专利名称：丙型肝炎病毒抗体自身红细胞凝集检测方法
技术领域：
本发明涉及人红细胞单克隆抗体制备及其与丙型肝炎病毒基因工程抗原(以下简称HCVAg)偶联的方法，属疾病诊断领域中全血、血清、血浆中抗体的红细胞凝集检测法。
背景技术：
丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起，呈全球性流行，感染率约3％。我国一般人群感染率为3.2％，长江以北为3.6％，中南和东北地区分别高达3.8％和4.6％。丙型肝炎的危害在于HCV感染后自发痊愈病例极少，慢性化率可高达60％～85％。其后果是导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，容易转化为肝硬化、肝细胞癌(HCC)等终末期肝病，预后差。目前，国内临床用血检测、体检等对丙肝病毒抗体检测试剂的年需求量约在1亿人份，国外年需求量约在4-5亿人份。
已知酶联免疫固相分析(ELISA)双抗原夹心法检测抗体时，标记抗原需进行酶标记，普遍使用的方法是将标记抗原的游离氨基与酶被活化后的醛基进行偶联，或通过双功能基团如戊二醛将标记抗原和酶的游离氨基进行偶联，形成共价结合的酶标抗原。酶标抗原与包被抗原组成双抗原夹心法试剂盒，可以对血清(浆)中的IgG、IgM同时进行检测，其优点是一、灵敏度高，血清(浆)不需稀释或稀释倍数少(通常只需1∶1或1∶2稀释)；二、检出率高，IgM通常在感染早期出现，可实现早期诊断，缩短检测的窗口期；三、特异性强，与间接ELISA相比，包被与标记抗原全为特异性的抗原，可减少非特异性反应。目前用该方法制备的商品化试剂盒有乙肝表面抗体双抗原夹心法ELISA试剂、人类免疫缺陷病毒抗体(I+II型)双抗原夹心法ELISA试剂等。
但是，到目前为止，HCVAb的酶免检测仍然使用间接ELISA法，酶标记物为酶标抗人IgG或酶标抗人IgM，其主要原因是HCV核心区抗原富含赖氨酸和精氨酸(提供游离氨基的氨基酸)。如果按HCVAg∶酶＝1∶1的比率进行标记，HCVAg与酶的偶联位置绝大多数发生在HCVAg的核心区，而不是象其它抗原那样随机分布，酶与HCVAg核心区的游离氨基结合后形成空间位阻，妨碍HCVAg核心区抗原决定簇与其相对应的这一部分抗体结合，而HCVAg核心区又是HCVAg的优势抗原决定簇；这样，直接标记HCVAg组成的双抗原夹心法HCVAb ELISA检测试剂通常会漏检HCVAg核心区抗体阳性标本。而HCVAb间接ELISA试剂本身又有不可克服的缺点首先，灵敏度低，因为酶标记物为酶标抗人IgG或酶标抗人IgM，为了避免人IgG或IgM非特异性吸附，血清(浆)标本必须1∶10或1∶20以上进行稀释，与不需稀释血清(浆)标本的双抗原夹心法比反应灵敏度自然低10～20倍，容易造成漏检。第二，特异性差，即使血清(浆)经过1∶10～1∶20稀释，个别标本中的IgG或IgM仍对包被反应板有非特异性吸附或对包被反应板中的杂蛋白有特异性吸附。而抗人IgG或抗人IgM酶标对特异性吸附的HCV抗体和其它方式吸附的人IgG或IgM无分辩能力，必然造成一部分假阳性。第三，一般情况下不能或不方便使用一套试剂同时检测IgG和IgM，目前商品化HCVAb间接ELISA法检测试剂盒绝大多数只检测IgG，这样有可能造成一部分单独IgM阳性标本的漏检。第四，间接ELISA试剂只能检测血清(浆)，检测过程需要特殊的仪器设备，技术要求相对较高，不利于现场筛查，也很难普及到基层医疗单位。
红细胞凝集试验又称血凝试验，是一种以红细胞作为反应指示物的免疫测定技术，这种由来已久的免疫学方法因其操作简便、不需仪器设备而广泛应用于基层医院，但因其灵敏度问题逐步被淘汰。1988年，澳大利亚学者将抗人红细胞单克隆抗体的Fab’片段与HIV的合成肽抗原偶联，得到一种双功能化学交联物，以患者自身的外周血红细胞为指示物，建立了一种称为自身红细胞凝集试验的检测方法，该检测方法用于检测人外周血HIV抗体，其灵敏度和特异性类似于ELISA，整个检测过程仅需2分钟，是一种非常简单方便的快速免疫测定技术。
近年，Lalley等应用分子生物学技术构建了重组红细胞单链抗体。其方法是将红细胞单链抗体基因与HIV-1的gp41基因融合，构建重组质粒，并将重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达后产生双功能试剂。该双功能试剂由红细胞膜蛋白抗体重链可变区(Vh)和轻链可变区(VL)组成，其间由linker相连，在轻链可变区末端连有gp41。
