专利名称：鉴定丙型肝炎病毒类型的方法以及用于此方法的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定丙型肝炎病毒(HCV)类型，本发明尤其涉及使用新的类型依赖性肽类化合物鉴定HCV的方法。
背景技术：
已知病毒性肝炎是由五种不同的、已知为肝炎甲、乙、丙、丁和戊型病毒所引起的。HAV是RNA病毒，它不会引起长期临床症状，HBV是DNA病毒，HDV是依赖性病毒，没有HBV的存在它不能感染细胞，HEV是水生病毒。Houghton等人在欧洲公开专利388,232中最先发现和鉴定出作为非甲非乙型肝炎(NANBH)病因的HCV。这导致公开了它们在鉴别HCV中可用作免疫试剂的大量一般性和特异性多肽。例见Choo et al，(1989)Science，244359-362；Kuo et al.(1989)Science，244362-364；and Houghton et al.(1991)Hepatology，14381-388。HCV是引起与输血相关的肝炎的主要病因。
欧洲公开专利318,216和388,232中表征了HCV的原型分离物。本文所用的术语“HCV”包括新近分离的NANBH病毒种，术语“HCV-1”是指上述出版物中所述的病毒。
自最初鉴定HCV以来，已经鉴定出了至少六种不同的病毒类型并被命名为HCV-1至HCV-6。(Cha et al.(1992)Proc.NaH.Acad.Sci.USA，897144-7148。)在这些类型中有大量的亚型，感染患者的病毒类型会影响到临床预后并对不同治疗产生反应。(Yoshiokaet al.(1992)Hepatology，16293-299)。根据HCV感染最严重的临床结果是肝细胞癌这一事实，对确定感染患者的是何种类型HCV是有用的。
最近使用的确定病毒类型的方法是基因定型即分离病毒RNA，并通过聚合酶链反应(PCR)测定不同片段的序列。此方法不仅费力又费时，而且对在不允许保存RNA的条件下贮存的样品或者来自病毒效价不够大的患者中的样品是不适用的。通过免疫分析或血清定型来鉴定HCV类型的方法将是有用的。
用来筛选血液和诊断患者的最新方法是免疫测定法，免疫测定法使用含有足够量共有抗原决定基的HCV-1抗原以识别抗其它类型HCV的抗体。免疫测定法不能区分不同类型HCV的感染。本发明的公开本发明包括通过基因型和血清型鉴定各种HCV之类型的组合物和方法，此组合物包括编码抗原决定基的类型特异性抗原决定基核酸、类型-簇特异性抗原决定基核酸以用作探针，并包括与编码抗原决定基核酸的侧面区域互补的核酸以用作引物。
本发明一方面是鉴定HCV类型的方法，包括下列步骤提供得自个体的含抗体样品；在允许抗原-抗体结合的条件下将样品与类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基相接触；并确定样品中的抗体是否与抗原决定基结合。
本发明另一方面涉及鉴定HCV类型的方法，其步骤包括提供得自个体的含抗体样品；在允许抗原-抗体结合的条件下将样品与第一类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基相接触；在允许抗原-抗体结合的条件下将样品与第二类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基相接触；并确定样品中的抗体是否与第一或第二抗原决定基结合。
本发明的另一方面涉及含有类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基的多肽。此多肽得自于HCV基因组的三个不同区域。一套多肽包括得自HCV核心区域的类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基。第一套多肽发现于HCV-1氨基酸残基67和84之间以及其它类型HCV的同源区域。本文所用氨基酸残基的缩写如下A，丙氨酸；I，异亮氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；F，苯丙氨酸；P，脯氨酸；W，色氨酸；V，缬氨酸；N，天冬酰胺；C，半胱氨酸；Q，谷氨酰胺；G，甘氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；Y，酪氨酸；R，精氨酸；H，组氨酸；K，赖氨酸；D，天冬氨酸；和E，谷氨酸。
由核心区域衍生的具体氨基酸残基序列以及由其衍生的亚型如下1.PEGRTWAQ，亚型1a或1b。2.STGKSWGK，亚型2a或2b。3.SEGRSWAQ，亚型3a或4。
另一套多肽包括得自HCV非结构区域4(NS4)的类型特异性抗原决定基。此第二套多肽发现于HCV-1氨基酸残基1689-1718之间以及其它类型HCV的同源区域。
具体氨基酸残基序列以及由其衍生的型或亚型如下1.CSQHLPY，亚型1a。2.CASHLPY，亚型1b。3.CASRAAL，亚型2a或2b。
另一套多肽包括得自丙型肝炎病毒非结构区域5(NS5)的类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基。此套多肽发现于HCV-1氨基酸残基2281-2313之间以及其它类型丙型肝炎病毒的同源区域。
具体的氨基酸残基序列以及由其衍生的型或亚型如下1.PDYEPPVVHG，亚型1a。2.PDYVPPVVHG，亚型1b。3.PDYQPATVAG，亚型2a。4.PGYEPPTVLG，亚型2b。5.FAQASPVW， 亚型1a。6.FPPQALPIW， 亚型1b。7.FPQALPAW， 亚型2a。8.FPPQALPPW， 亚型2b。
