三七总皂苷在制备直接抗丙型肝炎病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体设及=屯总皂巧在制药领域中的新用途。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（HCV)引起的丙型肝炎是严重危害人类健康的感染性疾病，该疾病 感染发病率高，慢性化率高、无疫苗可预防、病程迁延进展，迄今仍是世界性的医学难题和 社会的沉重经济负担。目前治疗慢性丙型肝炎（CHC)普遍采用的是抗病毒疗法[干扰素 (IFN) +利己韦林]，疗效偏低，特别是对我国主要的流行型HCV2a疗效差，持续病毒学应答 率（SVR)仅约50 - 60%，且干扰素和利己韦林的不良反应也对治疗剂量及疗程产生影响。 直接抗病毒药物值AA)的出现为治疗CHC提供了更多选择，但DAA的临床使用经验有限，一 些问题如对药物的耐受性、联合使用及耐药性、价格昂贵等问题使其并不能立即广泛应用 于临床。
[0003] 传统中医药已普遍应用于CM：的治疗，目前在临床上应用的中药和中成药颇多， 在保肝、抗病毒方面均取得了一定的效果，也为CHC的治疗提供了更多选择。临床正在使用 的苦参素就是从天然植物苦豆子中提取的单体氧化苦参碱，在慢性乙型肝炎和CM：的临床 使用过程中已经取得公认的疗效。
[0004]S屯为五加科多年生草本植物，S屯总皂巧（Panaxnotoglnsengsaponins，PNS) 是S屯的主要活性成分。近年来对PNS药理活性的研究很多，已证实其在中枢神经系统、屯、 脑血管系统、血液系统、免疫系统W及抗纤维化、抗衰老、抗肿瘤等方面均具有广泛生理活 性。中医学认为慢性肝炎的致病原因乃湿热疫毒留滞血脉，聚于肝体，导致肝郁，进而脾虚 或肝肾阴虚，最终导致气滞血疲、疲血阻络。=屯总皂巧可W通过活血化疲，通脉活络来改 善留滞血脉，肝肾阴虚，进而达到气血流杨。立屯总皂巧在防护肝损伤、抗肝纤维化方面的 重要作用得到了进一步证实。太永日等用=屯总皂巧治疗病毒性肝炎高胆红素血症病人 【太永日，崔伟哲屯总皂巧治疗病毒性肝炎高胆红素血症35例疗效观察[J].临床肝胆 病杂志，1999,15(3) :184】；熊磊等发现=屯总皂巧抗肝纤维化作用可能是通过抑制肝星状 细胞增殖及细胞内外I型胶原生成来实现的（熊磊，刘平.S屯皂巧对肝星状细胞及胶原 生成的影响[J].中西医肝病杂志，1999,9(3) :19);李哲等用造成大鼠离体灌流肝损伤模 型，并观察了PNS对该模型的影响，表明PNS能明显增加血管流量，改善肝脏微循环，减轻肝 损伤（李哲.S屯总皂巧对大鼠离体灌流巧的影响[J].云南中医学院学报，1993,16似： 11);余万桂用红外无创伤检测S屯能显著改善肝脏缺血缺氧，保护肝细胞。治疗病毒性肝 炎不一定是直接抗丙型肝炎病毒，至今未发现=屯皂巧直接用于制备抗HCV病毒药物方面 的报道。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是提供=屯总皂巧在制备直接抗丙型肝炎病毒药物中的应用。
[0006] 本专利申请人进行了体外抗HCV活性测试，结果表明S屯总皂巧能明显抗HCV的 复制，且无细胞毒性。具体说，本发明利用化h7. 5. 1细胞系及HCV细胞培养病毒（HCVcc)，W利己韦林和干扰素作为阳性对照，对=屯皂巧进行了体外抗HCV活性评价，结果表明=屯 总皂巧具有明显抗HCV病毒活性且无细胞毒性。
[0007] 本发明所说制备药物的含义是=屯总皂巧可W与任合药剂学上可接受的辅料制 成制剂，例如可W制成任何常规口服剂型：散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、悬浮 液、糖浆、口腔含片、舌下含片等。
[0008] 本发明使用的S屯总皂巧可采用W下方法制备，但不限于此：
[0009] 取=屯生药材，加入水、生物酶提取，醇沉淀或澄清剂澄清，上清液浓缩一定浓度 后上大孔树脂进一步分离，有机溶剂洗脱，收集洗脱液离子交换树脂脱色，收集洗脱液，浓 缩、干燥即得。
[0010] 为更好地理解本发明，下面通过利用化h7. 5. 1细胞系及HCV细胞培养病毒 (HCVcc)，W干扰素作为阳性对照，对=屯皂巧进行体外抗HCV活性、细胞毒性进行评价，来 说明=屯总皂巧的新用途，即=屯总皂巧在制备直接抗丙型肝炎病毒药物中的应用。
[0011] 实验：S屯总皂巧体外抗丙型肝炎病毒（HCV)
[0012] S屯皂巧的制备：取S屯粗粉末200g，加水1500ml，加入适量生物酶，调抑后，置 水浴酶解提取，提取液备用。残渣用第一次生药重量5倍量的水提两次，合并=次提取液， 加入澄清剂静置絮凝，离屯、分离，澄清液减压浓缩，上D101型树脂，先用水洗脱至无Molish 反应，再用乙醇洗脱至无皂巧反应，乙醇洗脱液经阴离子交换树脂脱色，浓缩、喷雾干燥得 S屯总皂巧。
