丙型肝炎病毒的测定方法

专利名称：丙型肝炎病毒的测定方法
技术领域：
本发明涉及丙型肝炎病毒(HCV)的检测方法，详细讲涉及测定HCV核心抗原，或同时测定HCV核心抗原和HCV核心抗体的方法。该方法对大量血液样品等的筛查特别有效。
背景技术：
由HCV(丙型肝炎病毒)感染引起的肝炎转化为慢性的频率很高，而且随着感染期间的增长，往往会转变为肝硬化、肝癌。但是HCV的感染由于主要是由血液和来自血液的成分引起的，所以通过确定和排除感染源，阻断感染途径是有可能的。现在确定感染源的方法主要采用检测针对HCV多肽的抗体的方法，但寻求能够以更高精度确定感染源的方法。
作为寻求的背景在于HCV感染后存在着虽然存在抗原，但不产生抗体的所谓的窗口期(Window period)。处于该期间的血清无法通过检查抗体判断有无感染。由于通过检查抗体不能排除处于窗口期的检查样品，所以经检查抗体进行筛查的输血和利用来自血液成分、血液制剂等的血液物质时，存在着由处于窗口期的检查样品引起的二次感染的危险。因此有必要检测HCV本身，即HCV颗粒，而不是针对HCV多肽的抗体。
检测、测定HCV本身可以通过检测构成HCV颗粒的抗原或基因(RNA)来实现。我们认为构成HCV颗粒的抗原是核心抗原或被膜抗原(E1、E2)。
据报道被膜蛋白抗原区有大量变异，如高变区。另外基因型之间存在的差别也有报道。为了全部检测这些变异、差别，有必要使用能特异结合于多个区域的探针。
这里所说的“探针”是指特异结合抗原的分子，例如受体、抗体、重组抗体、功能性分子、或功能性结构物那样的识别和结合抗原分子的分子。
而核心抗原在氨基酸序列水平是保守的，由于通过选择区域能够获得对报道的多种基因型的HCV中的任一种基因型抗原均能检测的探针，所以建立不依赖于基因型的检测方法是有可能的。
然而为了建立检测抗原的系统有些应当注意的事项。即被检测者的检测样品中抗体存在的可能性高，这些抗体会与检测抗原用的探针竞争结合部位，通过抑制探针的结合，使抗原的检测灵敏度下降。因此为了更有效地检测抗原，应当考虑使用识别抗体不结合的区域或抗体结合但不干涉探针结合区域的探针的方法。但在已报道的象HCV核心抗原那样的多个抗体结合部位的分子中，制备满足上述条件的探针是困难的。
因此为了检测抗原分子，有必要除去抑制探针结合的抗体。去除的方法有根据物理原理去除的方法，例如利用分子量的差别将HCV颗粒和抗体分离开的方法。这样的例子有凝胶过滤、超离心分离法、密度梯度离心分离法、利用超滤膜等膜的分子量分级法。然而抗体往往会与其它的生物大分子形成复合体，分子量变大。若使用根据物理原理的分离方法，将抗体与HCV分开就困难了。另外由于这些方法在处理过程中使用特殊仪器，在血液等大量筛选中应用是困难的。
根据生物化学原理的方法，例如有通过使PEG(聚乙二醇)等的水环境变化，利用HCV颗粒与其它血清成分化学上的性质差别，如对水的溶解性不同使HCV颗粒优先沉淀分离的方法，但抗体或抗体复合体往往与颗粒沉淀于同一级分中，分级变得困难了。而HCV颗粒往往与构成HCV颗粒的抗原和识别抗原的抗体形成免疫复合体，从免疫复合体中只分离出抗体或抗原是困难的。
因此可以采用通过从功能上破坏除去抑制探针功能的物质(抗体等)的方法。作为使抗体功能丧失的方法，可以考虑通过暴露于蛋白质变性的条件下，使抗体蛋白质变性的方法，但这里重要的是条件，就是说是使抗体功能丧失，但不能使作为目的的抗原的功能，即与探针结合的功能丧失，亦即在探针是抗体时不能抗原决定簇消失的条件，或使抗原决定簇再表现的条件。
判断有无HCV感染的方法中所要求的功能因其目的不同而不同。
抗体检查是判断检测样品中是否存在针对HCV的抗体的方法，如果检测样品中存在针对HCV的抗体时，这种情况既有其样品提供者现在感染了HCV，检测样品中存在HCV的情况，也有已经治疗或由于自然治愈将HCV从体内排除的情况，所以通过有无抗体区别这些情况是困难的。
抗原检查对于了解检测样品中是否存在HCV，或存在时其量的多少有重要的作用，此时与抗体存在与否没什么关系了。
治疗时为了确定HCV是否是肝炎的主要原因，虽然HCV的抗体检查能给出重要的信息，但最终在确定诊断时需要判断有无HCV抗原。在判定治疗效果时重要的是判定HCV是否从体内被排除，在判定中重要的是了解抗原量的多少。就是说在治疗中重要的是了解与抗体的有无没有关系的抗原的有无以及抗原量。即在治疗中，给出抗原有无和抗原量多少的检查方法是最重要的方法。
另外在血液和来自血液的制品中阻止二次感染更重要，因此检查方法中需要判断有无HCV作为感染源的危险性。现在该领域内作为主要检查方法用的是检查抗体。
然而就象前面叙述的那样，处于HCV感染后窗口期的血清通过抗体检查不能判断有无感染。因此通过抗体检查进行筛选的输血和利用血液成分、血液制剂等来自血液的物质时，存在着由处于窗口期的检测样品引起的二次感染的危险性。
为了进一步降低危险性，需要并用抗原检查，但在象献血等血液检查那样的大量筛选中还没有进行抗原检查。
理论上讲如果存在着能够以100％精度(灵敏度、特异性)判定抗原的有无的检查方法，可以把它作为唯一的检查方法，但无论什么样的检测方法都有个检测灵敏度，处于检测灵敏度以下的样品就不能检测。因此能够以100％精度判断的检查方法是不存在的。而在特殊的例子中如果只靠抗原检查的话，感染源漏掉的可能性是存在的，因此在该领域中抗体和抗原两者都测定对于降低二次感染的危险性是必要的。能够适用于大量筛选，表现出高灵敏度、特异性的抗原检测方法被采用那样的时候，已经能够测定抗原和抗体，同一检测样品数中的检测数要比现在增加，成了成本增加的主要原因。
如果用同一方法测定抗原和抗体成为可能的话，可知在该领域内能够减少检测次数会带来多大的效果。