本发明的另一方面包括编码所述类型特异性和类型-簇抗原决定基的氨基酸残基序列的核酸分子。例如，在Southern印迹法或其它DNA识别试验如美国专利4,868,105和5,124,246中所述的捕捉试验中，这些核酸分子可用作探针。
本发明的另一方面包括与编码类型特异性和类型-簇特异性抗原决定基的核酸序列侧翼区互补的核酸分子。这种核酸分子可用于进行PCR以确定特定的HCV的基因型。附图的简述
图1是血清定型实验策略的流程图。图2是全面的抗原决定基作图策略的流程图。图3是描述HCV1a抗原决定基作图结果的图集(Rodney)。图4是描述HCV2b抗原决定基作图结果的图集(Nomoto)。定义“丙型肝炎病毒”或“HCV”是指其致病类型可引起NANBH的病毒种以及由其衍生的减毒类型或缺陷性的干扰颗粒。一般性参见本部分所引用题为“背景技术”的出版物。HCV基因组由RNA组成。含有RNA的病毒自发突变率相对较高，椐报道每个掺入核苷酸的概率为10-3至10-4数量级。(Fields & Knipe(1986)“FundamentalVirology”(Rowen Press，NY))。由于在RNA病毒中，基因型的异质性和流动性是固有的，因而在HCV种中，有多种型/亚型，可以是有毒性或无毒性的。在文献中已阐明了不同HCV类型或分离物的增殖、鉴定、检测和分离。如本文所述，所有核苷酸和氨基酸残基序列都来源于所述的HCV类型。HCV-1基因组和氨基酸残基序列的数目描述于Choo et al，(1990)Brit，Med.Bull.，46423-441。本文的公开可允许诊断不同类型。
本文使用的“类型”指的是基因型差异超过约30％的HCVs；“亚型”指的是基因型差异约为10-20％的HCVs，“分离物”指的是基因型差异低于约10％的HCVs。“鉴定类型”指的是将一种类型的HCV与另一种类型的HCV区分开来。
在国际公开专利WO 93/00365中公开了几个不同HCV型/亚型的资料，尤其是型或亚型CDC/HCV1(也称作HCV-1)。来自一种型或亚型的资料，如部分基因组的或氨基酸的序列足以使本技术熟练人员使用一般技术即可分离新型的HCV，例如，接下来将描述筛选几个不同类型的HCV。利用本文所述的方法和试剂将鉴定得自大量人血清(来自不同的地理区域)的这些类型。
已推断出HCV-1基因组RNA的基因组结构和核苷酸序列。基因组似乎是含有10,000个核苷酸的单链RNA。基因组为正链，并具有编码约为3,000个氨基酸之多聚蛋白质的连续的、转译开放阅读框架(ORF)。在ORF中，大约在氨基末端区域的第一个四分之一处编码结构蛋白质，而大多数多聚蛋白质为非结构(NS)蛋白质。与所有熟知的病毒序列相比，在黄病毒科的非结构(NS)蛋白质和瘟病毒科(现在也被当作黄病毒科的一部分)中可观察到小但是值得注意的共线性同源性。
根据推断的由HCV-1核苷酸序列编码的氨基酸残基以及其它的证据，将被编码HCV多聚蛋白质的可能蛋白质区域以及大致的界限示于表1。
表1推断的区域 大致的界限(氨基酸数目)C(核壳蛋白) 1-191E1(病毒颗粒外膜蛋白)192-383E2/NS1(外膜蛋白)384-800NS2(功能未知) 800-1050NS3(蛋白酶)1050-1650NS4(功能未知) 1651-2100NS5(聚合酶)2100-3011(末端)这些区域是不明确的，例如E1-NS2界限约在750-810区域，NS3-NS4界限约在1640-1650区域。也有证据表明C的191个氨基酸(aa)译本是可进一步加工成长度约为170aa的前体，NS2、NS4和NS5蛋白每种都可进一步加工成两个成熟的蛋白质。
根据不同标准确定不同类型的HCV，例如大约为9,000个核苷酸至约12,000个核苷酸的ORF，编码大小与HCV-1类似的多聚蛋白质，被编码的多聚蛋白质与HCV-1有类似的疏水和/或抗原特性，存在与HCV-1保守的共线性多肽序列。
在鉴定HCV类型时，可单独或联合使用下述核酸同源性和氨基酸同源性参数。通常如上所述，不同类型的HCV约有70％同源性，而亚型约有80-90％同源性，分离物约有90％同源性。
本文所用的“得自于或衍生于”指定序列的多聚核苷酸是指此多聚核苷酸序列由相应于指定核苷酸序列的至少约6个核苷酸，优选至少约为8个核苷酸，更优选至少约为10-12个核苷酸，再更优选至少约为15-20个核苷酸的序列所组成。“相应”是指与指定序列同源或互补。优选地，多聚核苷酸所来自之区域的序列与HCV基因组特有的序列同源或互补。本领域已知测定核酸序列互补性的杂交技术，例见Maniatis et al.(1982)。另外，已知技术可测定由杂交形成的双链体多聚核苷酸的错配，包括例如用特异性消化双链体多聚核苷酸中单链区域的如S1的核酸酶消化。典型的DNA序列可能“得自”的区域包括但不局限于，例如编码类型特异性抗原决定基的区域以及非转录和/或非转译区域。
所得多聚核苷酸非生理必需地得自于所示核苷酸序列，但可以任何方式产生，包括例如化学合成或DNA复制或反向转录或转录。另外相应于指定序列的区域组合也可以用本领域已知的与目的用途相一致的方法来修饰。
类似地，“得自于或衍生于”指定氨基酸或核酸序列的多肽或氨基酸序列是指与此序列编码的多肽具有相同氨基酸序列的多肽或其部分，其中该部分至少含有3-5个氨基酸，更优选至少为8-10个氨基酸，甚至更优选至少为11-15个氨基酸，或者是指与此序列编码的多肽在免疫学上被证明是相同的多肽，此术语也包括由指定核酸序列表达的多肽。
重组或衍生的多肽不一定必需由指定的核酸序列转译它可以任何方式产生，包括例如化学合成，或重组表达系统的表达，或从包括突变HCV的HCV中分离。本文所述的多肽一般相对较短因而很容易化学合成。