[0013] 采用上述方法制备=屯总皂巧样品1、2、3,制备条件及总皂巧含量如表1所示：
[0014] 表1S屯总皂巧样品1、2、3制备条件及总皂巧含量 阳(T[i
[0016] 样品及处理：称取适量药物溶解在100%的DMS0中，制备成lOOmg/ml的储存液； 0. 22ym滤膜过滤除菌，用DMS0依次稀释7个梯度。
[0017] 细胞和病毒：人肝癌细胞株化h7. 5. 1使用DMEM培养基，添加10%FBS和1%双 抗，在5%C02,37°C条件下培养；HCV细胞培养病毒（HCVcc)由包含2a亚型的HCV全基因组 J6/JFH- 1质粒经体外转录为RNA后转染化h7. 5. 1细胞，经培养后得到的高毒力、高感染 力的HCV病毒液。 阳0化]药物抗肥V活性检测：取对数生长期的Huh7. 5. 1细胞，W1. 5X104cells/well铺于96孔板，贴壁5小时后，加入水梯度稀释药物，5倍稀释，6个稀释度，每个梯度设=个 重复孔，同时加入病毒，设细胞对照、病毒对照、抗HCV阳性对照（干扰素）、水对照，终体积 200yL/wel1。将培养板置于37°C、5 %C〇2培养箱进行培养，72后收集上清3000rmp/min离 屯、lOmin，分别取lOOul澄清上清提取的病毒RNA，利用巧光定量PCR技术进行HCVRNA拷 贝数定量检测。w空白对照孔的病毒载量为对照，分别计算不同浓度药物的抑制率（％ )， 最后采用GraphPadPrisms软件计算药物ECw(半数效应浓度，抑制细胞中HCV病毒载量 50%的药物浓度）的值，并绘制量一效曲线图。
[0019]MTT法检测药物细胞毒性：取对数生长期的Huh7. 5. 1细胞，W1X104cells/well 细胞铺于96孔板，贴壁化后，加入2yLDMS0 -De梯度稀释的药物，10倍稀释，6个稀释度， 每个梯度设=个重复孔，同时设置空白对照（只含培养基）、细胞对照、DMS0 -De对照及抗 HCV阳性药物利己韦林对照，终体积200yL/well。将培养板置于37°C5%C〇2培养箱进行 培养。7化后，于实验孔加入20yL的5mg/血MTT溶液，37°C5% %解育4小时。弃去上 清，加入150yL/well的DMS0 -的，振荡溶解lOmin后，于酶标仪上测定0〇49。的值，W空白 对照孔的0D值为对照，分别计算不同浓度药物的抑制率（％)，最后采用GraphPadPrisms 软件计算药物CCw(CCw:细胞生长抑制50%所需的药物浓度）的值，并绘制量一效曲线图。
[0020] 实验结果；
[0021]按上述方法，对利己韦林及上述=屯总皂巧样品1、2、3进行及体外抗HCV活性实 验，其细胞毒性（CCJ及活性巧CJ如表2所示。
[0022] 表2S屯當皂巧抗肥V活性
[0023]
[0024]S屯总皂巧1、2、3样品具有明显抗HCV病毒活性，且无细胞毒性，毒副作用远远优 于利己韦林。
[00巧]本发明的有益效果：首次提供了 =屯总皂巧在制备直接抗丙型肝炎病毒药物中的 应用。 【具体实施方式】 阳0%] 实施例：取S屯粗粉末200g，加水1500ml，调PH= 5. 5,加入适量a-淀粉酶，充 分揽拌，置60°C水浴酶解提取化，提取液备用。残渣用第一次生药重量5倍量的水提两次， 合并=次提取液，加入ZTC1+1天然澄清剂絮凝，过滤，滤液减压浓缩至1/2体积，滤过，滤液 上D101型树脂，先用水洗脱至无Molish反应，再用70%的乙醇洗脱至无皂巧反应，乙醇洗 脱液经阴离子交换树脂脱色，浓缩、喷雾干燥得=屯总皂巧。取所得=屯总皂巧加适量赋形 剂按片剂常规方法制成每片重量为lOOmg或50mg的片剂，该片剂为直接抗丙型肝炎病毒的 药物，用于治疗丙型肝炎。
【主权项】
1. 三七总皂苷在制备直接抗丙型肝炎病毒药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于三七总皂苷可以与任合药剂学上可接受的辅 料制成制剂。
【专利摘要】三七总皂苷在制备直接抗丙型肝炎病毒药物中的应用，属于医药领域。采用体外细胞水平的方法进行了三七总皂苷抗HCV活性和毒性测试，结果表明，三七总皂苷具有良好的抗HCV活性，并且毒性低，明显优于对照组，临床用药安全。本发明首次提供了三七总皂苷在制备直接抗丙型肝炎病毒药物中的应用，有望开发出直接抗丙型肝炎病毒的药物。
【IPC分类】A61P31/14, A61K36/258
【公开号】CN105147753
【申请号】CN201510695240
【发明人】何严萍, 冯悦, 杨军锋, 夏雪山, 姚赟, 李聪, 王月平
【申请人】云南大学, 昆明理工大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月23日