专利名称：一种适用于1型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于禽类免疫学技术领域，具体地，本发明涉及一种适用于1型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集试剂盒的研制及其在1型鸭肝炎病毒抗体检测中的应用。
背景技术：
鸭病毒性肝炎(Duck virus Hepatitis，简称DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis virus，简称DHV)引起的雏鸭高度致死、高度传播性的病毒性传染病。临床上以具有明显神经症状和肝脏肿大、表面呈斑点样出血为特征。其主要侵害6周龄以内雏鸭，尤以2日至3周的雏鸭最为易感，成年鸭有抵抗力。不同日龄的雏鸭发病后，死亡率有所不同，有的高达95％，有的低于15％。耐过的鸭成为僵鸭，生长和发育受到障碍严重影响经济效益。1945年Levinl最先在美国发现DVH，其后，在英国、加拿大、德国、意大利、印度、法国陆续地报道了本病流行情况。我国黄均建等首次报道了上海某鸭场于1958年秋至1962年春本病的暴发和流行情况，次后，全国各地都相继报道了本病的爆发与流行。鸭肝炎病毒有1型、2型和3型3个血清型，1型DHV呈世界分布，2型DHV局限于英格兰，3型主要局限于美国。近年来，随着我国养鸭业的规模化发展，虽对种鸭、雏鸭进行了免疫预防，但DVH仍然时有发生，并常与病毒、细菌混合感染，给临床诊断与防制带来了很大的困难。在疾病爆发时，雏鸭的死亡速度惊人。对本病最有效的防制方法是用DHV-1疫苗免疫种鸭，使后代雏鸭获得高水平的母源抗体从而达到被动免疫的目的。另外，雏鸭在1日龄免疫弱毒疫苗，3～7d可产生免疫力，但母源抗体可影响免疫效果，所以在免疫前应对雏鸭母源抗体水平进行检测，否则可能导致免疫失败。建立1型鸭肝炎抗体的血清学检测方法，了解鸭病毒性肝炎抗体的消长和转移情况有利于制定有效的免疫程序。
目前，检测1型鸭肝炎病毒抗体方法主要有中和试验(SN)、琼脂扩散试验(AGP)、免疫荧光试验( IF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。中和试验是检测1型鸭肝炎病毒抗体最根本、最经典的方法也是国家标准方法，但该方法比较烦琐，需要很有经验的人员来操作，而且存在着固有的一些不足之处，比如操作繁琐、需时长，存在生物安全性等问题，不适合基层推广。琼脂扩散和免疫荧光试验在敏感性和特异性方面都不尽人意，且田间样本复杂多变，干扰大，使得这些方法在临床检测中的应用受到一定限制。ELISA虽然相对容易一些，但仍然需要一定的仪器设备和操作技能需要时间也较长(3-5小时)。乳胶凝集试验(Latex Aagglutination Test，简称LAT)由于其迅速(3分钟)、简单和无须专门的技能和任何特殊仪器设备而具有巨大的优势。
提纯病毒的方法很多(殷震等编著《动物病毒学》，科学出版社)，但不同的病毒，由于结构及理化特征不同，其最适提纯方法不同。在鸭肝炎病毒的提纯方面，众多的学者通过不同的方法进行提纯，但是众说纷纭，一直以来没有一种公认的可重复性强的方法。目前由于病原病毒提纯困难，难以获得高浓度高纯度的病毒，使得应用于临床的诊断一直存在发展瓶颈。蒋文灿等，用六种方法提纯1型DHVSC株，电镜观察比较了提纯结果。以“氯仿去脂一硫酸铵沉淀一蔗糖密度梯度离心法”最佳。(蒋文灿，廖德惠，谢镜怀.雏鸭病毒性肝炎的研究[J].中国兽医杂志，1989，15(1)9-11.)然而，1990年罗函禄等亦采用此种方法纯化病毒并用电镜观察确定病毒纯化程度，所得结果与蒋文灿等不一致，病毒粒子大小极不均一，可能是硫酸铵沉淀破坏了病毒的形态结构。且病毒在蔗糖中的浮密度为30％，可能是离心力不同所致。而且蔗糖较难达到完全脱糖从而易滋生细菌，影响灭活病毒液在较高温度下的保存期。