重组或衍生的多肽在其序列中可包括一个或多个氨基酸或非天然氨基酸类似物。将氨基酸类似物插入序列中的方法是本领域已知的，本领域熟练人员已知它可包括一个或多个标记。在美国专利5,194,392中可发现对类似物和“mimotopes”的详细描述。
肽类似物包括保留了鉴定HCV类型之能力的它的缺失、增加、取代或修饰。优选的“取代”是有保守性的那些，即其中的残基被普遍型相同的另一个残基所置换。很容易理解，自然生成的氨基酸可再被分成酸性、碱性、中性和极性、或中性和非极性氨基酸，而且被编码的氨基酸中有三个是芳香族的。通常优选的是，与天然抗原决定基不同的被编码多肽含有经取代的氨基酸密码子，它来自与所置换的氨基酸相同的组，因此通常碱性氨基酸Lys，Arg和His是可以互换的；酸性氨基酸Asp和Glu是可以互换的；中性极性氨基酸Ser，Thr，Cys，Gln和Asn是可以互换的；非极性脂肪族氨基酸Gly，Ala，Val，Ile和Leu相互之间的关系是保守的(但是由于大小的关系，Gly和Ala更密切相关，Val，Ila和Leu更密切相关)，芳香族氨基酸Phe，Trp和Tyr是可以互换的。尽管脯氨酸为非极性中性氨基酸，但由于其对构象的影响而表现出困难，用脯氨酸取代或取代脯氨酸是不优选的，除非可得到相同或相似的构象结果。显示保守性变化的极性氨基酸包括Ser，Thr，Gln，Asn；较低程度的为Met。另外，Ala，Gly和Ser尽管被划分至不同的种类，但它们似乎仍可以互换，Cys也可分到此组中，或者划分为极性中性氨基酸。
还应说明如果多肽是合成制备的，也可用非基因编码的氨基酸来取代，另外的残基包括例如式H2N(CH2)nCOOH的ω氨基酸，其中n为2-6。这些是中性、非极性氨基酸，这与肌氨酸(Sar)，t-丁基丙氨酸(t-BuA)，t-丁基甘氨酸(t-BuG)，N-甲基Ile(N-MeIle)和正亮氨酸(Nle)一样。例如苯基甘氨酸可取代被芳香族中性氨基酸Trp，Tyr或Phe；瓜氨酸(Cit)和蛋氨酸亚砜(Mso)是极性的但也是中性的，环己基丙氨酸(Cha)是中性和非极性的，磺基丙氨酸是酸性的，鸟氨酸(Orn)是碱性的，如果一个或多个这些残基被羟脯氨酸(Hyp)取代则可保留赋予脯氨酸残基特性的构象。
本文所用的术语“重组多聚核苷酸”意思是指根据其来源或操作来分的基因组、cDNA、半合成或合成来源的多聚核苷酸所述多聚核苷酸(1)与天然相关的多聚核苷酸的全部或部分不相关，(2)与非天然相连接的多聚核苷酸相连接，或(3)并不是天然产生的。
本文所用的术语“多聚核苷酸”是指任何长度的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的核苷酸聚合物形式。此术语仅指分子的一级结构，因此此术语包括双链和单链DNA和RNA，它也包括已知的修饰形式，例如本领域已知的标记物形式，甲基化形式，“帽结构”，用类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸，核苷酸间的修饰，例如那些具有不带电荷键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的，那些含有悬而未决部分的，例如包括但不局限于核酸酶、毒素、抗体、信号肽和多聚-L-赖氨酸的蛋白质，那些具有嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)的，那些含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的，那些含有烷化剂的，那些具有经修饰键(例如α端基异构核酸等)的以及多聚核苷酸的未修饰形式。本文所述的多聚核苷酸相对较短，因此最容易化学合成。
“纯化”的多肽是指处于实质上已除去其它多肽之状态下的多肽，即在组合物中它最低约占重量的50％(所需多肽/组合物中总的多肽)，优选最低约占70％，甚至更优选所需多肽最低约占90％，而不用考虑组合物中的非蛋白质物质。纯化病毒多肽的技术是本技术中已知的，在本技术中对纯化的抗体有类似的限定。
本文所用的“抗原决定基”指多肽的抗原决定部位。一个抗原决定基可含有3个或更多的确定抗体结合位点的氨基酸。通常，一个抗原决定基由至少5个氨基酸组成，有时由至少8个氨基酸组成。抗原决定基的作图方法是本领域熟知的。
本文所用的“类型特异性抗原决定基”是指在一种HCV类型中发现的抗原决定基，“类型-簇特异性抗原决定基”是在多于一种但不是所有的HCV类型中发现的。例如，可用经HCV1感染的患者的抗体识别一种特定的抗原决定基，但不能用经HCV2感染的患者的抗体识别或有效识别。类似地，可用经HCV-3或HCV-4感染的患者的抗体识别得自HCV-3或HCV-4的类型-簇特异性抗原决定基，但不能用经HCV-1或HCV-2感染的患者的抗体识别。“保守的抗原决定基”是那些能被对所有HCV类型都有特异性的抗体所识别的抗原决定基。
由于抗体识别多肽中所含的特异性抗原决定基，所以多肽与能结合于肽的抗体有“免疫反应性”。通过抗体结合，更具体地可通过抗体结合的动力学，和/或通过使用含有抗体所针对的抗原决定基之已知多肽作为竞争剂而产生结合竞争可测定免疫反应性。测定多肽是否对抗体有免疫反应性的技术是本领域已知的。
本文所用的术语“抗体”是指由至少一个抗体结合位点组成的多肽或多肽组。通过折叠抗体分子的不同区域以形成内表面形状和电荷分布与抗原的抗原决定基特征互补的三维结合空间可形成“抗体结合位点”或“结合区域”，它们可与抗原发生免疫反应。抗体结合位点可由重和/或轻链区域(分别为VH和VL)形成，它形成了导致了抗原结合的高变异环。术语“抗体”包括例如脊椎动物的抗体，杂合抗体，嵌合抗体，经改变的抗体，单价抗体，Fab蛋白质和单域抗体。
