专利名称：丙型肝炎病毒(HCV)IgM抗体快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本发明是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析 法快速检测丙型肝炎病毒(HCV) IgM抗体快速检测试纸。
技术背景HCV是1989年由美国Choo等从受感染的黑猩猩血液标本中最初发现， 主要由血液、体液传播，占输血后肝炎的70%。据世界卫生组织统计，全球 估计约1.7亿人感染HCV。丙型肝炎慢性化率为50%—85%，其中又有20% 可发展为肝纤维化，危害十分严重。我国HCV抗体携带者达4千万左右。 到目前为止丙型肝炎既无有效疫苗，亦无有效的治疗方法，预防感染是唯 一有效的方法。HCV抗体检查和乙肝表面抗原(HBsAg)、人类免疫缺陷病毒 (HIV)抗体及梅毒(TP)抗体检査是我国法定的四个血源性筛査项目，意义十 分重要。目前HCV抗体检测试剂主要检测HCV IgG。 IgM检测只有为数不多的研 究报道，集中于用酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行检测。对IgG检测不能 说明患者是现症感染或既往感染，虽然IgM的检出率为IgG的50%—80%， 但IgM检测阳性基本说明患者是现症感染。除此之外，IgM抗体和体内病毒 复制即HCV RNA检出率相关；和体内体内肝炎发展程度、肝细胞坏死相关； 在对HCV病人治疗过程中，IgM的变化亦提示治疗效果的好坏；另外IgM的 出现和HCV的不同亚型感染相关，因而对HCV IgM检测具有积极的参考意 义。运用免疫层析胶体金技术检测HCV IgM尚无报道。免疫层析胶体金技 术是新型的诊断技术，已得到较为广泛运用，基本原理如下利用胶体金 标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测 时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体 相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成 肉眼可见的检测(T)线，通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简 便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。发明内容本发明的目的是提供一种HCV IgM抗体快速检测试纸，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。本发明提供一种HCV IgM抗体快速检测试纸。包括上样垫(l)、紧密连 接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另 一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫 (4), NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6),上样垫、胶体 金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料支撑板(7)上形成试纸条，试纸条亦可以装 入塑料卡中形成卡式包装，其特征在于T线为包被在NC膜上的抗人IgM抗 体，胶体金垫为标记的HCV混合抗原构成。所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的HCV混合抗原 为重组表达HCV的核心抗原(Core)和非结构蛋白(NS) 3抗原，亦可选择性再 加入HCV的NS4、 NS5、 E1和E2区抗原。所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的上样垫为玻璃 纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包被 方法为以0. 01M pH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成lmg/ml 的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以lul/cm的参数进行划线，包被T线，同 时在NC膜上部包被抗HCV抗体作为C线。划线后将NC膜在干燥间(温度 20-25。C，湿度小于30%)干燥8-10小时。所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的混合抗原标 记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30—50nm 的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2C03 调至pH8. 0，按100ml胶体金溶液加入lmg HCV重组混合抗原，室温搅拌2 小时，加入P/。牛血清白蛋白(BSA)， 0.1%聚乙二醇(PEG)20000封闭20min， 12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml，按lml溶 液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间(温度 20-25°C，湿度小于30%)千燥2-4小时，制成胶体金垫。所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配方 法为在干燥室内(温度20-25°C，湿度小于30%)，取塑料支撑板板，将 已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体 金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5);在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10);最后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可 以再装入塑料卡内，形成检测卡。所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，检测方法为将被 检血清或血衆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50 — 100ul被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察 在30分钟内C、 T线的出现情况，并判定检测结果本发明的有益效果是提供一种利用免疫层析胶体金技术检测HCV IgM 的新型试纸。采用胶体金标记HCV抗原，包被抗人IgM实现对样品中HCV IgM 的检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测 和经济实用等优点。
图l HCV抗体快速检测试纸结构示意图。 附图符号说明1:上样垫 2:胶体金垫3: NC膜 4:吸样垫5:检测(T)线 6:质控(C)线7:塑料支撑板具体实施方式
实施例制备HCV IgM抗体快速检测试纸 1主要材料1.1 HCV的CORE、 NS3融合抗原:美国Biotech Atlantic Inc(BAI.)产品， 用于胶体金标记；鼠抗人IgM，抗HCV抗体军事医学科学院产品，用于 NC膜包被；氯金酸Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜Millipore公 司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇(PEG)20000，水解酪蛋白Sigma 产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。1.2临床血清由公司在相关医院或血站获得，HCV IgG抗体阳性血清80 份，HCV抗体阴性血清300份。1. 3 HCV IgM抗体检测ELISA试剂盒，美国Abbott产品。 2方法2.1 HCV重组抗原的胶体金标记氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M 1(2(:03将溶 液调到pH7.0、 pH8.0和pH9.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌， 按每100ml溶液加入0. 5mg、 lmg、 1. 5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶 体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0. 1%的PEG2000和1% 的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000 r/m离心，弃上清，沉淀按原 体积复溶至不同配比的胶体金工作液(硼酸盐缓冲液，pH8.0，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性剂)中。然后将标记胶体金溶液按lml溶液铺22cm2的 比例加样于无纺布上，在温度20-25°C，相对湿度在<30%的干燥间干燥2-4 小时，制成胶体金垫。2. 2 鼠抗人IgM的包被用0. 01M pH7. 