而罗函禄等所采用的30％聚乙二醇(PEG)反透析法及II一DEAE纤维素色谱法取得了较好的提纯效果(罗函禄，徐汗祥，范文明等.鸭病毒性肝炎的研究[J].中国畜禽传染病，1990，(3)1-3.)。但是，采用的30％聚乙二醇(PEG)反透析法及II一DEAE纤维素色谱法均操作较繁琐，且稳定性差，病毒损耗大等缺点不适合生产化大量纯化病毒。赵新柳(ELISA检测鸭病毒性肝炎抗体的研究[J]，中国兽医科技，1990，(11)5-6) 曾提出差速超高速离心效果较好。因而，本申请人在此基础上作出进一步的改进，提高最超离速度增加病毒收集量，同时摸索出合适的离心速度组合，提高病毒的纯度。此法具有操作简单，稳定性好，病毒纯度高的特点。
从上个世纪中叶聚苯乙烯乳胶颗粒开始用做凝集试验的材料以来，由于其所具有的独特优点，如操作简便，不需要特殊的仪器，肉眼判断，也不需要对操作过程进行培训；时间短，一般在2分钟之内可以出结果；价格低廉，检测单份样品比其它血清学、病原学方法便宜得多；适合于现场检测等，在临床检验中得到了广泛的应用。其意义有①传染性疾病的诊断细菌、真菌、寄生虫、立克次体、病毒的感染检测；②自身免疫病诊断如抗核抗体、类风湿因子等检测；传统的乳胶凝集试验(LAT)是以惰性聚苯乙烯胶乳颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到相应的抗体和抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。在应用乳胶凝集技术建立病原学检测方法时，一般是将特异性抗体致敏到乳胶颗粒表面，普通聚苯乙烯胶乳和抗体的结合为无选择性的物理静电吸附，致敏物(抗原或抗体)容易从乳胶颗粒上脱落或者变性失活，导致致敏好的乳胶试剂保存期短，难以适合产品开发的需要。
发明内容
本发明的第一个目的是获得一种1型鸭肝炎病毒抗体的乳胶凝集检测试剂盒的特异性抗原。
本发明的第二个目的是组装一种适用于检测1型鸭肝炎病毒抗体的乳胶凝集试剂盒。
本发明的第三个目的是1型鸭肝炎病毒抗体的乳胶凝集试剂盒在检测中的应用，其中包括乳胶凝集卡在制备1型鸭肝炎病毒抗体的乳胶凝集试剂盒中的应用。
本发明是这样实现的 申请人:制备了一种适用于1型鸭肝炎病毒抗体检测的乳胶凝集试剂盒，它包含盒体和设在盒体内的核心试剂，它还包括阳性对照样品、阴性对照样品、样品管、刻度样品吸管、刻度乳胶吸管和观察结果用的载体，所述的核心试剂是由鸭肝炎种毒AV21111纯化并灭活的I型鸭肝炎弱毒致敏聚苯乙烯乳胶得到乳胶抗原，所述的阳性对照样品是1型鸭肝炎强毒抗血清，所述的阴性对照样品是无1型鸭肝炎母源抗体的1日龄雏鸭血清，所述的载体是带有凹窝的纸质乳胶凝集卡。该乳胶凝集卡用油墨印制，其凹窝为圆形，窝底为黑色，凹窝周围为白色。
一种1型鸭肝炎病毒抗体检测的乳胶凝集试剂盒的制备方法，其步骤在于 1)将1型鸭肝炎病毒种毒株AV21111进行增殖与纯化，得到核心试剂的抗原； 2)将步骤1)的抗原致敏乳胶颗粒，得到致敏乳胶； 3)制备I型鸭肝炎病毒抗体阳性对照血清和阴性对照血清； 4)制作用于承载样品和观察结果的纸质的乳胶凝集卡。
其中纯化1型鸭肝炎病毒的方法是 1)将I型鸭肝炎弱毒株AV21111无菌接种于鸡胚尿囊腔内，蜡封，并置于37.8℃孵化箱中培养，剔除24h内死亡的鸡胚，无菌收取24小时后死亡的鸡胚尿囊液备用； 2)在步骤1)的鸡胚尿囊液中加入1％的福尔马林溶液置于4℃灭活12h以上，先经5000rpm离心30min，取上清，反复冻融3次，10000rpm离心30分钟，取上清，15000rpm离心30分钟，取上清，60000rpm离心2h，去上清，按体积比取步骤1)的尿囊液体积的1/24的磷酸盐缓冲液(0.02M、pH7.2)洗涤沉淀，重悬得到纯化的I型鸭肝炎弱毒； 3)利用扫描电镜或核酸蛋白测定仪鉴定步骤2)的I型鸭肝炎弱毒纯度。
本发明的检测试剂盒能直接对样本中的1型鸭肝炎病毒抗体进行检测。若样本中含有1型鸭肝炎病毒抗体，则乳胶试剂在30秒内出现明显均匀一致的凝集，即可判为阳性结果；若样本中不含有1型鸭肝炎病毒抗体，则乳胶试剂在3分钟内液滴仍然呈原有的均匀乳状，即可判为阴性结果。