就象已经报道的那样，检测抗体的方法和检测抗原的方法虽已被开发，如果想在象上述那样检测抗体的条件下想要检测抗原的话，由于存在着抑制检测抗原的探针的结合的抗体，不能有效地检测抗原。另外即使在检测抗原的条件下，如前所述，由于要采用去除竞争抑制抗原检测的抗体的方法，不能检测抗体。所以在已经报道的方法中，也不能用同一方法检测抗原和抗体。
发明的公开在利用血液和来自血液的物质时，以降低二次感染为目的，如果不必区分感染者、曾经感染者，就能够判断是否存在抗体或抗原就好了。就是说本发明提供了一种对血液和来自血液的物质检查中所需要的新的检查方法，在象窗口期那样不存在抗体时期的检测样品中检测抗原，以及在存在抗体的时期的样品检测抗原或检测抗原和抗体的方法。
为了解决上述课题，本发明提供了丙型肝炎病毒(HCV)的测定方法，特征如下在具有烷基和伯～季胺(铵)的表面活性剂或非离子表面活性剂、或两者都存在的条件下，通过使HCV核心抗原与其探针结合进行测定。
本发明还提供测定抗体的方法特征为在利用上述方法测定HCV核心抗原的同时，通过使HCV核心抗体与其探针结合。附图的简单说明

图1是表示将单克隆抗体C11-15效价与其它单克隆抗体C11-3、C11-7、C11-10和C11-14效价进行比较的曲线图。
图2是表示将本发明的各种单克隆抗体单独、或混合后作为一次抗体固定于固相后使用，测定HCV-RNA阳性检测样品时的ELISA结果的曲线图。发明的实施方案本发明提供的HCV感染检测方法是对于象窗口期那样抗体不存在时期的检测样品检测抗原，抗体存在时期检测抗原或抗原和抗体都检测的方法。就是说由于在抗体不存在时期，即在窗口期没有抗体存在，检测抗原时当然没有必要去除抗体。因此为了检测抗原进行的必要的预处理也不需要了。
然而为了检测HCV颗粒含有的抗原，重要的是使检测用探针的识别部位暴露。HCV病毒颗粒的结构是作为基因组的核酸与核心抗原形成复合体后形成粒子，该粒子被质膜和被膜蛋白构成的外膜包裹起来的结构。在血液中以与低密度脂蛋白(LDL)和HCV的抗体等形成的复合体形式存在着。因此若是病毒颗粒以原有状态存在于血液中，探针不能识别和结合核心抗原。所以为了检测核心抗原，需要进行去除包围在核心抗原周围的那些结构物等处理，使得核心抗原能够被探针识别。
就是说在本发明中，也提供使检测样品中含有的HCV颗粒中的核心抗原暴露到使得识别核心抗原用的探针能够识别那样的反应条件、使之反应的系统构成的反应方法、以及含有使之反应的系统的试剂。
另外在抗体充分存在时期，象上述那样有时在检测样品中存在着与探针结合部位竞争的核心抗原的抗体，这种情况下核心抗原检测灵敏度降低的可能性是存在的。而为了将核心抗原暴露到可以与探针结合的状态，含有与探针竞争的核心抗原的抗体时，抗体被暴露的核心抗原吸收，由于结合于(利用检测免疫复合体的方法)检测抗体用的抗原的针对核心抗原的抗体量的减少，检测灵敏度下降的可能性是存在的。
因此抗体检测用的抗原即使是只由核心抗原的抗原决定簇构成的也可以，但优选是含有核心抗原以外的HCV抗原决定簇的肽或多肽。而即使是模仿HCV抗原决定簇的含有HCV抗原决定簇的肽或多肽以外的肽或多肽、或化合物也可以。
但检测核心抗原用的探针和HCV抗原决定簇或代替HCV抗原决定簇的化合物不应当通过相互识别进行结合最优选。
作为用于检测HCV核心抗原探针的抗体或用于检测HCV核心抗原的被标记的抗体可以是免疫小鼠、兔子、鸡、山羊、绵羊、牛等实验动物后获得的多克隆抗体；从免疫的个体分离出脾细胞，通过与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞产生的单克隆抗体；或是通过EB病毒感染使得脾细胞、血液中的白细胞成为不死细胞产生的单克隆抗体；感染HCV的人或黑猩猩等产生的单克隆抗体；可变区基因片段与免疫球蛋白恒定区基因片段组合构成重组的抗体基因转化细胞产生的重组抗体(可变区基因片段可以是从小鼠、人等的免疫球蛋白的cDNA或染色体DNA得到的可变区基因片段、或是通过免疫球蛋白的cDNA或染色体DNA的一部分与人工制备的序列组合构建的可变区基因片段、或是利用人工合成的基因序列构建的可变区基因片段、或是以这些片段为材料通过基因重组手法制备的可变区基因片段)；上述可变区基因片段与例如噬菌体的结构蛋白融合制备的噬菌体抗体；通过上述的可变区基因片段与其它适用的基因片段，例如myc基因的一部分等组合构成的重组抗体基因转化的细胞产生的重组抗体等。
通过人工地向胰蛋白酶导入可变区产生的探针、通过人工地改变特异结合受体等蛋白质的分子得到的探针、此外通过组合化学技术制备的探针等、如果是对核心抗原表现出高的特异性、亲和性的分子也可以使用。
上述的单克隆抗体本领域技术人员很容易制备。利用杂交瘤制备单克隆抗体人们很熟悉。例如向BALB/c小鼠等动物的腹腔内或皮下以上述融合多肽或多肽(以下称本抗原)单独或与BSA、KLH等结合后作为抗原，单独或与Freund完全佐剂等佐剂混合后定期地进行免疫。在血液中的效价上升时，作为追加免疫将本抗原进行尾静脉注射，然后在无菌条件下摘出脾脏，与小鼠的骨髓瘤细胞株进行细胞融合，得到杂交瘤。本方法可以按照Kohler和Milstein的方法(自然(Nature)256495-497，1975)进行。
将通过上述方法得到的杂交瘤细胞株在适当的培养液中培养，然后选择产生对本抗原显示出特异反应的抗体的杂交瘤细胞株进行克隆。在筛选产生抗体的杂交瘤时除了利用极限稀释法外，也可以利用软琼脂法(欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976)等方法。而产生的单克隆抗体可以用蛋白A柱层析等方法进行纯化。