多肽特异性的抗体和多肽可由本领域熟知的方法制备，例如，通常将多肽悬浮于生理可接受的缓冲液中，与适当佐剂相混合并注射给动物。制备多克隆和单克隆抗体的方法是本领域中已知的，本文中不再详细描述。
术语“多肽”是指氨基酸的聚合物，而不是指特定长度的产物；因此对多肽的限定中包括多肽，寡肽和蛋白质。此术语不是指或排除了多肽的表达后修饰，例如糖基化，乙酰化，磷酸化等等。此限定中还包括例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，具有经取代键的多肽以及本领域已知的自然发生和非自然发生的其它修饰。
本文所用的“治疗”是指预防和/或治疗。
本文所用的“个体”是指脊椎动物，尤其是哺乳动物种中的成员，包括但不局限于动物(例如狗、猫、牛、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、几内亚猪等等)和灵长类，包括猴、猩猩、狒狒和人。
本文所用的核酸“有义链”含有与mRNA序列同源的序列，“反义链”含有与“有义链”互补的序列。
本文所用的病毒“正链基因组”指其中无论为RNA或DNA，其基因组呈单链的并编码病毒多肽。正链RNA病毒的例子包括披膜病毒科、冠状病毒科、反录病毒科、小RNA病毒科和嵌杯状病毒科，也包括先前被分到披膜病毒科的黄病毒科，见Fields&Knipe(1986)。
本文所用的“含有身体样品的抗体“是指个体身体的成分为感兴趣抗体的来源。本领域已知含有身体成分的抗体，它包括但不局限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、呼吸道的外切面、肠和生殖泌尿道、眼泪、唾液、乳汁、白血细胞和骨髓瘤。
本文所用的“生物样品”是指分离自个体的组织或液体样品，包括但不局限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外切面、呼吸道、肠和生殖泌尿道、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。也包括体外细胞培养组分的样品(包括但不局限于由细胞在培养基中生长而得到的限定培养基，推定为经病毒感染的细胞，重组细胞和细胞成分)。完成本发明的方式除非另有说明，本发明的实施将使用本领域熟练人员已知的分子生物学、微生物学、重组DNA、多肽和核酸合成以及免疫学的常规技术。这些技术在文献中已被全面解释，例见Maniatis.Fitsch&Sambrook，″Molecular CloningA Laboratory Manual″(1982)；″DNA Cloning，Volumes I and II″(D.N.Glover ed.1985)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait ed.，1984)；″Nuclei Acid Hybridization″ (B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984)；″Transcription and Translation″(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney ed.1986)；″Immobilized CellsAnd Enzymes″(IRL Press，1986)；B.Perbal，″A Practical Guide ToMolecular Cloning″(1984)；the series，″Methods in Enzymology″(AcademicPress，Inc.)；″Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells″(J.H.Miller andM.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)，Meth.Enzvmol，Vol.154 and Vol.155 (Wu and Grossman，and Wu，eds.，respectively)，Mayer and Walker，ads.(1987)，″Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology”(Academic Press，London)，Scopes，(1987)”ProteinPurificationPrinciples and Practice″，Second Edition(Springer-Verlag.N.Y.)；and”Handbook of Experimental Immunology”，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.1986)。
本文上下文提到的所有专利、专利申请和出版物均并入本文作为参考文献。
本发明包括检测HCV以及鉴定不同类型HCV感染的方法，本发明也包括用于此方法的多肽和核酸分子。
检测和鉴定HCV感染类型的方法包括免疫测定法以及核酸鉴定法，后者包括但不局限于Southern印迹分析和聚合酶链反应。为了鉴定HCV感染，可在允许抗原-抗体结合的条件下将生物样品与本文所述的某个多肽一起温育，并测定样品中的抗体是否与多肽上存在的抗原决定基结合。免疫测定法和诊断试剂盒含有类型特异性抗原决定基和类型-簇特异性抗原决定基的肽类可用于免疫测定法以检测生物样品中HCV抗体的存在，或者病毒和/或病毒抗原的存在。免疫测定法的设计需经大量改变，本领域已知多种形式的改变，免疫测定法需利用至少一种类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基，在一个实施例中，免疫测定法使用了类型特异性抗原决定基和/或类型-簇特异性抗原决定基。