与现有技术相比本发明具有如下优点 1、本发明的试剂盒能直接对1型鸭肝炎病毒抗体进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，检测样品范围宽包括抗1型鸭肝炎的完整型IgY、缺失型IgY和IgM均能检测到； 2、本发明的试剂盒适用于对1型鸭肝炎病毒抗体进行检测，而对其它病原所引起的抗体具有特异性。
3、本发明设计了纸质凝集卡，改进了以往使用玻片凝集的缺点即对比度不足、反光性强结果难判断，成本高，承载样本量小等缺陷。本发明的凝集卡具有以下优点①由于采用黑色背景加强了对比度利于对结果的判断，同时白色纸质背景利于标记；②本发明的凝集卡即能检测15个样本，样本承载量大，且可根据样品量随意裁剪。③由于采用纸质降低了成本，质轻便于运输，且可回收利用促进了环保。④凝集卡通过克服张力处理，使得乳胶及样品混合液能相当均匀地铺满整孔，从而更有利于结果判断。⑤凝集卡作了凹窝处理，使不同样品检测液不会混淆。⑥凝集卡凹窝直径是依据本发明试剂盒反应体系而确定的，因而能使乳胶与样品的混液恰好铺满整个圆形凹窝而又不会因铺涂面积过大而蒸发过快。⑦凝集卡采用油墨进行印刷从而克服了乳胶及样品水份渗漏的缺陷。
3、本发明的检测方法不需要任何特殊仪器、设备，具有检测成本低的特点。试剂盒操作简便，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒保存期长，在4℃条件下放置半年不会影响其敏感性。
图1是本发明总体技术路线图； 图2经纯化后的1型鸭肝炎弱毒株病毒在80万倍电镜下的均匀度及形态。
图3经纯化的病毒液经10％SDS-PAGE分离后所形成的条带。
图4本发明乳胶凝集卡外观(a、正面b、背面)。
具体实施例方式 实施例1 I型鸭肝炎弱毒的增殖与纯化 1、I型鸭肝炎弱毒病毒的增殖 将1型鸭肝炎弱毒株(AV21111，购自北京农业部中国兽药监察所)的冻干粉，用灭菌生理盐水按体积比为1∶1000进行稀释，同时加入终浓度为5％青霉素、链霉素作用1小时，无菌操作接种于鸡胚尿囊腔(0.1mL/胚)。然后蜡封并置于37.8℃孵化箱中培养。每天照蛋2次。剔除24h内死亡鸡胚。无菌收取24小时后死亡的鸡胚尿囊液备用。
2、I型鸭肝炎弱毒病毒的纯化 在上述收集的鸡胚尿囊液中加入1％的福尔马林溶液置于4℃灭活12h以上。先经5000rpm离心30min，取上清，反复冻3次，10000rpm离心30分钟取上清，15000rpm离心30分钟取上清，60000rpm离心2h去上清并用原尿囊液体积的1/24的的磷酸盐缓冲液(0.02M、pH7.2，配方见下所述)洗涤，沉淀重悬即得纯化的1型鸭肝炎弱毒。
3、I型鸭肝炎弱毒病毒纯度鉴定 ①电镜观察取上述重悬的病毒液50ul作负染电镜观察。结果见附图3。
②10％SDS-PAGE胶电泳参照《分子克隆实验指南》(布鲁克著，金中雁译，科学出版社)10％SDS-PAGE胶(5％Acrylamide)取上述重悬的病毒液及60000rpm离心2h后之上清各1μL放入EP管中，分别用磷酸盐缓冲液(0.02M、pH7.2)作10倍稀释。并分别加入10μL溴酚蓝上样缓冲液，盖上打孔，放入沸水中煮3min，然后上样到10％SDS-PAGE胶中并Marker(香港昊柏生物科技有限公司H-015)，接上电源调至80V开始电泳，当溴酚蓝迁移至分离胶时将电压调至120V，当溴酚蓝迁移至分离胶末端时停止电泳。染色1h、用脱色液脱色过夜、换脱色液再脱色1h，结果见附图3。
③经核酸蛋白测定仪(eppendorf)测得上述重悬的10％病毒液的蛋白浓度为864.09μg/mL，即重悬的病毒液蛋白浓度为8640.9μg/mL。
