IgGl抗体（Fe特异， 购自Sigma公司)于各反应孔中，37°C孵育1小时，洗涤；于各反应孔中加入临时配制的TMB 底物溶液〇. Iml显色，37°C放置10~30分钟；于各反应孔中加入2mol/L硫酸0. 05ml终止 反应；置酶标仪上（SpectraMax i3Multi_Mode Platform，美国 ΒΙ0-ΤΕΚ 公司）测定 450nm 波长处测定吸光值。
[0053] 实验结果如图1和图2所示。结果表明：抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体既可结合 CTLA-4,也可结合PD-1，且与抗CTLA-4抗体和抗PD-I抗体相比，抗CTLA-4/PD-1双特异性 抗体对两种靶点的结合力并没有因结构的改造而减弱。
[0054] 实施例4.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体刺激混合淋巴细胞反应的实验
[0055] 混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLC)是将二个同种无关个体的 淋巴细胞混合在一起培养，由于二者的淋巴细胞膜上的组织相容性抗原不同，可互相刺激， 导致对方的淋巴细胞分裂、增殖和分化，最终产生的淋巴母细胞表现为细胞体积增大，核内 DNA和胞浆内RNA增加等。可通过形态学方法计数分化的淋巴细胞百分数，也可通过测定激 活的淋巴细胞摄取DNA合成的前体3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)掺入量的多少来判定。 同位素标记法较为客观，重复性好且结果较准确。淋巴细胞增殖反应强度与双方组织相容 性抗原的差异程度成正比。两者相容性愈差，反应愈强烈。本法有双向和单向MLR之分，在 双向MLR中，双方的淋巴细胞互相刺激而增生、分化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞又是 反应细胞；在单向MLC中，将一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素 C处理，使其丧失增 殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应，此时的MLR只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可 了解不同个体淋巴细胞刺激强度与增殖反应强度。人外周血单核/淋巴细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)用密度梯度离心法制备：取两个不同个体A和B的肝素 抗凝外周血，用人外周血淋巴细胞分离液(购自上海生工生物工程技术服务有限公司）分离 出单核细胞，洗涤后用RPMI-1640培养液（内含经56°C、30min灭活的小牛血清10%，适宜浓 度的青霉素、链霉素，用饱和NaHCO3溶液调pH至7. 2~7. 4)调整细胞密度为I X IO6Ail。
[0056] MLC按如下实验步骤实施：1、将A、B二个体的淋巴细胞悬液分别做记号，以个体A 的作为MLR的反应细胞，个体B的作为MLR的刺激细胞；2、刺激细胞处理：取个体B的淋巴 细胞悬液〇. 9ml，加人400 μ g/mL的丝裂霉素 CXmitomycin C)0.1 ml,使其终浓度为40 μ g/ m，细胞悬液置37°C水浴30min，离心弃上清，沉淀细胞用培养液洗一次，调整细胞浓度至 I X IO6Ail，丝裂霉素 C处理过的个体B的淋巴细胞记作Bm ;3、用微量加样器各取0.1 mL反 应细胞（A)和刺激细胞（Bm)于一圆底细胞培养板的孔中（A+Bm)，置37°C、5%C02培养箱内 培养5d ;4、在培养终止前15~16h，用同位素微量加样器于每孔内加入3H-TdRl μ L (含 0. 5μ Ci)，此时空白对照组不加同位素；5、样品处理：用细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维 滤纸上,用生理盐水洗去游离的3H-TdR,将滤片置60°C烘箱中烤干，冷却后将滤片放入含闪 烁液的测量杯中，用β闪烁体测量仪检测放射强度，空白对照在样品处理前加入同位素， 处理方法同实验组；6、实验结果计算：结果以每分钟脉冲数（counts per minute, cpm)表 示，所有样品在数据处理前均应减去空白对照组的cpm值，MLR反应强度通常以样品的cpm 净值或刺激指数（stimulation index, SI)表示，cpm净值等于实验组cpm值减去对照组 cpm, SI等于实验组cpm除以对照组cpm。
[0057] 实验结果如图3所示。结果表明：与抗CTLA-4抗体或抗Η)-1抗体相比，抗CTLA-4/ ro-i双特异性抗体具有更强的刺激淋巴细胞增殖的作用。
[0058] 实验例5.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的药代动力学实验