自身红细胞凝集试验与一般间接血凝试验不同之处为反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料为人红细胞的单克隆抗体，这种抗体能与所有血型的红细胞结合，但不引起凝集反应。这种抗体与另一特异性抗体连接形成的双功能抗体可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的抗体。反应中的标本为受检者的全血。反应步骤为将一滴全血置于一凹面玻璃板上，然后加入一滴双功能试剂，轻轻振摇2分钟后观察是否出现红细胞凝集。自身红细胞凝集试验除了可以用于测定大分子蛋白(如抗原抗体)，还可以用来测定药物等小分子。
自身红细胞凝集试验最大特点在于其简单性和快速性，对检测标本要求不高，一次仅需一滴全血。理论上，只要患者红细胞上特异性抗原不致因患病而丧失就不会影响该方法检测。在某些特定情况下，如仅贮存有或收集到患者血清，也可以加入O型血红细胞进行检测。
自身红细胞凝集试验敏感性和特异性不亚于ELISA，且可同时检测IgG和IgM，具有安全、快速、准确、价廉的特点，检测时无需分离血清，无需仪器设备，仅需一滴全血，在2分钟内可得到检测结果，非常适合条件简陋的基层医院、义务献血前以及紧急输血前的使用，因而具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是将丙肝基因工程抗原或多肽抗原同抗人红细胞单克隆抗体或基因工程单链抗体相偶联，形成双功能试剂，研制出无须任何仪器，可在2-3分钟内快速检测出是否感染HCV的丙肝病毒抗体自身红细胞凝集微量全血检测试剂，克服间接ELISA法特异性差，必需分离血清，必需仪器设备及IgG、IgM不能同时检出的弊端。
本发明是这样实现的首先利用单克隆抗体制备技术得到高效价、高特异性的血红细胞单克隆抗体，并用蛋白酶和巯基类试剂将其修饰成Fab’片段；或利用基因工程的技术手段从血红细胞单克隆抗体细胞获得单链抗体基因并进行表达获得单链抗体。在戊二醛或其他试剂的作用下将红细胞单抗Fab’片段或红细胞单链抗体同HCV抗原偶联，得到红细胞单抗Fab’-HCV抗原双功能试剂；或利用基因工程的方法直接获得具有双功能的HCV抗原和红细胞单链抗体的融合蛋白。这些双功能试剂均可与人外周血红细胞反应，但不出现红细胞凝集现象。人血中如存在HCV抗体，则由于HCV抗体与双功能试剂发生交联反应而出现肉眼可见的红细胞凝集，即为HCV抗体阳性；人血中如不存在HCV抗体，则不出现红细胞凝集，即为HCV抗体阴性。
本发明的积极效果一、简便快速建立了HCV微量全血自身红细胞凝集试验的检测方法，用于检测人外周血HCV抗体，其灵敏度类似于ELISA，整个检测过程仅需2分钟，且无需任何仪器设备，是一种甚为简单方便的快速免疫测定技术。
二、特异性强由于采用丙肝基因工程抗原或多肽抗原同人红细胞单克隆抗体或基因工程单链抗体相偶联，间接ELISA检测法中一些不可避免的非特异性标本绝大多数可被排除，提高临床诊断的准确度。
三、成本低、安全性好试验无需分离血清或血浆，无需仪器设备，成本低廉；血液中潜在的传染源在血清分离过程中对实验操作人员有传染的可能性，而自身红细胞凝集试验无需分离血清或血浆，因而是一种较为安全的检测方法。
四、社会效益好目前常用的HCV诊断方法如ELISA，PCR等，尽管特异性和敏感性较好，但对技术和设备要求高，很难普及到最基层的医疗单位。自身红细胞凝集试验操简单、反应时间短，灵敏度和特异性不亚于ELISA，非常适合条件简陋的基层医院、义务献血前以及紧急输血前的使用。
附图是关于丙肝病毒抗体红细胞自身凝集微量全血快速检测方法的基本原理及过程流程图。图1为基本原理图，图2为本发明的过程流程图。图中数字所含信息如下1.融合蛋白；2.HCV抗原；3.亲和层析结合位点；1，2，3构成HCV融合抗原。
4.同亲和层析介质混合；5.亲和层析介质；6.内含肽自剪切位点或蛋白酶切割位点或化学试剂裂解位点；7.经修饰的HCV抗原；8.人红细胞单抗；9.利用胃蛋白酶进行消化；10.得到的抗人红细胞单抗的(Fab’)2片段；11.利用试剂将(Fab’)2还原成Fab’；12.Fab’和HCV抗原结合；13.Fab’同HCV抗原结合的结合位点；14.Fab’和HCV抗原形成的双功能试剂；15.应检者全血中的红血球；16.应检者全血中的HCV抗体；
17.应检者全血、双功能试剂简单的混匀；18.自身红细胞凝集；19.HCV优势决定簇基因或单链抗体基因或双功能试剂基因；20.表达载体(经内切酶消化后)；21.含HCV优势决定簇基因或单链抗体基因或双功能试剂基因的重组质粒；22.受体细胞；23.表达HCV优势决定簇或单链抗体或双功能试剂的工程菌株；24.基因工程表达的双功能试剂；25.基因工程表达的单链抗体。
以上详述了本发明的原理、目的、实现路径和积极意义，由于抗原(或抗原决定簇)与对应抗体，配基与对应配体种类极其繁多，甚至在理论上无穷无尽，以下列实例详述本发明具体实施方式