实施例2 I型鸭肝炎弱毒病毒抗乳胶凝集检测的建立 ①乳胶前处理取6ml，10％聚苯乙烯乳胶放入EP管A中，加入21ml，磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.01M)。称取胰酶0.3g溶于3mL，磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.01M)。，然后加入EP管A中水浴(56℃)作用18h，中间摇匀5-6次后用碳酸盐缓冲(pH9.6，0.1M)液洗3遍，并用碳酸盐缓冲液(pH9.6，0.1M)重悬到30ml即成2％乳胶可置于4℃备用。
②将上述2％乳胶用碳酸盐缓冲液稀释(pH9.6，0.1M)至1％，与适量的纯化后的1型鸭肝炎弱毒致敏一定时间后用磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.01M，加入0.05％吐温)洗涤2次。再用无吐温磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.01M)洗涤1次并重悬至60mL得1％致敏乳胶。其具体步骤如下 1、最佳致敏1病毒量的确定 在1mL 1％乳胶中，分别加入不同量的1型鸭肝炎弱毒液，1型鸭肝炎弱毒液可根据离心需要进行稀释。从50μg、100μg、150μg递增至350μg，收集上清，经核酸蛋白测定仪(eppendorf 8.5mm)测定上清中剩余的病毒蛋白量，计算病毒的结合效率，计算公式如下 病毒的结合效率(％)＝(病毒的初始加入量-剩余的病毒量)/病毒的初始加入量×100％ 经试验验证，在1mL浓度为1％的乳胶中，当加入的病毒蛋白量为300μg时，结合效率达到最大，此时乳胶检测的灵敏度最高，稳定性最好，故选择该加入量为病毒致敏的最佳量。具体结果见表1 表1 1型鸭肝炎弱毒不同加入量对的结合效率的影响 注本表所指病毒为1型鸭肝炎弱毒 2、最佳致敏时间的选择 在1mL1％乳胶中，加入300μg病毒，在室温作用不同的时间(0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h)，作用完后收集上清，经核酸蛋白测定仪(eppendorf eppendorf 8.5mm)测定上清中剩余的病毒蛋白量，计算病毒的结合效率，计算公式如下 病毒的结合效率(％)＝(病毒的初始加入量-剩余的病毒量)/病毒的初始加入量×100％ 结合到乳胶上的病毒量＝病毒的初始加入量-剩余的病毒量 经试验验证，当结合时间达到2.5h时，结合到乳胶微球上的病毒量基本上不再变化，此时结合效率达到最大，所以选用2.5h作为最佳致敏时间。具体结果见表2 表2 1型鸭肝炎弱毒不同致敏时间对结合效率的影响 注本表所指病毒为1型鸭肝炎弱毒 3、偶联反应温度的选择 不同致敏温度影响到乳胶对1型鸭肝炎弱毒的结合效率，故选取37℃、25℃、4℃分别进行试验。病毒结合率计算公式同上。
经试验验证，当温度在37℃时结合效率最大，故选用37℃作为最佳致敏时间。具体结果见表3 表3 1型鸭肝炎弱毒不同致敏温度对结合效率的影响 注本表所指病毒为1型鸭肝炎弱毒 4、致敏加样方式的选择 采用以上确定的最佳致敏病毒量，最佳致敏时间，最佳致敏温度，对不同的致敏的加样方式进行对比，病毒结合率计算公式同上。经试验得出最佳的致敏方式为，采用磁力搅拌器先放入1％空白乳胶再将1型鸭肝炎弱毒逐滴缓缓加入为最佳致敏方式。具体结果见表4 表4 不同致敏方式对结合效率的影响 实施例3 I型鸭肝炎病毒抗体阳性、阴性对照血清的制备 1动物准备引进无母源抗体1日龄雏鸭20只，隔离饲养3周，第三周翅静脉采取5ml/羽的鸭血制备阴性血清，并以0.05％强力霉素饮水，预防细菌感染，观察一周，表现正常时便可以接种。
2接种分组A8只接I型鸭肝炎郑株强毒肝匀浆(中科院武汉病毒所惠赠本室保藏)，B12只接I型鸭肝炎弱毒株尿囊液。
3弱毒尿囊液处理将采取的尿囊液取80ml反复冻融三次，作5000转离心20min，取上清液加等体积氯仿强烈振荡30min，5000转离心20min取上清用等体积氯仿按上述步骤，重复抽提二次，取上清用蔗糖浓缩为8ml。