还可以制备除了上述的单克隆抗体以外用作探针的分子。例如有关重组抗体Hoogenboon的综述等有详细记载(生物技术中的趋势(Trends in Biotechnology)，1562-70，1997)。
本发明中，作为检测样品中HCV核心抗体用的探针的抗原或为制备上述HCV核心抗体用的抗原，具体来说例如可以是具有序列1或序列2所示的氨基酸序列的多肽、或含有序列3～6记载的多个氨基酸序列的融合多肽，这些多肽可以通过编码它们的DNA的重组表达获得。
按检测原理可以使用酶标记抗体方法、荧光标记方法、放射性同位素标记方法等通常免疫测定法中用的方法，在酶标记抗体法中检测酶的原理有比色法、荧光法、化学发光法等。而在抗体检测中也可以采用二抗原“夹心”(Sandwich)法那样的抗体检测中常用的方法，另外抗原检测中同样也可以使用一步“夹心”系统等方法。
本发明的一种方案是如下的反应体系。使(1)针对HCV核心抗原的探针，例如针对HCV核心抗原的抗体，(2)含有HCV抗原决定簇的化合物，例如含有HCV多肽的抗原决定簇的肽、肽化合物或多肽、以及其混合物在免疫测定法中用的载体、例如微量滴定板上固定。在含有可使来自HCV颗粒、或颗粒复合体的HCV核心抗原暴露到探针可以识别的程度，而且不阻碍针对HCV抗原决定簇的抗体的功能的成分的反应缓冲液中，使固定化载体与被检测样品反应，使检测样品中含有的核心抗原和针对HCV抗原决定簇的抗体特异地结合于载体上。
然后除去没有结合的检测样品中的成分(例如通过用适当的缓冲液洗载体除去)后，与含有用识别结合于载体上的核心抗原的探针(例如用针对核心抗原的酶等标记的抗体)，以及用识别针对结合于载体上的HCV抗原决定簇的抗体的探针(例如用酶等标记的抗人抗体的鼠单克隆抗体)的反应液反应，使其与结合于载体上的核心抗原和针对HCV抗原决定簇的抗体特异地结合。反应结束后，为了除去未反应的成分，例如用适当的缓冲液洗净载体后，通过用适当的方法检测标记，是有可能检测样品中含有的核心抗原和针对HCV抗原决定簇的抗体的。
另外也可适用免疫层析法等在一般免疫测定法中能够用的B/F分离法，这对于该领域的研究者是很清楚的。适于检测抗原的反应条件本发明提供的系统中所谓适于抗原检测的反应系统是使针对HCV抗原决定簇的抗体功能不丧失的温和的条件，是使检测样品中存在的复杂的构造体的HCV颗粒把作为识别HCV抗原的探针的抗体识别的区域充分暴露的条件构成的系统。
已有用超速离心法分离的病毒颗粒(Takahashi等，1996，遗传病毒学杂志(J.Gen.Virol)，73667-672)、通过聚乙二醇凝集沉淀的HCV颗粒用Tween 80和Triton X100之类的非离子性的表面活性剂处理(Kashiwakuma等，1996，免疫学方法杂志(J.Immunologicalmethods)，19079-89)，表明检测核心抗原是可能的，但在前者中其检测灵敏度不够高，抗原是否充分暴露是个疑问。而后者通过加其它的处理剂使抗体失活，而有关表面活性剂的效果本身并没有提及。
在本发明中，开始以表面活性剂为基型，通过研究条件，将反应液的组成作成以表面活性剂为中心的组成，无需采用已经报道的HCV抗原检测系统那样的离心操作和加热等操作组成的预处理法，而只是通过对反应液中的检测样品进行稀释，就可以有效地检测HCV颗粒中的抗原。
给出从病毒颗粒中有效提取核心抗原、而且抑制与血清中各种各样物质相互反应、使探针和抗原能有效反应的条件是必要的。此时作为有效的表面活性剂，例如有在同一分子内具有烷基和仲～季胺(铵)的表面活性剂，或非离子性表面活性剂。
在上述具有烷基和仲～季胺(铵)的表面活性剂中，烷基优选是直链的烷基，其碳原子数优选在10个以上，更为优选的是12～16个。作为胺优选的是叔或季胺(铵)。作为具体的表面活性剂有十二烷基-N-肌氨酸、十二烷基三甲基铵盐、十六烷基三甲基铵盐、3-(十二烷基二甲铵基)-1-丙磺酸、3-(十四烷基二甲基铵)-1-丙磺酸、十二烷基吡啶鎓盐、十六烷基吡啶鎓盐、优选酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10)、十二烷基-N-三甲基铵乙内酯等。优选十二烷基-N-肌氨酸和十二烷基三甲基铵盐。
作为上述的非离子性表面活性剂具有12～14之间的亲水疏水比的优选，聚氧乙烯异辛基苯基醚类，例如Triton X100和Triton X114等，或聚氧乙烯壬基苯基醚类，例如Nonidet p40，Triton XN101、NikkolNP等优选。
在本发明中，上述两种类型的表面活性剂可以单独使用，若并用更优选，由于并用可以获得协同效应。
另外就象检测针对HCV抗原决定簇的抗体那样，通过将含有HCV抗原决定簇的抗原、检测HCV抗原用的抗体固定化的载体与用本发明提供的反应液稀释的检测样品反应，发现在HCV抗体不存在而含有HCV抗原的检测样品中，能有效检测抗原，在HCV抗原不存在而只存在抗体时能有效检测抗体，在抗原和抗体都存在的检测样品中，通过同时检测抗原和抗体能给出很强的信号，由此完成了本发明。
同时检测病毒的抗原和针对病毒抗原的抗体的方法在HIV研究中已有报道(Weber等，临床微生物学杂志(J.Clinic.Microbiol.)，362235-2239，1998)。在HIV检查中，若是检查病毒抗原，检测作为gag蛋白质的p24是有效的。另外在检查针对病毒抗原的抗体中，检测针对被膜蛋白和作为gag蛋白质的p19的抗体是有效的。因此同时检测病毒抗原和针对病毒抗原的抗体的方法可以通过检测抗原和检测抗体方法的配合来实现，即抗原检查检测作为gag蛋白质的p24，抗体检查检测针对被膜蛋白和作为gag蛋白质的一部分的p19的抗体。