使用抗原决定基测定类型特异性或类型-簇特异性抗体的存在从而可将多肽用于鉴定HCV类型。此多肽也适用于产生类型或类型-簇特异性抗体，它们随后可用于区分不同类型HCV的免疫测定法。
此多肽衍生于HCV基因组的三个不同区域，一套多肽包括得自HCV核心区域的类型或类型-簇特异性抗原决定基，另一套多肽包括得自HCV非结构区域4(NS4)的类型或类型-簇特异性抗原决定基，另一套多肽包括得自丙型肝炎病毒非结构区域5(NS5)的类型或类型-簇特异性抗原决定基，此套多肽发现于HCV-1氨基酸残基2281-2313之间以及其它类型丙型肝炎病毒的同源区域。
此多肽适用于一种或多种HCV类型的免疫测定法。在允许抗原-抗体结合的条件下将样品与一种或多种含类型-簇特异性抗原决定基的多肽相接触，并测定样品中的抗体是否与抗原决定基结合即可测定一种类型。
在区分特定类型HCV的免疫测定法中，从个体中得到生物样品，在允许抗原-抗体结合的条件下将样品与第一种类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基相接触，在允许抗原-抗体结合的条件下将样品与第二种类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基相接触，并测定样品中的抗体是否与第一或第二抗原决定基结合。含有类型和/或类型-簇特异性抗原决定基的许多多肽都可重复这些步骤。
典型地，抗-HCV抗体的免疫测定法包括筛选和制备怀疑含有抗体的检测样品，如生物样品，然后在允许抗原-抗体复合物形成的条件下将样品与类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基一起温育，然后检测这种复合物的形成。适当的温育条件是本领域中熟知的。免疫测定法可以不受限制地为不均一或均一的形式，并可以是一般的或竞争性的形式。
在不均一的形式中，类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基典型地与固体支持物结合以促使温育后多肽与样品的分离。可以使用的固体支持物的例子包括但不局限于硝酸纤维素(例如以膜或微量孔的形式)，聚氯乙烯(例如为纸片或微量孔)，聚苯乙烯乳胶(例如为小珠或微量滴定板)、聚偏氟乙烯(已知为Immulon)、重氮化纸、尼龙膜、活性小珠和Protein A珠。例如在不均一的形式中可使用Dynatech Immulon1或Immulon2微量滴定板或0.25英寸的聚苯乙烯小珠(Precision Plastic Ball)。典型地，从检测样品中分离出含有类型特异性抗原决定基或类型-簇抗原决定基的固体支持物后，在检测结合抗体之前要经洗涤，一般的和竞争性的形式都是本领域已知的。
在均一的形式中，将检测样品与溶液形式的类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基一起温育，例如它可处于能加速任何抗原-抗体复合物形成的条件之下，这些测定法的一般的和竞争性的形式都是本领域已知的。
在标准形式中，可直接监测形成抗体-类型或类型-簇特异性抗原决定基复合物的HCV抗体的量。通过测定可识别抗-HCV抗体上之抗原决定基的经标记抗-异种(例如抗-人)抗体是否因复合物的形成而结合即可实现此目的。在竞争性的形式中，通过监测对复合物中已知数量的标记抗体(或其它竞争性配体)结合的竞争性作用可推导出样品中HCV抗体的量。
在抑制检测中，测定抗体与含有不同类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基多肽的结合能力。将抗体先暴露于含有一种类型或类型-簇HCV的抗原决定基的多肽中，再暴露于含有另一种类型或类型-簇HCV的抗原决定基的多肽中，对其它类型或类型-簇HCV也可重复此过程。
所形成的含有抗-HCV抗体的复合物(或者在竞争性检测中，竞争性抗体的量)可通过依赖于实验方案的大量已知技术中的任何一种来测定。例如，使用抗异种Ig与标记物(如酶标记物)复合的偶联物可检测复合物中未被标记的HCV抗体。
在典型的免疫测定法中，在允许抗原-抗体复合物形成的条件下，将检测样品，典型地为生物样品与含有一种或多种类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基的多肽一起温育。可以使用不同的方式，例如可使用“三明治测定法”，其中与固体支持物结合的抗体同检测样品一起温育；洗涤；与第二、经标记的分析物抗体一起温育；重新洗涤支持物。通过测定第二抗体是否与支持物结合可检测分析物。在可为不均一的或均一的竞争性检测中，通常将检测样品与抗体一起温育，还需温育经标记的竞争性抗原，这两者可相继地或同时地进行。本领域中熟知这些和其它的实验形式。
在免疫测定法中可使用直接抗类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基的抗体以检测携有导致NANBH的HCV的患者以及被感染的供血者中的病毒抗原，而且这些抗体对检测急性期供血者和患者十分有用。
免疫测定法可使用例如直接抗类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基的单克隆抗体，结合直接抗一种病毒抗原的抗原决定基的单克隆抗体、直接抗不同病毒抗原的抗原决定基的单克隆抗体，直接抗相同病毒抗原的多克隆抗体，或者直接抗不同病毒抗原的多克隆抗体。实验方案可根据例如竞争、或直接反应、或三明治类型测定。实验方案也可使用例如固体支持物或免疫沉淀法。大多数测定法包括使用经标记的抗体或多肽；标记物可为但不局限于酶的、荧光的、化学发光的、放射性的或染料分子。扩增探针信号的测定法也是已知的；其例子为利用生物素和亲和素的测定法以及经酶标记和介导的免疫测定法，如ELISA测定法。