4强毒肝悬液的的制备无菌采取病鸭的肝脏组织，称重，剪碎并用灭菌玻璃匀浆器制备组织匀浆，按1∶10(质量/体积比)加入生理盐水(含青霉素、链霉素各20U/ml)。将匀浆液转到离心管中，8000r/min离心5min，取其中间清亮部分再8000r/min离心20min重复一次。离心后弃去上层脂肪和下层沉淀，抽取中间清亮的液体，反复冻存三次，再次离心取上清置-20℃备用。
5接种取出处理好的弱毒尿囊液及强毒肝悬液，加入1％甲醛过夜灭活，并加入2-5％的双抗作用1小时，与弗氏不完全佐剂乳化后，以0.2ml/羽颈部皮下注射，隔10天再免一次共免4次，取血清测效价。
6鸭抗DHV高免血清中和效价的测定完成免疫程序后，先取少量血清进行效价测定。
①测病毒LD50将弱毒病毒原液按10倍递增稀释，选择102、103、101、105、106、107个稀释度分别接种9日龄的鸡胚，每胚0.1ml，每个稀释度作为一组，每组5个蛋，另设对照5个。接种后观察一周内的死亡数和生存数。按Reed-Muech法计算。实验结果如下表5 表5 AC21111弱毒株LD50的测定 经计算得LD50为10-5 278。
注表5用的弱毒株AC21111购自北京中国动物监督所，传代C21-1-1。
②中和指数测定将20只免疫后的鸭的血清各取1mL血清混和后用灭菌生理盐水作倍比稀释从1∶4到1∶128(即5个稀释度)，同时将经毒价滴定的病毒稀释成每个单位剂量含100LD50；两者分别等量混合并加入2-5％的青霉素、链霉素双抗37℃水浴1小时，然后接种于9日龄鸡胚尿囊腔内，每胚0.1ml，每个血清滴度接种5只鸡胚，另设病毒对照、血清对照和生理盐水对照各5个，24小时内死亡的鸡胚弃去不计.记录7天内的鸡胚死亡情况，计算血清的中和效价。接毒后70h病毒对照组全部死亡，至实验结束血清对照组和生理盐水对照组均存活，其它实验结果如下表6 表6 鸭肝炎阳性血清中和效价测定 可见该血清混合物的中和效价恰好为1∶32。
7、多克隆抗体(抗血清)的提取及保存用输液管从鸭颈静脉放血，收集的血液置于室温下1h左右，凝固后析出血清置4℃下使血凝块收缩，离心，4000rpm，10min。在无菌条件，吸出血清加入0.01％硫柳汞，分装小瓶(0.05～0.2ml)，置-20℃以下低温保存。亦可将抗血清冷冻干燥后保存。
8、阴性血清制备方法 以5mL一次性注射器抽取5mL血/只，血清的提取保存方法同阳性血清提取法。
实施例4 I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒的敏感性试验、特异性试验和反应体系试验 1、敏感性试验 将I型鸭肝炎病毒阳性血消倍比稀释，分别用致敏好的乳胶诊断试剂检测，可见该试剂盒可检测至1∶256的滴度。结果见表7 表7 本发明试剂盒的敏感性试验 注“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明，30秒以内发生凝集；“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊30秒到1分钟内发生凝集；“++”约50％乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊1-2分钟内发生凝集；“+”有少许凝集2-3分钟内发生凝集，液体呈混浊；“-”液滴呈原有的均匀乳状超过3分钟不凝集。
2、特异性试验 将致敏好的乳胶试剂与I型鸭肝炎病毒阳性血清反应呈强阳性，与鸭的主要的疾病的病原抗血清如鸭瘟病毒抗体阳性血清、鸭疫里氏杆菌抗体阳性血清、鸭链球菌抗体阳性血清等均不反应，达到了较好的特异性。结果见表8 表8 特异性试验(n＝5) 3、反应体系试验 由于样品通常来源于雏鸭，因而节约样品极其重要，故在整个反应体系的确定过程中在保证反应分辨率的前提下申请人优先考虑较少的样品量。申请人将1％致敏乳胶加入量周定在40μL。样品加入量倍比递增，通过反应结果来确定样品的加入量。通过实验将反应体系确定为1％致敏乳胶40μL，血清样品2μL。具体实验如下表。
