一种中和丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体及其用图
【专利说明】
[0001]【技术领域】
本发明涉及生物免疫学领域，具体地说，涉及一种中和丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体及其用途。
[0002]【【背景技术】】
丙型病毒性肝炎(丙肝)由丙型肝炎病毒(HCV)引起，一般通过血液和体液传播，是导致各种肝脏疾病的重要原因之一。据世界卫生组织WHO统计，目前全球约有1.5亿人患有慢性丙肝，并面临因肝功能丧失或者肝癌导致死亡的风险。每年有300-400万人新增感染丙肝病毒，并有35万余人死于与丙肝相关的肝脏疾病。2009国际肝病峰会数据表明，中国作为丙肝流行地区，目前约有4000万患者。急性HCV感染者转变为慢性丙肝患者的概率高达80%，呈现出明显的慢性化趋势。中国十年间HCV的发病人数增长了 9倍。全世界都迫切需要对于丙型病毒性肝炎的安全、有效、价格低廉的预防治疗方法。
[0003]丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科(Flaviviridae)肝炎病毒属。HCV病毒体呈球形，直径约60nm(在肝细胞中为36-40nm，在血液中为36_62nm)，内部为单链正义RNA，在核衣壳外包裹有含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。HCV基因组的单股正链RNA全长约9.6kb，包含5，-端和3，-端非编码区(non-translated reg1n,UTR)及一个开放阅读框(openreading frame，ORF)，编码一个3000多个氨基酸的多聚蛋白前体，可翻译剪切为11种病毒蛋白。其中HCV RNA的N-端编码Core(F)、El、E2和P7五个结构蛋白，C-端编码NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B六个非结构蛋白。其中，core蛋白是病毒核衣壳的最基本组成部分，E1/E2是病毒表面高度糖基化的包膜蛋白，P7是介导病毒颗粒组装和释放的离子通道蛋白，NS2、NS4B、NS5A、NS5B参与病毒的复制过程，NS3-4A参与病毒多聚蛋白前体的剪切工作。
[0004]目前尚无疫苗可以有效防止HCV感染，针对慢性丙肝的标准疗法是聚乙二醇干扰素-α与利巴韦林的联合治疗，但基于所感染病毒基因型和其他因素，只有50%_80%的患者可以产生持续病毒性应答，其他患者则无法用此疗法控制病情的发展。2011年5月，FDA批准通过了两种丙型肝炎新药Victrelis (伯赛匹韦，boceprevir)和Incivek(telaprevir，特拉匹韦)。这两种药物都属于一类所谓的蛋白酶抑制剂，该抑制剂能够阻止丙型肝炎病毒复制。这两种药物的治疗均可以有效降低患者HCV RNA载量，但同时也面临着耐药性、副作用、价格昂贵等问题，制约了其在临床上的大规模使用。迫使人们寻求新的预防和治疗丙型病毒性肝炎的方法——抗体药物。
[0005]抗体药物用于病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗SARS和重症H5N1丙型肝炎病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。具有中和活性的抗丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体具有以下潜在优势:一方面它可以阻断病毒与靶细胞的结合；另一方面通过补体和T细胞、NK细胞等效应细胞的作用，将被病毒感染的细胞杀死。1986年，第一株治疗器官移植出现的排斥反应的鼠单抗——莫罗单抗-CD3(murmonab⑶3，hoclone 0KT3)获得美国FDA批准上市，但由于其在人体内会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，限制了应用。随着免疫学和分子生物学的发展，基因工程抗体迅速发展，嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体生产技术不断发展，将HAMA反应降至最低乃至消除。2009年，美国FDA批准的14个药物中有4个为全人抗体，这标志着全人单克隆抗体时代的来临，全人抗体成为抗体药物未来的发展方向。
[0006]丙型肝炎病毒包膜蛋白中的E2蛋白，在病毒入侵细胞过程中扮演非常重要的角色，是主要的细胞表面受体结合区域，也是免疫反应的主要目标。E2蛋白的N-端包含两个高可变区(HVR)，分别是HVRl和HVR2，这两个区域处于蛋白表面，研究表明丙肝的慢性感染和病毒逃逸与这两个区域密切相关。目前，得到广泛认可的广谱中和性抗原表位是AR3表位，其包含三个不连续氨基酸区段(396-424，436-447和523-540位氨基酸)。
[0007]综上，针对丙型肝炎病毒E2蛋白而开发的全人单克隆抗体，未来在HCV的预防及治疗中必将产生重要的作用。
[0008]【
【发明内容】
】