[0059] 实验步骤：10周龄、无特定病原体（Specific-pathogen free, SPF)的成年雄性 Wistar大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司），体重350-400g，随机分为八组，每组四 只，通过静脉注射分别给予药物溶剂、抗CTLA-4抗体、抗Η)-1抗体以及抗CTLA-4/PD-1双 特异性抗体，抗体的剂量设为4mg/kg。所有大鼠于注射后0. 5h，lh，2h，6h，12h，24h，48h， 5d，10d，15d，20d，25d，30d后取血（内眦静脉取血)，每只大鼠取血约100 μ 1，加0。1%的肝素 混匀，4000rpm离心20min，取上清，弃沉淀。检测血楽中抗体的浓度采用ELISA法：重组蛋白 CTLA-4和Η)-1用0. 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)稀释成2 μ g/ml，96孔酶标板每孔添加 IOOy 1上述稀释后的蛋白溶液，4°C于湿盒内过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗漆缓冲液(含 有0. 05%TWeen-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每次3分钟；将不同稀释度的大鼠血浆加于上 述已包被的反应孔中，置37°C孵育1小时；然后用洗涤缓冲液洗涤，加辣根过氧化物酶标记 的大鼠抗人IgGl抗体（Fe特异，Sigma公司产品）于各反应孔中，37°C孵育1小时，洗涤；于 各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 ml显色，37°C放置10~30分钟；于各反应孔 中加入 2mol/L 硫酸 0. 05ml 终止反应；置酶标仪上（SpectraMax i3Multi_Mode Platform, 美国BIO-TEK公司)测定450nm波长处测定吸光值。检测结果如图4所示，抗CTLA-4抗体、 抗I3D-I抗体以及抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的体内半衰期均较长，没有显著差异。
【主权项】
1. 一种抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其特征在于，所述抗体既能与CTLA-4结合，还能 与ro-i相结合。2. 根据权利要求1所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包含抗 CTLA-4单克隆抗体可变区和抗H)-l单克隆抗体可变区。3. 根据权利要求1或2所述抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其特征在于，所述抗体轻链 氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。4. 一种核酸分子，其编码权利要求1~3任一所述抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体，其轻 链核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，重链核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。5. -种表达载体，含有权利要求4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连 的表达调控序列，所述载体可以为pCHOl. 0、pBudCE4. 1或pCGS3载体。6. -种宿主细胞，其含有上述5~6任一所述的载体，所述细胞可以为COSXHO或NSO 细胞。7. -种制备权利要求1~3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的方法，该方法 包括： a) 在表达条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，表达抗CTLA-4/PD-1双特异性抗 体； b) 分离或纯化a)所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体。8. -种组合物，含有权利要求1~3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体和药学 上可接受的载体。9. 权利要求1~3任一所述的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体或上述权利要求8所述的 组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。10. 上述权利要求9所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体、其制备方法及应用。本发明的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体既能与CTLA-4结合，还能与PD-1相结合，其通过阻断CTLA-4和/或PD-1信号传导途径，有效地增强免疫反应，从而可能具有良好的增强抗肿瘤免疫反应的效果。
【IPC分类】C12N15/85, C12P21/08, A61P35/00, C12N5/10, C12N15/13, A61K39/395, C07K16/28
【公开号】CN104974253
【申请号】CN201410129980
【发明人】赵杰, 张成海, 朱玲巧, 周远锋, 李致科, 赵乐
【申请人】上海中信国健药业股份有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月1日