反应体系试验 实施例5 I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒的重复性试验 1、批内重复性试验 制备6批I型鸭肝炎抗体乳胶凝集检测试剂盒(乳胶批号分别为070313-14、070403-04、070424-24、070427-28、070628-29、070701-02)对每批次的致敏乳胶均取六个分装号，同时均作其盒内阳性对照样品、阴性对照样品、鸭瘟抗体阳性血清和里氏杆菌抗体阳性血清检测，观察其敏感性、特异性和稳定性。结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本乳胶凝集方法的批内重复性良好。其检测结果见表9、10、11、12、13、14所示 表9 本发明试剂盒的批内重复试验(试剂盒批号070313-14) 表10 本发明试剂盒的批内重复试验(试剂盒批号070403-04) 表11 本发明试剂盒的批内重复试验(试剂盒批号070424-24) 表12 本发明试剂盒的批内重复试验(试剂盒批号070427-28) 表13 本发明试剂盒的批内重复试验(试剂盒批号070628-29) 表14 本发明试剂盒的批内重复试验(试剂盒批号070701-02) 2、批间重复性试验 随机抽取在不同时间制备6批1型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒每批各一个(乳胶分装批号分别为070313-148、070403-047、070424-243、070427-282、070628-291、070701-029)，对同一份阳性对照、阴性对照、鸭瘟抗体阳性血清和里氏杆菌抗体阳性血清进行检测，观察其敏感性、特异性和稳定性。结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本LAT方法的批间重复性良好如表15所示。
表15 本发明试剂盒的批间重复试验 实施例6 I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒的保存期试验 1、高温对本发明试剂盒的破坏作用(37℃下贮存3天) 将6个不同批次的I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒(乳胶分装批号分别为070313-141、070403-041、070424-241、070427-281、070628-291、070701-021)于37℃下贮存3天后，与保存在4℃贮存的同批试剂盒同时检测标准阴性、阳性对照，结果(如表16所示)表明高温(37℃贮存3天)对试剂盒的破坏作用不足于破坏其稳定性。
表16 高温(37℃作用3天)对本发明试剂盒的破坏作用 2、试剂盒的保存期实验(4℃) 将同一批致敏的乳胶试剂分装成小份，分别在4℃和室温下保存1至9个月，每月定期进行凝集试验，分别与阳性对照样品、阴性对照样品、鸭瘟抗体阳性血清和里氏杆菌抗体阳性血清反应，观察其敏感性、特异性和稳定性，以确定乳胶试剂的保存期。在本试验中，申请人制备了三个批次的乳胶诊断试剂(批号070313-141、070403-04、070424-24)，同时进行平行试验。通过本试验，乳胶试剂经4℃保存4个月以上其特异性，稳定性、敏感性均不发生改变。结果见表17，18，19 注表17、18、19所述时间均为2007年。
表17 本发明的乳胶诊断试剂保存期试验(批号070313-141) 表18 本发明的乳胶诊断试剂保存期试验(批号070403-04) 表19 本发明的乳胶诊断试剂保存期试验(批号070424-24) 实施例7 I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒与中和试验检测结果的比较试验 1、中和试验及结果制阳性血清后对20只鸭的混和血清作中和试验结果见上述实例3。