这样一来当病毒抗原检测中用的抗原决定簇和病毒抗体检测用的被检测样品中的抗体识别的抗原决定簇不同时，建立同时检测病毒抗原和针对病毒抗原的抗体的方法是比较容易的。原因是例如检查HIV时，检测抗原时用的探针如针对HIV抗原决定簇的单克隆抗体识别的抗原p24和在抗体检查中被检查者样品中含有的抗体识别的抗原、被膜蛋白和作为gag蛋白质一部分的p19是不同的蛋白质，抗原检查使用的探针不能识别被膜蛋白质和作为gag蛋白质一部分的p19。因此不易发生由于探针与用于抗体检测的HIV抗原决定簇结合引起的竞争反应导致灵敏度下降、非特异反应等，抗原检测系统、抗体检测系统彼此干涉其它系统的现象。
然而在检测针对HCV抗原决定簇的抗体时，检测针对核心抗原决定簇的抗体在临床上是相当有用的(Chiba等，美国国家科学院院刊Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884641-4645，1991，Bressters等，VoxSang.，62213-217，1992)。因此在抗体检测中检测针对核心抗原决定簇的抗体是必需的要作的事。另外在抗原检测中，由于在构成病毒颗粒的抗原中，核心抗原与其它抗原如E1、E2相比变异率更低，检测核心抗原在检测HCV抗原中是更有效的方法。就是说为了建立同时有效地的HCV抗原抗体测定系统，在抗原检测系统和抗体检测系统中有必要使用同样的抗原即核心抗原。
因此没采取任何措施就使用核心抗原时，将产生抗原检测中使用的针对核心抗原的单克隆抗体与抗体检测中用的核心抗原结合、被吸收，被检测样品中抗原的检测灵敏度降低；或与抗体检测中用的核心抗原结合，诱发抗原检查的非特异反应，抗体检查用的HCV抗原决定簇被屏蔽，灵敏度下降等问题。
本发明人为了解决这个问题，通过将抗原检测中用的单克隆抗体的抗原决定簇和存在于被检测样品中的针对核心抗原的抗体的抗原决定簇分割开，发现能够有效地同时检测抗原和抗体，从而完成了本发明。
通过详细说明以下实施例，给出为同时测定抗原和抗体的合适的抗原决定簇的组合。
就被检测样品中针对核心抗原的抗体的抗原决定簇来说，由各种各样抗原决定簇解析结果表明最重要的区域是存在于核心抗原的N末端，特别是存在于HCV多肽的第1位到40位区域(Okamoto等，肝病学Hapatology 15180-186，1992，Sallberg等(临床微生物学杂志)J.Clinical.Microbiol.，301989-1994，1992，Sallsberg等，医学病毒学杂志J Med.Vilol，4362-68，1994)。而基因型特异反应的抗原决定簇位于HCV多肽的第66到第80位之间(Machida，肝病学Hepatology 16886-891，92，特愿平9-209522)。因此作为检测针对HCV抗原决定簇的抗体用的抗原具有HCV多肽的第1位到40位、第66到第80位之间的序列是重要的。因此作为检测HCV抗体的抗原，在实施例中是将具有HCV多肽的第1位到42位、第66到第80位的序列的抗原CEPM作为具有合适序列的抗原多肽而给出的。而CEPM是由将HCV多肽的如下所示的区域按以下顺序排列的人工序列而成的抗原，其构建方法在特愿平9-209522中有记载。序列编号10记载了该序列。CEPM的HCV抗原决定簇的排列为(1238-1313)-(1363-1460)-(1712-1751)-(66-80)-(1686-1704)-(1716-1751)-(66-80)-(1690-1713)-(1-42)另一方面，在抗原检测中，在第一次反应中使用单克隆抗体识别、结合针对被检测样品中核心抗原的抗体比较少见的区域，即从HCV多肽的第100位到130位，作为检测与第一次抗体结合的核心抗原用的第二次抗体的识别部位，使用识别在抗体检查中不用的区域(从HCV多肽的第40位到50位)的单克隆抗体，通过针对HCV多肽的第100位到130位的抗体对保留的核心抗原进行检测。
这些单克隆抗体无论那一个由于都不能与含有检测HCV抗体用的HCV多肽的第1位到42位的抗原结合，所以通过利用上述的单克隆抗体、上述的抗原，都不会由于结合对抗原检测系统、抗体检测系统的反应产生抑制，使各个测定系统同时发挥作用成为可能。
以下通过实施例详细说明本发明。
实施例1.来自HCV多肽的表达质粒的表达及纯化(A)表达质粒的构建相当于HCV的核心区域的表达质粒用以下方法构建。将C11-C12克隆和C10-E12克隆(特开平6-38765)编入pUC119中，然后将得到的质粒pUC·C11-C12和pUC·C10-E12的DNA各1μg分别于限制酶反应液20μl[50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mMNaCl、15单位的EcoRI和15单位的ClaI酶]、和[10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、50mM NaCl、15单位的ClaI酶和15单位的KpnI酶]中于37℃消化1小时，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，纯化出大约380bp的EcoRI-ClaI片段和约920bp的ClaI-KpnI片段。
将上述两个DNA片段和pUC119加入到用用EcoRI和KpnI消化的载体中加入10×连接酶用缓冲液[660mM Tris-HCl(pH7.5)、66mMMgCl2、100mM二硫苏糖醇、1mM ATP]5μl、T4连接酶1μl(350单位/μl)中，再加入水最后体积为50μl，于16℃保温过夜，进行连接反应。用该质粒转化大肠杆菌JM109，得到质粒pUC·C21-E12。