2 PBS将鼠抗人IgM分别稀释成 0.5mg/ml、 lmg/ml、 2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按lul/cm进行划 线包被，同时在NC膜上部包被抗HCV抗体，用于产品的质控，包被完成后 将NC膜在在温度20-25°C ，相对湿度在<30%的干燥间干燥8-10小时。 2.3 HCV IgM抗体快速检测试纸的组装在干燥室内(温度20-25°C，相 对湿度<30%)取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部 粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体 金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5);在NC膜C线一侧搭接 吸样垫(搭吸样垫的1/10);然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm 宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成HCV IgM抗体检测 试剂卡。2.4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂 卡平放，在上样垫上加入50 — 100ul被检样品，若样品中含抗HCV IgM抗 体，则和样品垫上的标记HCV抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到 NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T线处的鼠抗人IgM时，复合物 则又和包被抗IgM抗体结合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物 达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线；若血清中不含特异性抗体， 则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性 和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在15、 20、 30和45分钟内C、 T线的出现情况，并判定检测结果。2.5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配 对，制备小样，利用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。2.6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有HCV IgG阳性血清、阴性 血清进行检测，阳性血清同时用Abbott IgM抗体检测ELISA试剂进行对照检测。 3结果3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值 为8.0;重组混合抗原的最佳标记量为lmg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体 金工作液为lOmM硼酸酸盐缓冲液，pH8. 0,含0. 5%BSA、 10%羊血清，2%蔗糖， 0. 2% Tween 20;最佳包鼠抗人IgM包被浓度为lmg/ml。检测结果的最佳判 定时间为5-30分钟。3.2 临床血清检测以ELISA试剂为对照，80份HCV IgG阳性血清 中ELISA检测出IgM阳性血清54份，本试剂检测出阳性为52份，灵敏度 =52/54=96.3%;本试剂对300份阴性血清检出假阳性5份，特异性= 295/300=98. 3%。分析试剂性能和ELISA试剂相比无显著性差异。
权利要求
1. 一种丙型肝炎病毒(HCV)IgM抗体快速检测试纸，包括上样垫(1)、紧密连接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫(4)，NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料支撑板(7)上形成试纸条，试纸条亦可以装入塑料卡中形成卡式包装，其特征在于T线为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，胶体金垫为标记的HCV混合抗原构成。
2、 根据权利要求1所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所 述的HCV混合抗原为重组表达HCV的核心抗原(Core)和非结构蛋白(NS) 3抗 原，亦可选择性再加入HCV的NS4、 NS5、 E1和E2区抗原。
3、 根据权利要求1所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所 述的上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。
4、 根据权利要求1和2所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在 于，所述的抗原的包被方法为以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将 抗人IgM抗体配制成lmg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以lul/cm的参 数进行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被抗HCV抗体作为C线，划线 后将NC膜在干燥间，温度20-25。C，湿度小于30%，干燥8-10小时。
5、 根据权利要求1和2所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在 于，所述的混合抗原标记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-拧檬酸三钠还原 法制备直径为30 — 50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在 烧杯内，用O. 2M K2C03调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入lmg HCV重组 混合抗原，室温搅拌2小时，加入1。/。牛血清白蛋白(BSA)， 0. 1%聚乙二醇 (PEG) 20000封闭20min， 12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液 复溶至100ml，按lml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布 上，再置干燥间，温度20-25°C，湿度小于30%，干燥2-4小时，制成胶体 金垫。
6、 根据权利要求1和3所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在 于所述的试纸的装配方法为在干燥室内，温度20-25"C，湿度小于30%， 取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC 膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/3粘贴，在胶体金垫另一侧搭 接粘贴上样垫，搭胶体金垫的l/5;在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10;最后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条，切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成检测卡。
7、根据权利要求1所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，检测方法为将被检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50 — 100ul被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在30分钟内C、 T线的出现情况，并判定检测结果。
全文摘要
本发明是涉及生物应用技术领域，特别涉及一种丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸。包括上样垫(1)、紧密连接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫(4)；NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，T线为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，C线为包被在NC膜上的抗HCV抗体。检测时将被检样品加在试纸条(卡)上样垫上，然后直接观察免疫反应结果，完成检测；具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/532GK101266248SQ20081005296
公开日2008年9月17日 申请日期2008年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者洲 李, 杨发青 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司