一种稳定的丙型肝炎病毒核心抗原酶结合物稀释液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及丙型肝炎病毒核心抗原检测的方法。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV)感染而引起的一种全球 性传染病。据估计目前全世界有1. 7亿丙肝病毒感染者，我国的丙肝感染率大约为30%，目 前至少有4000~6000万丙肝患者。其中有80~85%的感染者将发展为慢性丙型肝炎，其中又 有20%可发展为肝纤维化，最终有4~5%的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。
[0003]目前，尚无针对丙型肝炎病毒的特效治疗药物，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV快 速变异而困难重重，短期内难有突破进展。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV传染源、指 导临床治疗和预后判断有重大意义。
[0004] 现有HCV常用检测方式主要有：（1)间接检测：用来检测体内抗HCV抗体，由于HCV 感染后到抗HCV抗体的出现有一个约40~70天的"窗口期"，所以抗HCV不能作为HCV感染 的早期诊断指标；（2)直接检测：通过定性或定量检测HCV病毒粒子的组成成分以确定病毒 的存在。由于HCV感染后6 ~15天感染者血液中即有HCV-RNA的出现，并在血清阳转之前 达到一个较高的水平，因此采用该检测技术对献血员进行常规筛选可以大大降低"窗口期" 感染的危险，虽然定性或定量检测HCV病毒粒子的方法具有早期、敏感和特异等特点，但由 于该技术需要昂贵精密的仪器、较高的实验技巧、昂贵的试剂，且容易导致交叉污染导致假 阳性偏高，导致其很难推广到单个献血员，在发展中国家的应用也受到很大程度的限制。
[0005] 鉴于以上HCV病毒检测方法的局限性，尽快研制出快速、准确、低廉并在各大医院 可普及的HCV检测方法成为必要。目前国内市场上已有两家体外诊断试剂公司生产的丙型 肝炎病毒核心抗原检测试剂盒（ELISA)是针对于HCV核心抗原的检测，从而使HCV感染的 "窗口期"大大缩短的相关报道。然而由于丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒（ELISA)酶结 合物不稳定常出现对样品检测结果不准确的现象。所以需要在酶结合物稀释液中加入稳定 剂，传统的酶稀释液常用含有无关高浓度蛋白1%BSA或10%动物血清等来作为酶的稳定剂， 然而BSA市场价格较高，动物血清运输、保存不方便。
【发明内容】
[0006] 针对于丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒（ELSA)酶结合物不稳定问题，本发明提 供一种稳定高效的酶结合物稀释液配方，保证试剂能在2~8°C条件下稳定放置1年并且降 低了成本。
[0007] 本发明是通过以下措施实现的： 一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒（ELSA)酶结合物稀释液 ① 液：用PBST为缓冲液，BSA无关蛋白为稳定剂的酶结合物稀释液的试剂盒为第一组 合； ② 液：用PBST为缓冲液，BSA和Casein无关蛋白为稳定剂的酶结合物稀释液的试剂盒 为第二组合； ③ 液：用Tris-HCl为缓冲液，BSA和Casein无关蛋白为稳定剂的酶结合物稀释液的试 剂盒为第三组合； ④ 液：用PBST为缓冲液，Casein无关蛋白为稳定剂的酶结合物稀释液的试剂盒为第四 组合。
[0008] 四种酶结合物稀释液编号和内容如下： ①PBST+BSA+防腐剂（酶用量1:15〇00 ) ② PBST+BSA+Casein+ 防腐剂（酶用量 1:10000) ③ TBST+BSA+Casein+ 防腐剂（酶用量 1:10000) ④PBST+Casein+防腐剂（酶用量1:6000 ) 用四种组合的HCV抗体酶联免疫诊断试剂盒分别对质控血清进行检测。按中国生物 制品规程要求分别进行对40°C放置试剂盒的检测和37°C放置3d试剂盒的破坏性稳定性检 测。
[0009] 本发明的有益效果： 本发明提供的酶结合物稀释液，不仅可以在2~8°C和37°C环境中稳定长期保存，稳定 性良好，可以长久应用，而且也节约了成本，既经济又好用。
[0010] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