一、红细胞单克隆抗体的制备以血红细胞作为免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞相融合，然后用有限稀释方法获得可分泌红细胞单抗的杂交瘤。具体步骤如下1.取健康动物全血，加入抗凝剂柠檬酸三钠，3000rpm低速离心，提取红细胞并用生理盐水洗涤三遍，加入含抗生素的生理盐水并稀释到每毫升2×107个细胞，初次免疫采用皮下多点注射，0.1ml/点，共四点。2周后第二次免疫，剂量同上，腹腔注射。再2周后第三次免疫，剂量同上，腹腔注射(5～7天后采血测其效价)。再过2～3周后加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射。最后一次加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射，3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，将脾脏研碎，过不锈钢筛网，离心，细胞用培养液洗2次，计数，取1×107脾淋巴细胞悬液备用，准备融合。
2.将6～10周大的BALB/C小鼠拉颈处死，浸泡在75％酒精内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200rpm离心5～6min，用20％小牛血清(NCS)的培养液混悬，调整细胞数至1×107/ml，加入96孔板，100μl/孔放入37℃的CO2孵箱培养，制得饲养细胞。
3.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心(1200rpm，8min)；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s内加入37℃预温的1ml 45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动，37℃水浴90s，加37℃预温的不完全培养液以终止PEG的作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml，离心(800rpm，6min)，弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬细胞。将上述细胞悬液加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。将培养板置37℃的含5％CO2的培养箱中培养，完成融合。
4.在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可用红细胞凝集的方法排除可直接引起红细胞凝集的克隆，再用间接红细胞凝集的方法(加入羊抗鼠IgG)筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。最后进行有限稀释得到单克隆。克隆前1天制备饲养细胞层(同上)；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，计数，调整细胞为3～10个细胞/ml；取头天准备的有饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl，孵育于37℃、5％CO2孵箱中；在第7天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养，挑取效价高于8×107的特异性单克隆冻存，并复苏传代，挑取稳定的细胞株冻存备用。
5.腹水的制备是先注射0.5ml Pristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠腹腔，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获2～5ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到2～5mg/ml。
6.红细胞单克隆抗体的纯化将蛋白A-Sepharose置于50倍体积的Tris缓冲液(pH8.6)中(超过介质50倍v/v)，充分溶胀，在室温下将其装入直径2.5cm的玻璃层析柱中，用Tris缓冲液洗以平衡；腹水样品经三倍体积Tris缓冲液稀释后，以1-5ml/min速度上样，用Tris缓冲液洗至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测)；依次用柠檬酸缓冲液、乙酸盐缓冲液以及甘氨酸--HCl缓冲液连续洗脱结合蛋白；将分部收集的洗脱的蛋白直接装入有中和缓冲液的试管中(所加有的中和缓冲液应为洗脱液体积的1/4)；用超滤器浓缩所得的单克隆抗体至1-5mg/ml，将浓缩的抗体置-20℃储存。
