作为识别丙型肝炎病毒的试剂。
[0076]此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。
[0077]在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中E2蛋白或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染丙型肝炎病毒，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。
[0078]作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测丙型肝炎病毒的方法，包括以下步骤:
(al)将待测样品包被于固相载体；
(a2)将本发明的结合分子加样于(al)的固相载体，从而使待测样品中的丙型肝炎病毒与结合分子结合，形成带有“丙型肝炎病毒-本发明的结合分子” 二元复合物的固相载体；
(a3)将特异性结合本发明的结合分子的检测物加样于(a2)的固相载体，形成带有“丙型肝炎病毒-本发明的结合分子-检测物”三元复合物的固相载体；所述的检测物上携带一标记物；
(a4)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中丙型肝炎病毒的存在与否或存在的量。
[0079]按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的丙型肝炎病毒含量。
[0080]本发明的主要优点在于:提供了一种全新的结合分子，能够结合具有天然构象的丙型肝炎病毒(HCV)的E2亚基，阻止丙型肝炎病毒侵染易感细胞。本发明的结合分子是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)抗丙型肝炎病毒的分子相比，免疫原性大大减少，且亲和性良好。不仅治疗效果好，而且副作用低。
[0081]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0082]实施例1
以下说明本发明即一株能够中和丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体制备过程以及抗体特性分析过程。分为两部分: (1)单细胞RT-PCR法获得抗体基因以及抗体表达载体制备；
(2)抗体特性分析。
[0083]具体过程如下:
一、材料和方法
1、外周血单核细胞(PBMC)的获得
从已感染丙型肝炎病毒的志愿者体内抽取外周血，米用常规Ficoll-Paque (厂家为LymphoIyte?-H (CEDARLANE)公司)密度梯度离心，得到17以上个外周血单核细胞(PBMC)。
[0084]Ficoll 分离方法:
(1)收集血液，于50ml离心管(预含4%朽1檬酸钠Iml),收集全血1ml,颠倒混勻8-10次。(即使柠檬酸钠终浓度为0.4%)；
(2)加等体积RPMI1640(含柠檬酸钠)，混匀；
(3)用15ml透明离心管，铺3ml淋巴细胞分离液，在其上小心加6ml血样。形成分离界面(或4ml分离液加8ml血样);
(4)室温离心800g, 20min (2000rpm, 20min)；
(5)小心吸取界面层细胞，转移至新管；
(6)加RPMI1640(含柠檬酸钠)，稀释减小液体密度。离心，800g/2000rpm，1min0去上清；
(7)RPMI1640洗细胞2_3次，备用。
[0085]、E2蛋白特异性记忆B细胞分选
使用FITC-⑶19/APC-1gG/Cy3-HCV-E2为标志物，经流式细胞仪获得特异性B细胞至96孔RT-PCR板，每孔一个细胞，获得E2蛋白特异性记忆B细胞。
[0086](I)丙型肝炎病毒包膜蛋白E2(HCV_E2)由哺乳动物细胞CHO表达系统表达；参考 FreeStyle?MAX CHO Express1n System 手册；
(2)E2蛋白进行生物素(B1tin)标记:No-ffeigh Sulfo-NHS-LC-B1tin (购自PIERCE，参考 PIERCE 公司 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-B1tin 生物素标记 Protocol) 1mM 试剂；另两个标志物FITC-CD19和APC-1gG均购自BD B1science公司；
(3)分选细胞的标记:PBMC细胞分组，实验组+对照组，按细胞数加入标志物，避光染色，进行标记，用PBS重悬后,使用40 Mm BD falcon滤膜过滤；
(4)特异性B细胞的分选:使用BDFACS ARIA II筛选，根据前向角和侧向角从PBMC中筛选到淋巴细胞，然后通过不同对照组的调节补偿，获得丙肝病毒E2蛋白的特异性记忆B细胞，将其分选到96孔板中进行RT-PCR(反转录PCR)，每孔一个细胞，板置于干冰上。
[0087]、抗体基因克隆及表达载体构建
根据文献(Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112-124)中报道的方法，通过RT和Nested-PCR法获得抗体基因。
[0088]获得的抗体基因连接pGEMT载体(购自Invitrogen公司)，进行测序(华大基因测序公司)，常规方法验证抗体基因。然后将重、轻链基因分别连接表达载体AbVec-hlgG和 AbVec- hIgKappa (载体 AbVec-hlgG 完整序列见 GenBank:FJ475055.1 ;载体 AbVec-hlgKappa完整序列见GenBank:FJ475056.1)，载体构建方法可参考文献Kenneth Smithet al.Rapid generat1n of fully human monoclonal antibodies specific to avaccinating antige.Nat Protoc.2009 ; 4(3): 372-384,具体地，在 AbVec-hlgG 的AgeI和Sail酶切位点之间插入重链可变区序列,在AbVec- hIgKappa的AgeI和BsiWI酶切位点之间插入轻链可变区序列。
[0089]、抗体表达
将前述插入了重链和轻链基因的表达载体采用脂质体法瞬时转染293T细胞，进行全人抗体表达(参考Lipofectamine? 2000转化手册)。
[0090](I)在转染前一天将1.0X 16细胞接种到6孔细胞培养板中；
(2)A管:500μ1 Opt1-MEM + 4μδ IgG +4μδ IgL ；
(3)Β管:500μ1 Opt1-MEM + 20Μ-1 Lipofectamine Reagent ；
(4)静置5分钟后，将A管与B管混合，在室温静置20min；
(5)A、B管混合物加入细胞培养盘中，37°C孵育6h ；
(6)6h后，吸除含有Lipofectamine Reagent DNA的培养液，每孔加入2mlFreeStyle ? 293 Express1n Medium ；
(7)72h 后，收集细胞上清，4°C，3000rpm, 5min。
[0091]、抗原特异性检测
检测表达的全人抗体是否识别HCV-E2(由哺乳动物细胞CHO表达系统表达；参考FreeStyle?MAX CHO Express1n System手册)，以及与抗原的结合能力。
[0092](I)包被HCV-E2于ELISA板(购自NUNC公司)，lOPg/ml，每个样品两个复孔，每孔100μ1，4?过夜;
(2)PBST 洗板，3 次；
(3)封闭:1%BSA，每孔 2(m，37°C，2h ；
(4)PBST 洗板，3 次；
(5)根据测定浓度，调整全人抗体细胞上清至相同浓度，每孔100μ1，HCV病人血浆为阳性对照，37°C，2h ；
(6)PBST 洗板，3 次；
(7)Goat Ant1-Human IgG (Fe specific) Peroxidase antibody, 1:10000 稀释，每孔100μ1，加到样品和阳性对照的ELISA板中，37°C，Ih ;
(8)PBST 洗板，3 次；
(9)底物A液:B液=1:1，底物为TMB，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(购自Sigma，使用方法按产品说明)。每孔100μ1，37?，15π?η，避光反应;
(10)加入2Μ H2SO4,每孔 50μ1 ；
(11)用分光光度计测定450nm波长下的吸光度(即0D450)，并进行数据处理。
[0093]、抗体中和活性测定——真病毒中和试验
全人单克隆抗体使用293T细胞进行表达，表达纯化后将其浓度调整为50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml和3.125ug/ml进行真病毒中和试验测定其中和活性，即对HCV真病毒的抑制率。
[0094]二、结果与分析
UHCV-E2蛋白特异性记忆B细胞分选使用FITC-CD19/APC-1gG/Cy3-HCV-E2为特异性标志物，获得了若干个HCV-