本发明进一步包括编码所述类型特异性抗原决定基和类型-簇特异性抗原决定基的氨基酸残基序列的核酸分子。例如这些核酸分子在Southern印迹法或如美国专利4,868,103和5,124,246所述捕捉测定法的其它DNA识别测定法中可用作探针。
通过表达HCV cDNAs对抗原作图所做研究表明大量含有这些cDNAs的克隆表达了多肽，此多肽对表现为NANBH之个体的血清有免疫反应性。单个的多肽对所有血清都没有免疫反应性。这些多肽中的五个免疫原性很强，因为在很多不同病人的血清中都可检测到这些多肽中HCV抗原决定基的抗体，尽管检测中的重叠尚不完全，因此在不同克隆中编码的多肽的免疫原性结果可表明HCV感染的有效检测系统也包括使用抗原决定基系列，此系列中的抗原决定基可被构建成一种或多种多肽。不同抗原决定基的测定可以相继地或同时地进行。
适于免疫诊断并含有适当经标记试剂的试剂盒是通过在适当容器中装入适当物质构成的，这些物质包括含有类型特异性抗原决定基和类型-簇特异性抗原决定基的本发明多肽或者直接抗类型特异性抗原决定基和类型-簇特异性抗原决定基的抗体，以及实施此测定法所需的其余试剂和物质，以及一套合适的测定方法说明。
本发明进一步包括与编码类型特异性抗原决定基和类型-簇特异性抗原决定基核酸序列的侧翼区域互补的核酸分子，这种核酸分子可用于进行PCR以测定特殊HCV的基因型。
应指出在HCV基因组中有可变的和高变异性的区域；因此这些区域中的同源性有望比整个基因组中的同源性明显要低一些。
本领域已知测定核酸和氨基酸序列同源性的技术。例如可直接测定氨基酸序列并与本文提供的序列相比较，另外还可测定推断的HCV基因组物质的核苷酸序列(通常通过cDNA中间体)，也可测定本文编码的氨基酸序列并与相应区域相比较。
上述讨论和例子仅为阐明本发明，本领域普通的技术人员会认识到本发明还能以其它方式完成，本发明仅参照权利要求而被限定。
实施例1比较各种不同类型HCV的主要抗原决定基比较不同类型和亚型的HCV不同区域之间氨基酸残基的同源性，HCV亚型如Simmonds系统发育分析所述。氨基酸序列的编号对应于原型HCV-1序列中所述编号。(Choo et al)。表2表明NS4区域类型特异性抗原决定基和类型-簇特异性抗原决定基和保守的主要抗原决定基氨基酸残基同源性的百分数，表3表明NS5区域的两种类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基之间氨基酸残基的同源性。表4表明核心区域保守的主要抗原决定基和类型特异性抗原决定基氨基酸残基同源性的百分数。
表2不同HCV亚型之间的氨基酸同源性(％)
表3不同HCV亚型之间的氨基酸同源性(％)
表4不同HCV亚型之间的氨基酸残基的同源性(％
实施例2肽的合成合成了两套多肽，第一套设计成可进行HCV-1抗原决定基的作图，第二套设计成可测定在抗原决定基作图研究中鉴定出的哪一个抗原决定基包含类型特异性抗原决定基。在第一套多肽中，通过跨越完整HCV-1多聚蛋白质(3011个氨基酸残基)的Mimotopes可合成六十四套重叠八肽(2份)。
根据Geysen(1990)，J.Trop.Med.Pub.Health，21523-533，和Nerrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.，852149-2154所述的方法可制备第二套多肽。
在第二套多肽中，选择四个抗原区域用以类型特异性抗原决定基的合成，这些区域表示HCV-1核心NS4，NS5中非保守性序列以及HCV亚型1b，2a，3a和类型4中的其相应序列的主要抗原决定基。核心序列选自氨基酸残基67-88的较不保守的区域，NS4区域的序列选自氨基酸残基区域1689-1718，选自NS5的序列来自氨基酸残基区域2281-2313和2673-2707 。
实施例3生物样品为了测定多肽区分不同类型HCV特异性抗体的效力，从包括美国东海岸和西海岸、日本、西欧国家、南欧国家和南非的世界不同地区的24个慢性NANBH患者中得到抗血清，如Cha et al.(1992)Proc.Netl.Acad.Sci.USA，897144-7148中所述进行病毒RNA的分离，cDNA合成，PCR扩增，DNA测序和寡核苷酸探针杂交。
实施例4抗原决定基作图为了测定HCV的哪个区域含有抗原决定基，无论是类型特异性的还是保守的，需对完整的HCV-1多聚蛋白质进行抗原决定基作图，所用方法基本如图2所列。
用跨完整HCV-1多聚蛋白质(3011个氨基酸)的Mimotopes合成64套(2份)重叠八肽，选择40个样品系列用以抗原决定基作图和簇分析，这些样品包含25个美国HCV抗体活性样品，9个日本HCV活性样品和6个HCV无活性阴性对照样品。使用标准ELISA方法进行免疫测定。
鉴定主要抗原决定基的标准基于抗体对这些抗原决定基反应的频率和强度(效价)，结果示于图3和4。
实施例5肽衍生的酶联免疫吸附测定法为确定使用实施例2中所述多肽的最适免疫测定法，可运行两种独立类型的多肽衍生的酶联免疫吸附测定(ELISA)，并比较其结果，第一种类型的ELISA是Nunc MaxiSorbTM，肽类简单地吸附于其上；第二种类型使用了Nunc Covalink NHTM，多肽共价连接于其上，通过加入碳二亚胺可启动羧酸和胺之间酰胺键的形成，为减少水解作用，可通过在上述连接步骤中加入N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)来制备活性酯。