[0011] 实施例1 酶结合物稀释液的组分及浓度为 (1)组分1 (PBST缓冲液） KH2P04 0. 2g Na2HP04 ? 12H20 2. 9g KC1 0. 2g NaCl 8.Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸馏水至l〇〇〇mL，4°C存放备用； 组分2 (稳定剂） 牛血清白蛋白（BSA) 0.lg 加洗涤缓冲液至100mL，4°C存放备用； 组分3 无。
[0012] (2)用该组合的HCV核心抗原检测试剂盒（ELISA)对质控血清进行检测。按中国 生物制品规程要求分别进行对40°C放置试剂盒的检测和37°C放置3d试剂盒的破坏性稳定 性检测。
[0013] 实施例2 组分1 (PBST洗涤缓冲液） KH2P04 0. 2g Na2HP04 ? 12H20 2. 9g KC1 0. 2g NaCl 8. Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸馏水至l〇〇〇mL，4°C存放备用； 组分2 牛血清白蛋白（BSA)+Casein 0?lg。
[0014] 实施例3 组分1 (TBST缓冲液） Tris-HCl(50mM) 6.05g NaCl 8.Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸馏水至l〇〇〇mL，4°C存放备用； 组分2 牛血清白蛋白（BSA)BSA+Casein0.lg加洗涤缓冲液至100mL，4°C存放备用； 组分3 硫柳汞 0. 1%。
[0015] 方法同实施例1 加洗涤缓冲液至l〇〇mL，4°C存放备用。
[0016] 实施例4 组分1 (PBST洗涤缓冲液） KH2P04 0. 2g Na2HP04 ? 12H20 2. 9g KC1 0. 2g NaCl 8.Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸馏水至l〇〇〇mL，4°C存放备用； 组分2 Casein 0.lg 加洗涤缓冲液至100mL，4°C存放备用； 组分3 硫柳汞 0. 1%。
[0017] 方法同实施例1。
[0018] 操作时为保证酶结合物稀释液为同一条件下进行对比，用同一批丙型肝炎病毒核 心抗原检测试剂（ELISA)。同时配制以上四种不同酶稀液的抗HCV酶结合物，组成四组试剂 盒，对这四组试剂盒作平行对比实验。
[0019] 实验时严格按试剂盒说明书进行操作，每一组合加阴性对照、阳性对照各3孔，加 1Ncu/ml，2Ncu/mlHCV血清各10孔，1份阳性质控血清（以P表示）加10孔，40份HCV 阴性血清各加1孔，共加样76份。计算出阴性对照、阳性对照、1Ncu/ml，2Ncu/ml、阳性质 控血清P的平均S/C0值和40份抗HCV阴性血清的平均S/C0值。
[0020] 酶标抗体活性验证： 表1四种试剂盒放置4°c检测质控血清的S/C0平均值及实验结果
【主权项】
1. 一种稳定的丙型肝炎病毒核心抗原酶结合物稀释液，其特征在于包括组分1、组分2 和组分3,各组分原料含量如下： 组分I (TBST缓冲液） Tris-HCl(50mM) 6. 05g NaCl 8.Og Tween-20 0. 05% 0. 5mL 加蒸馏水至l〇〇〇mL，4° C存放备用； 组分2 牛血清白蛋白（BSA) BSA+Casein 0.1 g 加洗涤缓冲液至100mL，4° C存放备用； 组分3 硫柳汞 0. 1%。
2. 根据权利要求1所述的一种稳定的丙型肝炎病毒核心抗原酶结合物稀释液，其特征 在于包括组分1中缓冲液为PH7. 4TBST缓冲液。
3. 根据权利要求1所述的一种稳定的丙型肝炎病毒核心抗原酶结合物稀释液，其特征 在于包括组分2中稳定剂牛血清白蛋白（BSA) BSA+Casein。
4. 根据权利要求1所述的一种稳定的丙型肝炎病毒核心抗原酶结合物稀释液，其特征 在于包括组分3中防腐剂硫柳汞。
【专利摘要】本发明一种稳定的丙型肝炎病毒核心抗原酶结合物稀释液涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种稳定的丙肝核心抗原酶结合物稀释液，包括组分1、组分2和组分3，组分1中含有PBST缓冲液，组分2中含ＢＳＡ和Casein；组分3中含１％硫柳汞。本发明提供一种稳定高效的酶结合物稀释液配方，保证试剂能在2～8℃条件下稳定放置1年并且降低了成本。
【IPC分类】G01N33-576
【公开号】CN104849460
【申请号】CN201510287239
【发明人】魏海明, 侯亚兰, 甘宜梧, 王春艳, 李静
【申请人】山东博科生物产业有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月29日