二、Fab’或单链抗体的获得1.Fab’的获得首先用胃蛋白酶消化红细胞单克隆抗体，得到F(ab’)2，再使用3-n-J基磷化氢(TBP)将其还原成Fab’片段，经凝胶过滤纯化；将Ellman试剂(DTNB)与Fab’反应，得到Fab’-巯硝基苯甲酸(TNB)衍生物，使Fab’受到保护，将TNB保护的Fab’经凝胶过滤纯化。
2.红细胞单链抗体(ScFv)的获得(1)杂交瘤细胞mRNA提取培养单克隆抗体杂交瘤细胞株至对数生长期，细胞计数大约为7.8×106。收集细胞，在无RNA酶条件下按QuickPrep mRNA Purification Kit提供的方法提取细胞mRNA。(2)cDNA第一条链的合成将提取到的mRNA，在反转录酶的作用下合成cDNA.。(3)鼠免疫蛋白VH和VL基因扩增以逆转录反应合成的cDNA第一条链为模板，按下列体系分别进行VH和VL基因的扩增模板16.5μl，Heavy2chainprimer1和Heavy2chain primer2各1μl，dNTP(2.5mmol/L)8μl，10×PCR缓冲液5μl，无菌双蒸水18μl，于95℃变性后加入LA Taq酶0.5μl(5U/μl)扩增。VL基因扩增同上，仅需更换引物。PCR反应参数94℃、30s，55℃、1min，72℃、1min，30个循环后，72℃延伸7min。将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，用MicroSpin columns柱回收目的基因片段。(4)ScFv基因的组装回收的VH和VL基因片段，用VHmarker进行胶定量分析，并与Linker primer Mix以近似等摩尔浓度混合，按下列体系分别进行连接PCR反应纯化的VH及VL基因各50ng，Linker primer Mix 4μl，dNTP(2.5mmol/L)20μl，10×PCR缓冲液5μl，以无菌双蒸水补充至总体积为50μl。PCR反应参数94℃、1min，63℃、4min，循环7次后72℃延伸5min，从而将VH和VL重叠延伸拼接成ScFv。并以此ScFv为模板，加入下列反应体系dNTP(2.5mmol/L)8μl，10×PCR缓冲液5μl，LA Taq酶0.5μl(5U/μl)，无菌双蒸水32.5μl。继续进行30个循环。反应条件94℃、min，55℃、2min，2℃、2min，最后72℃延伸10min。将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，用MicroSpin columns柱回收目的基因片段。ScFv基因的克隆将上述纯化的PCR产物，与pGEM-TEasy载体在T4DNA连接酶(5～7U)作用下进行连接。连接产物转化感受态E.coliTop10菌，在含有IPTG、X-gal和氨苄青霉素琼脂平板上37℃培养过夜。(5)重组质粒的鉴定挑取白色菌落，于37℃、250rpm振荡培养过夜，提取并纯化重组质粒DNA，测序鉴定。
应用基因重组技术将红细胞单抗轻、重链可变区基因与linker片段拼接后，克隆到pET-22a(美国Novagen公司产品)构建红细胞单链抗体表达载体pET-22a-scFv，转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃生长，待菌斑长出后，挑取单个克隆于含氨苄青霉素的LB培养基试管中，37℃，200rpm生长过夜。第二天，1∶100接种于新鲜含氨苄青霉素LB培养基中，37℃生长到OD600＝0.6～0.9之间。按终浓度0.5mmol/L加入1mol/L的IPTG，37℃、200rpm，诱导4小时，5000rpm、4℃离心10分钟，用pH8.0、0.02mol/LPB、0.5mol/L NaCl缓冲液将菌体洗涤一次，离心同上，菌体反复冻融三次，超声波破碎，离心后上清过Ni-金属亲和柱，用含50mmol/L咪唑的pH8.0、0.02mol/L PB、0.5mol/L NaCl缓冲液洗涤去除杂蛋白，用含100mmol/L咪唑的pH8.0、0.02mol/L PB、0.5mol/L NaCl缓冲液洗脱获得纯红细胞单链抗体蛋白，分装后-20℃冻存。