对该质粒pUC·C21-E12 DNA 1ng用两个引物(5′-GAATTCATGGGCACGAATCCTAAA-3′(序列号7)、5′-TTAGTCCTCCAGAACCCGGAC-3′(序列号8))进行PCR。进行PCR的条件如下使用GeneAmpTM(DNA扩增试剂盒，Perkin Elmer Cetus制)的试剂盒，DNA于95℃变性1.5分钟、于50℃退火2分钟、于70℃进行DNA合成3分钟，得到的DNA片段用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，利用Glass powder法(Gene Clean)纯化。
另外用限制酶SmaI消化pUC19，将通过PCR法得到的DNA片段加入到10×连接酶缓冲液[660mM Tris-HCl(pH7.5)、66mM MgCl2、100mM二硫苏糖醇、1mM ATP]5μl、T4连接酶1μl(350单位/μl)中，再加入水最后体积为50μl，于16℃保温过夜，进行连接反应。用该质粒转化大肠杆菌JM109，得到质粒pUC·C21-E12·SmaI。
该质粒DNA 1μg于限制酶反应液20μl[150mM NaCl、6mM Tris-HCl(pH7.5)、6mM MgCl2、15单位的EcoRI和15单位的BamHI酶]中37℃消化1小时，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，分离出大约490bp的EcoRI-BamHI片段，再用Glass powder法纯化。
作为表达载体的Trp·TrpE(特开平5-84085)DNA 1μg于限制酶反应液20μl[150mM NaCl、6mM Tris-HCl(pH7.5)、6mM MgCl2、15单位的EcoRI和15单位的BamHI酶]中37℃消化1小时，然后反应液中加入39μl水，于70℃进行5分钟热处理后加入细菌碱性磷酸酶(BAP)1μl(250单位/μl)，于37℃保温1小时。
向该反应液中加入苯酚，进行苯酚萃取，对得到的水相进行乙醇沉淀，干燥沉淀物。将得到的EcoRI-BamHI处理载体DNA 1μg和上述核心140片段加到10×连接酶用缓冲液[660mM Tris-HCl(pH7.5)、66mM MgCl2、100mM二硫苏糖醇、1mM ATP]5μl、T4连接酶1μl(350单位/μl)，再加入水最后体积为50μl，于16℃保温过夜，进行连接反应。
用该反应液10μl转化大肠杆菌HB101株。转化用的感受态大肠杆菌株是通过氯化钙法[Mandel.M.和Higa.A.，(分子生物学杂志)J.Mol.Biol.，53，159-162(1970)]制备的。转化的大肠杆菌涂布于含有25μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上(1％胰蛋白胨、0.5％NaCl、1.5％琼脂)于37℃保温过夜。然后取1接种环板上生成的菌落，接种于含有25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃培养过夜。
将1.5ml菌培养液离心收集菌，利用碱法[Manniatis等、分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)(1982)]进行质粒DNA的小量纯化。得到的质粒DNA 1μg于限制酶反应液20μl[150mM NaCl、6mM Tris-HCl(pH7.5)、6mM MgCl2、15单位的EcoRI和15单位的BamHI酶]中于37℃消化1小时，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，选择出产生大约490bp的EcoRI-BamHI片段的Trp·TrpE核心160表达质粒。
(B)克隆核心160中被编码的多肽的表达和纯化带有表达质粒Trp·TrpE核心160的大肠杆菌HB101株接种到含有50μg/ml的氨苄青霉素的3ml的2YT培养基(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取液、0.5％NaCl)上，于37℃培养9个小时。该培养液1ml接种到含有50μg/ml的氨苄青霉素的100ml的M9-CA培养基(0.6％Na2HPO4、0.5％KH2PO4、0.5％NaCl、0.1％NH4Cl、0.1mM CaCl2、2mM MgSO4、0.5％酪蛋白水解物、0.2％葡萄糖)于37℃继续培养。在OD600＝0.3，终浓度达到40mg/l时加入吲哚丙烯酸，再培养16小时。将该培养液离心分离收集菌体。
向菌体中加入20ml缓冲液A[50mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、30mM NaCl]使其悬浮，再进行离心分离，得到表达菌体2.6g。得到的菌体悬浮于10ml缓冲液A中，通过超声波破碎将大肠杆菌膜破碎后进行离心分离，得到含有HCV cDNA编码的多肽与TrpE的融合多肽不溶性级分。向该级分加入10ml含有6M尿素的缓冲液A，对融合蛋白进行可溶性提取。将可溶性提取物加到S-Sepharose离子交换层析柱上，进行融合多肽的纯化。
实施例2.杂交瘤的制备方法利用上述方法制备的融合多肽(TrpC11)溶解于6M尿素后，用含有0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)稀释，使之终浓度为1.0mg/ml，然后与等量的TiterMax混合，作成TrpC11悬浊液。将TrpC11浓度调节为0.01～0.05mg/ml的该悬浊液注入4～6周龄的BALB/c系小鼠腹腔。大约8周后，再向已免疫的动物尾静脉内注入TrpC11浓度调节为0.005～0.03mg/ml的生理盐水。
