡受体的脱落；⑨T细胞肿瘤特 异性抗原的耐受（由宿主抗原提呈细胞、髓样细胞或调节性T细胞造成)。T细胞在肿瘤免疫 的过程中处于核心地位，如果能调动体内的杀伤武器，将是非常有效且安全的治疗策略。肿 瘤的免疫逃逸机制与机体对肿瘤的免疫应答之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗的 过程中早期肿瘤特异性的CD8阳性T细胞是激活的，随着肿瘤生长到后期失去了杀伤的功 能，肿瘤产生抵抗力。总而言之，既要在体内激活原有自身的免疫系统反应，还要让已经调 动的反应持续增强才是免疫治疗肿瘤的最好策略。
[0005] T细胞的活化除了需要通过APC递呈MHC-抗原肽给抗原特异性T细胞提供第一信 号外，还需要一系列协同刺激分子提供第二信号，进而才能使T细胞达到生理活化阈值产 生正常的免疫应答，这在理论上更好地解释了免疫系统对自身和非自身抗原产生免疫学应 答时精确而微妙的调节机制。如果缺少共刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无 反应性或特异性免疫耐受甚至进入凋亡，因此，正性和负性协同刺激信号的调节及两者之 间的平衡在极体免疫应答的整个过程中起着重要的调节作用。
[0006] F1D-I (programmed death-Ι)最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细 胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1受体。目前，PD-I的配体被证实有两个，分别是ro-Li (B7-H1)和PD-L2 (B7-DC)。PD-Ll (B7-H1)属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及 胞浆区尾部，PD-Li与其τ细胞上的受体ro-i相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥 着重要作用；该分子具有宽广的组织表达谱，广泛表达于抗原提呈细胞（APCs)、活化T/B细 胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上皮细胞。PD-Ll在许多人类肿瘤组织中均 可检测到ro-Li蛋白的表达，且许多癌组织较正常组织中的ro-Li表达水平明显上调。应 用免疫组织化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀 胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤等人类肿瘤组织中检测到ro-Li蛋白的表达，且ro-Li的 表达水平和患者的临床及预后紧密相关。许多研究均表明ro-Li与肿瘤的免疫逃逸机制相 关。研究表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的APC表达的ro-Ll均可经ro-1/PD-Ll信号通 路抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化，下调T细胞介导的肿瘤免疫应答。大量实验证明，阻 断ro-1/PD-Ll信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增值，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，有 效抑制肿瘤生长。因此，干预ro-1/PD-Ll信号有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。
[0007] 在抗肿瘤免疫中，CD8阳性的细胞毒性T细胞的免疫应答发挥核心作用，其基本 过程可分为抗原识别、细胞活化/增殖/分化和效应杀伤阶段。其中共抑制分子CTLA-4 和ro-i分别在τ细胞活化/增殖/分化阶段和效应杀伤阶段发挥重要的负向免疫调节作 用。正常情况下，这两种分子在自体免疫耐受的维持中起重要作用，能防止自身免疫病的发 生；然而在肿瘤患者体内，这两种分子可能起着抑制抗肿瘤免疫的作用。临床研究发现，抗 CTLA-4抗体和抗ro-i抗体联合应用比任一抗体单独使用具有更好的抗肿瘤活性。因此，研 究出能同时阻断CTLA-4和ro-i免疫抑制功能的双特异性抗体，从而更加有效地增强抗肿 瘤免疫，这类高效抗肿瘤药物一直是本领域的技术人员急待解决的问题。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个既能与CTLA-4 结合，还能与ro-1相结合的双特异性抗体，即本发明所述的"抗CTLA-4/PD-1双特异性抗 体"，从而完成了本发明。
[0009] 本发明公开了 ：
[0010] 1. 一种抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其既能与CTLA-4结合，还能与ro-Ι相结 合。
[0011] 2.上述1所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其包含抗CTLA-4单克隆抗体可变 区和抗ro-i单克隆抗体可变区。
[0012] 3.上述1或2所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其轻链氨基酸序列如SEQID N0:4所示,重链氨基酸序列为SEQ ID N0:2所示。
[0013] 4. 一种分离的核酸分子，其编码上述1-3任一所述的双特异性抗体，优选地，所述 核酸分子其轻链核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示，重链核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 5. -种表达载体，含有上述4或5任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操 作性相连的表达调控序列，优选地，所述载体可以为pCHOl. 0、pBudCE4. 1或pCGS3载体，最 优选为pCHOl. 0载体。
[0015] 6. -种宿主细胞，其含有上述5所述的载体。优选地，所述宿主细胞为哺乳动 物细胞，更优选地，所述宿主细胞为COS、CHO、NSO ;最优选地，所述宿主细胞为CHO-S'或 CHOZN