三、HCV抗原的获得将HCV优势抗原决定簇基因克隆入载体pTYB11，转化到BL21(DE3)Plys，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃生长，待菌斑长出后，挑取单个克隆于含氨苄青霉素的LB培养基试管中，37℃、200rpm生长过夜。第二天，1∶100接种于1L含氨苄青霉素的LB液体培养基中(含氨苄100μg/ml)，37℃振荡培养至OD600达0.5-0.7。加入IPTG至终浓度为0.3-0.5mM，诱导4小时，用50ml冰冷的细胞裂解缓冲液将菌体重悬，冰浴，超声破碎细胞，使蛋白释放。20,000×g，离心30分钟，上清即为澄清的细胞粗提物。将澄清的细胞粗提物缓慢加入平衡好的Chitin柱，流速约为0.5-1.0ml/min。洗柱由于CBD和Chitin beads的结合力很强，洗柱时可以用较高的流速使用800ml(至少20倍柱床体积)的缓冲液彻底洗柱。用3倍柱床体积的含有30-50mM DTT(或β-巯基乙醇或半胱氨酸)的诱裂解缓冲液过柱，使巯基化合物均匀分布于整个Chitin柱。半胱氨酸和DTT能够产生类似的诱导切割效率。对于那些对高浓度DTT敏感的目的蛋白，可采用50mM半胱氨酸和1mM DTT的混合液过柱，以诱导裂解。诱导裂解缓冲液过柱后，将Chitin柱的出水口用柱帽堵上，4-23℃放置16-40小时，诱导intein的自我裂解活性，裂解反应可在pH 7-9进行。裂解反应诱导后，目的蛋白与融合的intein分离，可进一步用特定的PBS洗脱。洗脱液大约收集10管，每管5ml(1/2柱床体积)。融合蛋白大多在第2收集管(1个柱床体积)时开始被洗脱，得到HCV抗原。
四、双功能试剂的获得1.基因工程方法直接获得将含HCV优势抗原决定簇基因的片段从表达载体上切下，克隆入pET-22a-scFv，构建表达载体pET22-scFv-HCV，转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃生长，待菌斑长出后，挑取单个克隆于含氨苄青霉素的LB培养基试管中，37℃、200rpm生长过夜。第二天，1∶100接种于新鲜含氨苄青霉素LB培养基中，37℃生长到OD600＝0.6～0.9之间。按终浓度0.5mmol/L加入1mol/L的IPTG，37℃、200rpm，诱导4小时，5000rpm、4℃离心10分钟，用pH8.0、0.02mol/LpB、0.5mol/L NaCl缓冲液将菌体洗涤一次，离心同上，菌体反复冻融三次，超声波破碎，离心后上清过Ni-金属亲和柱，用含50mmol/L咪唑的pH8.0、0.02mol/LPB、0.5mol/L NaCl缓冲液洗涤去除杂蛋白，用含200mmol/L咪唑的pH8.0、0.02mol/LPB、0.5mol/L NaCl缓冲液洗脱获得纯双功能蛋白，分装后-20℃冻存。
2.化学偶联的方法获得5mg纯Fab’或单链抗体与5mgHCV抗原混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸缓冲液10ml中，4℃下对同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下，缓慢加入1％戊二醛0.05ml，在室温下放置2小时，在4℃下对0.05mol/L的pH8.0Tris缓冲液透析平衡，用上法交联后可用50％饱和度硫酸铵沉淀浓缩，过Superdex-200分子筛凝胶层析柱纯，第一峰为双功能蛋白。
四、丙肝病毒抗体红细胞自身凝集微量全血快速检测试剂的形成将获得的双功能试剂用含0.3％的柠檬酸三钠、1％的BSA和0.05％的叠氮钠的PBS稀释到0.1mg/L，形成工作液。
检测时，将一滴待测患者的全血滴于一凹面玻璃板上，然后加入一滴双功能试剂，轻轻振摇2分钟后，如出现红细胞凝集，即为阳性，无凝集则为阴性。
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒抗体红细胞凝集检测方法，其特征为用基因工程或化学偶联的方法将人红细胞单克隆抗体或人红细胞单链抗体和丙型肝炎病毒基因工程抗原或合成肽抗原结合在一起，形成双功能试剂，以待测全血标本中的自身红细胞作为指示系统，直接检测全血标本中的丙型肝炎病毒抗体。
2.如权利要求1所述的人红细胞单抗，包括人红细胞单克隆抗体的完整结构或经过修饰的人红细胞单抗Fab’、Fab、F(ab’)2片段及基因工程人红细胞单链抗体，其特征在于，可与人红细胞结合但不引起人红细胞凝集。
全文摘要
本发明涉及一种丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus简称HCV)抗体检测方法。属疾病诊断领域中血清(浆)中抗体的自身红细胞凝集检测方法。通过基因工程方法或化学偶联方法将HCV抗原(简称HCVAg)与人红细胞单链抗体或人红细胞单克隆抗体进行偶联，得到一种既能与红细胞结合又能与丙型肝炎病毒抗体结合的双功能试剂，该双功能试剂以患者自身的外周血红细胞为指示物，来检测人外周血HCV抗体。
文档编号G01N33/531GK1920572SQ20051001790
公开日2007年2月28日 申请日期2005年8月23日 优先权日2005年8月23日
发明者李晨阳, 李玉林, 陈小科 申请人:河南省生物工程技术研究中心