在最终追加免疫后的第3天，在无菌条件下从该免疫动物摘出脾脏，用剪刀剪成碎片，然后用使用筛子将脾脏分散成一个个的细胞，用RPMI-1640培养基洗3次。在8-氮杂鸟嘌呤核苷存在下培养数日，按上述同样对彻底清除了突变回复细胞的对数增殖期的小鼠骨髓瘤细胞株PAI洗净后，将1.8×107个该细胞和1.0×108个脾细胞加入到50ml的离心管中混合。用200×g离心5分钟，去除上清，加入于37℃保温的含有50％聚乙二醇(PEG)4000(Merck公司制造)的RPMI-1640培养基1ml，进行细胞融合。
融合细胞经离心分离(200×g、5分钟)除去PEG后，用96孔板，在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(以下省略为HAT)的RPMI-1640培养基中培养1～2周，只使杂交瘤增殖。然后在不含HAT的培养基中培养，大约2周后，利用ELISA法检查产生目的抗体的克隆，获得产生具有所期望的反应特异性的本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
对得到的杂交瘤按照常规的极限稀释法进行产生目的抗体的细胞株的检索和单克隆化，得到的杂交瘤命名为HC11-14，HC11-10，HC11-3和HC11-7。有关这4种杂交瘤已于平成9年7月4日以FERM BP-6006，FERM BP-6004，FERM BP-6002，和FERM BP-6003保藏于微生物工业技术研究所。
实施例3.单克隆抗体的制备方法将用实施例2记载的方法得到的杂交瘤移植到经降植烷处理的小鼠的腹腔，获得腹水中产生出来的单克隆抗体。该单克隆抗体的纯化是通过结合了蛋白A的Sepharose柱分离IgG级分。
从上述5种杂交瘤产生的各个单克隆抗体，C11-14，C11-10，C11-7和C11-3的同型是通过使用兔抗鼠Ig各个同型抗体(Zymed公司制造)以双重免疫扩散法确定的，其中C11-10和C11-7是IgG2a，C11-14和C11-3是IgG1。就得到的4种单克隆抗体用按照来自HCV·核心区域的序列合成的20肽进行抗原决定簇的解析，从结果可知它们分别是特异识别如表1所示核心区域一部分的单克隆抗体。
表1

实施例4.未进行预处理操作而有效检测抗原用的方法将含有HCV颗粒的检测样品在加了表面活性剂的反应液中稀释，对HCV核心抗原被检测的效率进行研究。
HCV核心抗原的检测通过使用了针对HCV核心抗原的单克隆抗体的“夹心”酶免疫分析(EIA)进行的。实施例3得到的单克隆抗体中，C11-3和C11-7用作捕获核心抗原的抗体，C11-10和C11-14用作检测捕获了抗原的抗体。
EIA基本上是按以下条件进行的。将单克隆抗体C11-3，C11-7用醋酸缓冲液稀释，使之浓度为4μg/ml，然后将稀释溶液加到微量滴度板上，于4℃保温过夜。用磷酸缓冲液洗净，通过加入含有BSA的磷酸缓冲液实施封闭操作。然后加入反应液100μl、检测样品100μl，搅拌后于室温反应1.5小时。通过用加有低浓度的表面活性剂的磷酸缓冲液洗除去未反应物，然后加入用碱性磷酸酶标记的单克隆抗体C11-10，C11-14，于室温反应30分钟。反应结束后，用加有低浓度的表面活性剂的磷酸缓冲液洗除去未反应物，然后加入底物溶液(CDP-Star/emeraldll)于室温反应15分钟后，测定发光量。
在一次反应液中加入各种表面活性剂研究其效果。用针对HCV的抗体的效价在检测限以下，认为几乎不含有针对HCV的抗体的HCV抗原阳性血清，通过发光量的多少研究核心抗原的检测灵敏度，健康人血清的发光量定为1.0，其他人用相对于健康人的反应比率表示。结果如下面的表2和表3所示。
表2各血清相对于健康人的反应比率(S/N比)No45 No46No3 No7 No19无添加15.671.001.151.341.19效果判定基准 ＞30.0 ＞2.0 ＞2.0 ＞2.0 ＞2.0添加剂 HLB值 ％阴离子 40.0 0.5 5.42十二烷基硫酸钠 2.0 5.73表面活性剂0.5 12.792.70十二烷基-N-肌氨酸钠 2.0 125.43 7.273.833.706.71全氟烷基羧酸S-1130.5 10.551.27(ASAHI GLASS制造)2.0 6.72 0.91阳离子 十二烷基三甲基溴化铵 0.5 72.977.423.093.525.432.0 44.555.35表面活性剂0.5 53.434.702.051.522.33十二烷基吡啶鎓氯化物 2.0 12.442.490.5 66.844.432.411.632.67正十二烷基三甲基铵2.0 27.983.77十四烷基铵溴化物 0.05 14.690.5 12.571.000.750.99正辛基三甲基氯化铵2.0 11.46两性CHAPS 0.5 29.572.0 25.321.631.822.42表面活性剂全氟烷基季铵羧酸内盐S-132 0.5 11.071.61(ASAHI GLASS制造)2.0 10.771.490.5 57.693-(十二烷基二甲基铵基)-1-丙磺酸 2.0 113.19 4.573.445.26