本发明的目的在于提供中和丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体。
[0009]在本发明的第一方面，提供一种分离的结合分子，其能识别并结合丙型肝炎病毒包膜蛋白E2蛋白，所述的结合分子包含:
a)SEQ ID NO: 8 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO: 9 所示重链 CDR2 和 SEQ ID NO: 10所示重链CDR3区；和/或
b)SEQID NO: 14 所示轻链 CDRl 区、SEQ ID N0:15 所示轻链 CDR2 和 SEQ ID NO: 16所示轻链⑶R3区。
[0010]在一个优选例中，所述的结合分子包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQID NO: 2所示的氨基酸序列。
[0011]在另一优选例中，所述的结合分子包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQID NO: 4所示的氨基酸序列。
[0012]在另一优选例中，所述的结合分子是Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体或四链抗体；
优选的，所述的结合分子是人单克隆抗体。
[0013]在本发明的另一方面，提供编码所述的结合分子的核酸分子。
[0014]在本发明的另一方面，提供所述的结合分子在制备用于检测、治疗和/或预防丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
[0015]在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体中含有编码所述的结合分子的DNA。
[0016]在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有所述的表达载体。
[0017]在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述的组合物含有所述的结合分子，以及药学上可接受的载体。
[0018]在本发明的另一方面，提供一种检测丙型肝炎病毒的试剂盒，其包括所述的结合分子。
[0019]在本发明的另一方面，提供一种(优选非治疗性地)抑制丙型肝炎病毒的方法，所述的方法包括给予患者有效量的所述的结合分子。
[0020]在本发明的另一方面，提供一种(优选非诊断性地)检测丙型肝炎病毒的方法，利用所述的结合分子与待测样品进行接触，通过检测所述的结合分子与受试样品的结合情况，获得丙型肝炎病毒的存在情况以及存在量。
[0021]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
[0022]【【附图说明】】
图1、FACS流式细胞仪分选特异性B细胞的分选图。
[0023]图2、β -actin内参的PCR扩增产物的电泳结果。
[0024]图3、重链基因的PCR扩增产物的电泳结果。
[0025]图4、轻链基因的PCR扩增产物的电泳结果。
[0026]图5、若干种全人单克隆抗体(包括7F2)抗原抗体特异性检测。
[0027]图6、全人单克隆抗体(7F2)对于HCV真病毒(Ib亚型PR26C3M、PR52B6M、PR79三个毒株；2a亚型PR79、JFH1毒株)的中和活性检测。每簇的5个柱子从左至右依次代表抗体浓度为 50,25,12.5,6.25,3.125 ug/L。
[0028]图7、抗流感HA蛋白的中和性全人单抗1F2对于HCV真病毒的中和活性检测。
[0029]【【具体实施方式】】
本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种含有独特的互补决定区(CDR区)的抗丙型肝炎病毒广谱中和性的结合分子，优选全人单克隆抗体，该结合分子对于丙型肝炎病毒具有显著的中和作用。在此基础上完成了本发明。
[0030]结合分子
本发明提供了能特异性结合丙型肝炎病毒的结合分子。优选地，所述结合分子是人结合分子。优选地，本发明的结合分子呈现对于丙型肝炎病毒的中和活性。
[0031]本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’ )、F(ab，) 2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链卩遼菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与丙型肝炎病毒毒株的特异性抗原结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。
[0032]本发明的结合分子也可以特异性结合丙型肝炎病毒的一或多个片段。对于治疗和/或预防丙型肝炎病毒的方法而言，所述结合分子优选能特异性结合丙型肝炎病毒的表面可及蛋白质。在特定的实施方案中，本发明的结合分子能特异性结合丙型肝炎病毒的E2分子。
[0033]本发明还提供了所述的结合分子在制备诊断、预防和/或治疗丙型肝炎病毒感染的药物中的应用。本发明提供了可以中和导致丙型肝炎的丙型肝炎病毒感染的结合分子。<