第一种类型的ELISA所用的微量滴定板可按下述进行。将多肽置于Nunc MaxiSorbTM微量滴定板的孔中，每孔含100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中多肽浓度为1μg/孔。在室温下使多肽吸收过夜，然后用不含有去污剂的PBS将微量滴定板洗涤四次，再用220μlSuperlock(Pierce)将孔后覆盖1小时，然后不需进一步洗涤而抽吸小孔并真空干燥。
按下述进行测定，在含有100μl5％脱脂牛奶的小孔中加入5μl血清样品，在37℃下温育1小时，然后用含0.05％吐温的PBS洗涤小孔五次，使用经辣根过氧化物酶(Jackson Laboratories)标记的亲和纯化的山羊抗人IgG偶联物测定人抗体对多肽的结合水平。在150mMNaCl，PBS，5％马血清(热变性)中将偶联物先稀释至5％IgG，将100μl偶联物置于小孔中，在37℃下温育1小时，在室温下用PBS/吐温和OPD[邻苯二胺-2HCl，每份显色剂缓冲液一片(柠檬酸盐磷酸盐缓冲的0.02％H2O2)；Sigma]洗涤小孔五次，达30分钟，测定492nm和620nm处的吸光率(Abs)。The cut off wasdetermined from 200 random(normal)samples where sevenstaudard deviations from the mean or about 0.45。
第二种类型ELISA所用的微量滴定板按下述进行，将多肽置于Nunc MaxiSorbTM微量滴定板的小孔中，每孔含50μl水，其中多肽浓度为10mg/孔。向多肽中加入25μl0.1M的NHS(sulfo-N-hydrosucinimide，Pierce)和25μl0.1M的EDC[1-乙基-3(3-二甲氨基丙基碳二亚胺)Sigma]，在震动台上于室温下混合30分钟，然后将整个内容物加入52ml冰冷的0.1M碳酸钠中，pH8.6。用100μl此混合物覆盖微量滴定板的小孔，再在4℃下孵育30分钟，用PBS/0.1％曲通X-100将小孔洗涤四次，然后用Superblock处理滴定板，并按上述进行测定。
所得结果示于下列表5-14。
表6不同HCV类型的抗原决定基血清定型分析序列区域NS4(1689-1718)样品描述肽/EIA 不同HCV依赖于类型的序列信号/终止类型的肽(I)受雇供血者样品SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIcp402-10(1a)SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIcp402-11(1b)SGRPAVIPDREVLYQFDEMEECASHLPYIcp402-12(2a)NQRAVVAPDKEVLYEAFDEMEECASRAALIcp402-13(2b)NDRVVVAPDKEILYEAFDEMEECASKAALI* ** *受雇供血者样品fF25910(1a) 5.54 cp402-10(1a)9.71 cp402-11(1b)8.28 cp402-12(2a)6.63 cp402-13(2b)6.87 godC100 ELISA(1a)PDREVLY与共同的抗原决定基1a，1b，2a&2b反应KI(II)与类型特异性抗原决定基反应的样品FF25931 5.74cp402-10(1a)7.43cp402-11(1b)8.89cp402-12(2a)14.5 cp402-13(2b)7.25oodC100 ELISA(1a)PDREVLY与共同的抗原决定基1a，1b，2a&2b反应KI
表10 HCV核心、NS4和NS5区域主要的类型特异性抗原决定基概要核心区域主要的保守抗原决定基类型特异性抗原决定基保守的抗原决定基(15—45)(67—04)(67—84)TNRRPQDVKFPGGGQIVGGVY HCV-1a&1b-PEGRTWAQ PGYPWP(1a，1b，2a，2b，3a)LLPRRGPRLG(HCV-1) HCV-2a&2b-STGKSWGKHCV-3Aor4-SEGRSWAQ F(4)NS4区域主要的保守抗原决定基类型特异性抗原决定基保守的抗原决定基(1925-1935)(1689-1718) (1689-1718)RGNIIVSPTIIYV(HCV-1 ) HCV-1a—CSQHLPY PDREVLY(1a，1b)HCV-1b—CASHLPYKI(2a，2b)HCV-2a&2b-CASRAALKNS5区域保守的抗原决定基 类型特异性抗原决定基(2288-2294)(2281-2313)WARPDYNHCV-1a&1b-PDYEPPVVHGVHCV-2a—PDYQPATVAGHCV-2b—PGYEPPTVLGHCV-1a—FAQALPVWHCV-1b，2a&2b—FPPQALPIWAp保守的抗原决定基(2673-2707)RGENCGYRRCRASGVLTT-HCV-1a KGAQCGYRRCRASGVLPT-HCV-3a*K QT HCV-1b，2aK QS HCV-3b KGQSCGYRRCRASGVFTT-HCV-2b*
实施例6抑制检测进行抑制检测是为了测定肽是否互相竞争与抗体结合，已合成了来自不同类型HCV序列核心NS4和NS5区域的三套短多肽，这些多肽覆盖了氨基酸1689-1695，1696-1702和1711-1917的序列区域。在样品中加入10μg上述多肽，于37℃下温育1小时，再进行上述ELISA测定即可进行抑制检测。如果发现抗体结合的抑制超过50％，则可认为多肽是抑制性的，所得结果示于下列表15。