表3各血清相对于健康人的反应比率(S/N比)No45 No46No3 No7 No19无添加 15.671.001.151.341.19效果判定基准 ＞30.0 ＞2.0 ＞2.0 ＞2.0 ＞2.0添加剂 HLB值％非离子 MEGA-10 0.5 32.113.382.0 38.493.531.971.872.84表面活性剂Tween 20 16.7 0.5 16.882.0 12.36Tween 40 15.6 0.5 14.96 1.020.991.412.0 19.10 1.321.251.64Tween 80 15.0 0.5 12.45 1.331.231.102.0 17.47Nonidet P-40 13.1 0.5 43.14 3.092.954.58辛烷基葡糖苷(ォクチルグルコシド) 0.5 12.48 0.900.600.972.0 25.07 1.921.202.63Triton N101 13.4 0.5 26.50 1.851.622.702.0 60.84 2.232.283.81Triton X100 13.5 0.5 27.722.0 71.08 2.902.343.86Triton X114 12.4 0.5 31.49 2.041.652.772.0 58.62 1.922.112.51Triton X305 17.3 0.5 10.50 0.940.971.082.0 25.91 1.301.241.87Triton X405 17.9 0.5 12.54 0.860.781.042.0 24.92 1.211.241.25其他 苄基二甲基苯基氯化铵 0.55.451.002.07.011.12三乙基胺 0.53.890.97混合物表面活性剂 十二烷基-N-肌氨酸钠+2％Triton X100244.136.115.5012.71
从该结果可看出，通过添加以Triton X100为代表的HLB值在12～14之间的非离子表面活性剂，HCV抗原阳性血清与健康人血清比较，发光量增大，检测灵敏度上升。而同样通过添加以十二烷基-N-肌氨酸钠和十二烷基三甲基铵为代表的在其结构中同时具有直链烷基和仲～季胺(铵)的表面活性剂，也可以看出对HCV抗原阳性血清的检测灵敏度上升。而具有碳数在8以下烷基的表面活性剂看不到象这样的灵敏度上升效果。而通过将两种表面活性剂混合(表2中，将十二烷基-N-肌氨酸钠+2％Triton X100混合)添加，还可看到对HCV抗原阳性血清的检测灵敏度会进一步上升。
实施例5.HCV感染后HCV抗体出现前(窗口期)的检测样品中的核心抗原检测对市售血清转化化验盘PHV905(B.B.I.inc.)，于反应液中添加2％的Triton X100和2％的十二烷基-N-肌氨酸钠，按照实施例4进行测定。这里所用的HHV905化验盘是于开始观察后第21天(血清No.PHV905-7)通过检查抗HCV抗体(Ortho EIA3.0)表现出阳性转化的化验盘，其抗体效价用截止指标(cut-off index)(S/CO)表示，1.0以上判定为阳性。HCV核心抗原活性(发光量)以健康人血清的发光量为1.0，用相对于它的比率(S/N)表示。
就象表4表示的那样，在抗HCV抗体还未变成阳性前，就可看出核心抗原的活性，已经确认通过添加该表面活性剂，来自病毒粒子的核心抗原暴露，与固定化的单克隆抗体反应，能够进行检测。
表4

实施例6.检测样品中含有的HCV抗体和核心抗原的同时检测使用含有针对HCV抗原决定簇的抗体，但几乎不含HCV抗原的检测样品(人血清)，在含有表面活性剂的一次反应液中针对HCV抗原决定簇的抗体不失活地结合于HCV多肽，通过在2次反应液中添加抗人抗体检测是有可能的，存在核心抗原时检测核心抗原，含有针对HCV抗原决定簇的抗体时检测抗体，当两者都存在时，检测两者是有可能的，这可通过以下的方法确认。
EIA基本上是按以下条件进行的。含有HCV抗原决定簇的重组抗原CEPM用含有尿素的磷酸缓冲液稀释后，添加到微量滴度板，于4℃保温过夜。然后用磷酸缓冲液洗净，加入用醋酸缓冲液稀释的单克隆抗体C11-3，C11-7，于4℃保温过夜。而重组抗原CEPM的制备方法特愿平9-209522有记载。除去抗体溶液后，用磷酸缓冲液洗净，通过添加含有1％BSA的磷酸缓冲液实施封闭操作。
然后依次加入含有Triton X100、2％的十二烷基-N-肌氨酸钠和尿素的一次反应缓冲液100μl、检测样品100μl，搅拌后于室温反应1.5小时。通过用加有低浓度的表面活性剂的磷酸缓冲液洗净除去未反应物后，加入含有针对用辣根过氧化物酶标记的HCV核心抗原的单克隆抗体C11-14，和针对人IgG的鼠单克隆抗体的2次反应缓冲液，于室温反应30分钟。
反应结束后，用加有低浓度的表面活性剂的磷酸缓冲液洗净除去未反应物，然后加入底物溶液(邻苯二胺)于室温反应20分钟后，测定吸光度。
以确认几乎不含有HCV核心抗原的HCV抗体阳性人血清以及用马血清稀释后的人血清作为检测样品，在确认针对HCV抗原决定簇的抗体能够被检测时，发现反应依赖于浓度，能够确认抗体在一次反应液中没有失活地被检测出。
表5HCV可以和HCV抗体的同时检测(比较例) (比较例) (本发明)

(值是OD492/OD690的测定值)另外将重组核心抗原加到马血清中，以马血清稀释的样品作为检测样品，测定时可以看到能够检测的重组核心抗原依赖于浓度。
加有适量核心抗原和人血清的马血清作为检测样品进行测定时，如表4所示，在只含有重组核心抗原时，能够获得重组核心抗原引起的信号，只含有人HCV抗体阳性血清时，只得到HCV抗体的信号，两者都存在时，可以获得两者信号叠加的信号。因此抗原检测系统、抗体检测系统两者都不互相干扰地发挥作用，可知可以检测针对HCV抗原和HCV多肽的抗原决定簇的抗体。
实施例7.人血清中的抗原抗体测定法使用健康人和患者以及血清阳性转化化验盘检测样品(BBIinc.)，按照实施例6记载的方法对同时进行抗原和抗体的测定。而化验盘血清的结果与用销售商提供的HCV抗体检测试剂判断的结果进行比较。
用健康人检测样品18例测定的结果如表6所示，可见在健康人中无反应。从健康人的分布将阳性和阴性的辨别值设定为0.1。
如表7所示，在HCV阳性检测样品中无论那一个给出的都是阳性值。
另外如表8所示，若是化验盘血清，在抗体检查中给出了不能判断为阳性的点、1到6之间判断为阳性的点。这些点Amplicor HCV检验的判定结果给出阳性判断，即相当于所谓的窗口期，可见即使窗口期的检测样品也能给出阳性判断。
表6检测样品号 吸光度健康人 1 0.0632 0.0573 0.0664 0.0255 0.0456 0.0637 0.04710 0.03311 0.03613 0.03714 0.03015 0.02816 0.03117 0.04018 0.05119 0.05220 0.03121 0.053平均值 0.044
表7

表8化验盘血清 吸光度 判定 抗体分析 Amplicor HCV检验PHV907-1 0.557阳性 阴性 阳性2 0.397阳性 阴性 阳性3 0.357阳性 阴性 阳性4 0.224阳性 阴性 阳性5 0.192阳性 阴性 阳性6 0.247阳性 阳性 阳性7 2.414阳性 阳性 阳性实施例8.单克隆抗体的制备利用实施例3记载的方法制备新的杂交瘤，命名为HC11-15。于平成11年7月16日以FEAM BP-9782保藏于微生物工业技术研究所。纯化由该杂交瘤产生的单克隆抗体，鉴定同型时表明是IgG1。该单克隆抗体通过使用由核心区域的序列合成的20肽的抗原决定簇解析，从结果可知是特异识别15Thr-30Ile(序列9)的单克隆抗体。
实施例9.单克隆抗体效价的鉴定将重组核心抗原(Trp c11)用含有6M尿素的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)稀释到终浓度为2μg/ml，然后加到微量板的各个孔中，每孔各添加100μl。于4℃下静置过夜后，抽滤，用10mM磷酸缓冲液洗2次。每孔各加入含有0.5％酪蛋白的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)350μl，于室温下温育1小时后，抽滤。然后向各个孔添加用反应液连续稀释的各个单克隆抗体(C11-3，C11-7，C11-10，C11-14或C11-15)，反应1小时。洗净后，添加过氧化物酶标记的抗鼠抗体，反应30分钟，洗净后，添加加有邻苯二胺和过氧化氢的底物溶液，进行酶反应。于室温反应30分钟后，添加2N硫酸，使酶反应停止，微量板读取仪测定492nm的吸光度。测定结果如图1所示。
C11-15的抗体效价最高，表明作为2次抗体使用时，检测灵敏度高。
实施例10.根据固定化单克隆抗体的差别进行“夹心”ELISA鉴定各个单克隆抗体(C11-3、C11-5和C11-15，C11-3和C11-7，C11-3和C11-15，C11-3单独，C11-7单独或C11-15单独)用10mM磷酸缓冲液(pH7.3)稀释到终浓度为6μg/ml，然后添加到微量板的各个孔中，每孔加100μl。于4℃下静置过夜后，抽滤，用10mM磷酸缓冲液(pH7.3)洗2次。每孔各加入含0.5％酪蛋白的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)350μl，于室温下温育1小时后，抽滤。然后向各个孔分别添加HCV-RNA阳性、抗HCV抗体阴性检测样品100μl和反应液100μl，于室温下反应1小时。洗净后，添加过氧化物酶标记的抗核心抗原的单克隆抗体(C11-14和C11-10的混合物)，反应30分钟，洗净后，添加加有邻苯二胺和过氧化氢的底物溶液，进行酶反应。于室温反应30分钟后，添加2N硫酸，使酶反应停止，用微量板读取仪测定492nm的吸光度。测定结果如图2所示。
若是只是C11-15固定化，检测灵敏度太低，通过将C11-3或C11-7与C11-15混合后固定化，显示出检测灵敏度上升。
实施例11.抗原决定簇嵌合抗原的表达和纯化将大肠杆菌转化体CEPM/HB101株接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上，于37℃培养过夜。然后再将它以1％浓度接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的M9-CA培养基上于37℃培养过夜。培养结束后，通过离心收集菌体，然后再悬浮于50ml的Lysis液[50mMTris-HCl(pH8.5)，30mM NaCl，5mM EDTA]中，加入1ml的溶菌酶液(10μg/ml Lysozyme)，于37℃处理1小时。该悬浊液通过超声波处理破坏细胞。用15000rpm于4℃下离心30分钟，回收不溶性级分。将该级分再悬浮于50ml的含1％NP 40的A溶液[50mMTris-HCl(pH8.5)]中，进行匀浆(1500rpm 5stroke)。悬浊液用15000rpm于4℃下离心30分钟，回收不溶性级分。将该级分再悬浮于50ml的含有2M尿素的A溶液中，进行匀浆(1500rpm 5stroke)。悬浊液用15000rpm、4℃下离心30分钟，回收不溶性级分。不溶性级分再悬浮于50ml的含有6M尿素的A溶液中，进行匀浆(1500rpm 5stroke)。悬浊液用15000rpm、4℃下离心30分钟，回收不溶性级分。
通过使用S Sephalose HP柱(Pharmacia公司)的离子交换法和使用Superdex75pg(Pharmacia公司)的凝胶过滤法从含有6M尿素溶液溶解的抗原溶液纯化抗原决定簇嵌合抗原。
序列10给出了编码上述嵌合抗原的DNA碱基序列。序列11给出了嵌合抗原的氨基酸序列。
根据2000年11月22日 申请日期1999年7月30日 优先权日1998年7月30日
发明者青柳克己, 大植千春, 饭田久美子, 八木慎太郎 申请人:株式会社先端生命科学研究所