表151.SQHLPY CHIEN-101 NS4区域 1712-17171a2.ASRAAL CHIEN-102 1712-17172a3.ASKAAL CHIEN-103 1712-17172b4.PDREVLY CHIFN-104 1696-19721a，1b，2a5.PDYRPPVVHG CHIEN-105 NS5 区域2304-23131a6.PDYQPATVAG CHIEN-106 2304-23132a7.FAQALPVWCHIEN-107 2281-22881a8.FPPQALPPW CHIEN-108 2281-22882b9.STGKSWGKCHIEN-109 核心 71-782a&2b10. SEGRSWAQCHIEN-110 核心 71-784
实施例7鉴定HCV临床样品的类型将上述表16中所示的类型或类型-簇特异性抗原决定基用于实施例5中的ELISA测定以检测13个得自非甲、非乙型肝炎患者临床样品(10个受雇供血者，3个与输血相关的慢性非甲、非乙型肝炎患者)。表17列出了这些测定的结果，测定每个临床样品与相应于表示不同类型特异性或类型-簇特异性抗原决定基的所给区域(aa67-84，1689-1718或2281-2313)的十二个不同肽的反应性。每个样品给出了与每种定型肽的不反应性(NR)、反应微弱性(WR)或反应性(R)三种反应结果。这些结果预测出每个样品的HCV基因型与由PCR测定的、右边一栏所示的HCV基因型相关。表17
权利要求
1.鉴定丙型肝炎病毒类型的方法，包括下列步骤a)提供生物样品；b)在允许第一抗原决定基-抗体复合物形成的条件下，将样品与含有至少一个抗原决定基的第一试剂相接触，此抗原决定基选自对第一类型丙型肝炎病毒特异性的第一类型特异性抗原决定基和对第一类型丙型肝炎病毒簇特异性的第一类型-簇特异性抗原决定基；和c)测定样品中第一抗原决定基-抗体复合物的存在。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括下列步骤d)在允许第二抗原决定基-抗体复合物形成的条件下，将样品与含有第二抗原决定基的第二试剂相接触，此第二抗原决定基选自对第二类型丙型肝炎病毒特异性的第二类型特异性抗原决定基和对第二类型丙型肝炎病毒簇特异性的第二类型-簇特异性抗原决定基；和e)测定样品中第二抗原决定基-抗体复合物的存在。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在测定步骤中，测定是通过竞争性试验、三明治试验、免疫荧光测定、放射性免疫测定或酶联免疫吸附测定来进行的。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中至少一个类型特异性或类型-簇特异性的抗原决定基得自丙型肝炎病毒的核心区域、丙型肝炎病毒的非结构4区域或丙型肝炎病毒的非结构5区域。
5.根据权利要求4的方法，其中至少一个抗原决定基位于丙型肝炎病毒-1(HCV-1)的氨基酸残基67和84，1689和1718或2281和2313之间，或位于其它丙型肝炎病毒类型的同源区域。
6.鉴定丙型肝炎病毒类型的方法，包括下列步骤a)提供生物样品；b)在允许第一抗原-抗体复合物形成的条件下，将样品与含有至少一个对第一抗原决定基特异性之抗体的第一试剂相接触，此第一抗原决定基选自对第一类型丙型肝炎病毒特异性的第一类型特异性抗原决定基和对第一类型丙型肝炎病毒簇特异性的第一类型-簇特异性抗原决定基；和c)测定样品中第一抗原-抗体复合物的存在。
7.根据权利要求6的方法，进一步包括下列步骤d)在允许第二抗原-抗体复合物形成的条件下，将样品与含有对第二抗原决定基特异性之抗体的第二试剂相接触，此第二抗原决定基选自对第二类型丙型肝炎病毒特异性的第二类型特异性抗原决定基和对第二类型丙型肝炎病毒簇特异性的第二类型-簇特异性抗原决定基；和e)测定样品中第二抗原-抗体复合物的存在。
8.根据权利要求6或7的方法，其中在测定步骤中，测定是通过竞争性试验、三明治试验、免疫荧光测定、放射免疫测定或酶联免疫吸附测定来进行的。
9.根据权利要求6、7或8的方法，其中第一抗原决定基是得自丙型肝炎病毒核心区域、丙型肝炎病毒非结构4区域或丙型肝炎病毒非结构5区域的类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基。
10.根据权利要求9的方法，其中第一抗原决定基位于丙型肝炎病毒-1(HCV-1)的氨基酸残基67和84，1689和1718，或2281和2313之间，或位于其它丙型肝炎病毒类型的同源区域。
11.具有相应于丙型肝炎病毒之类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基之氨基酸残基序列的多肽。
12.根据权利要求11的多肽，其中第一抗原决定基是得自丙型肝炎病毒核心区域，非结构区域4或非结构区域5的类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基。
13.根据权利要求12的多肽，其中第一抗原决定基位于丙型肝炎病毒-1(HCV-1)的氨基酸残基67和84，1689和1718或2281和2313之间，或位于其它丙型肝炎病毒类型的同源区域。
14.核酸分子，含有由丙型肝炎病毒基因组编码的核苷酸序列，其相应于得自丙型肝炎病毒的类型特异性抗原决定基或类型-簇特异性抗原决定基之氨基酸残基序列。
15.根据权利要求14的核酸分子，其中抗原决定基得自丙型肝炎病毒核心区域，丙型肝炎病毒非结构区域4或丙型肝炎病毒非结构区域5。
全文摘要
本发明提供了鉴定丙型肝炎病毒类型的方法以及用于此方法的组合物。
文档编号G01N33/576GK1125982SQ94192560
公开日1996年7月3日 申请日期1994年5月9日 优先权日1993年5月10日
发明者D·Y·钱, G·郭 申请人:奇龙公司