2、I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒使用I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒对用于中和试验的混和血清进行检测，同时对每一份血清进行独立检测，结果如下表20 表20 本发明的试剂盒对20只免疫鸭的检测结果 实施例8 I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集试验与间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的比较 1、敏感性比较 将本发明的试剂盒阳性对照样品做倍比稀释后同时用发明的试剂盒和I型鸭肝炎病毒抗体间接ELISA检测，结果(表21)表明I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒和比ELISA敏感性略差。这是由于这两种方法本身存在的差异所决定的。ELISA由于使用酶标二抗及酶标仪进行结果检测因而敏感较乳胶的肉眼观察高是合理的，当然敏感性的提高同时也使得ELISA得出假阳性检测结果也相应提高。故而该差异不影响本发明的试剂盒的应用。
表21 敏感性比较结果 2、特异性比较 使用本发明的试剂盒试剂盒和ELISA同时检测与鸭的主要的疾病的病原抗血清如鸭瘟病毒抗体阳性血清、鸭疫里氏杆菌抗体阳性血清、鸭链球菌抗体阳性血清等，检测结果呈现出乳胶具有更好的特异性。这可能因为乳胶不使用二抗的原因。结果见表22 表22 特异性检测结果 3、符合率比较 使用本发明的试剂盒和ELISA同时检测结果见表23 表23本发明的乳胶凝集试验与间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的符合率比较结果(单位羽份) 符合率＝(相同的阳性样品数+相同的阴性样品数/总数)×100％ 实施例9 乳胶凝集卡设计及前处理 本发明的乳胶凝集卡每卡包括15个样品凹窝，样品窝底为黑色，窝型为圆形，窝周为白色(见附图4)。每个试剂盒包括两张乳胶凝集卡共30个样品凹窝，可检样品28份(另外两窝则用于作阳性和阴性对照)。
本发明的乳胶凝集卡是由印刷厂印制的带有凹窝的纸质的凝集卡(武汉市洪山区壕沟种子印务承制)。
乳胶凝集卡是本发明试剂盒的一个显著特色。众所周知，在传统的凝集试验中常采用玻片作载体，如果玻片不干净便会造成乳胶液滴表面张力过大不易涂开从而影响判定。在未经处理的纸质凝集卡上由于需要采用油质印刷，故而同样存在表面张力过大的问题。为克服该问题申请人通过不同的溶剂进行处理验证，以75％洒精棉球擦拭效果最好，致敏乳胶与样品的混和液能均匀地铺满整个圆孔便于观察结。具体制备方法如表24 表23 乳胶凝集卡乳胶表面张力试验 实施例10 I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒的盲样检测 为验证本发明的试剂盒在结果判断过程中不同人可能造成的差异。本人邀请10位从来没做过乳胶凝集试验的人在说明书的指导下对本发明的试剂盒试验过的已知具有不同I型鸭肝炎病毒抗体滴度的4个血清样本进行试验，并要求他们将自己的实验结果从强阳性到阴性按其强弱进行排序。该实验是在不同地点，不同时间，不同实验者，并且10位实验者事先不知道别人实验结果情况下独立完成的。结果表明，所有10位实验者与本人的排序完全一致。因而证明该试剂盒具有可重复性、敏感性好、结果分辨率强，易于判断且对于不同的人的差别不大的优点。
实施例11 I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒的组装 1、I型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒包括 1)乳胶抗原1管 (1.2ml/管) 2)阳性对照1管 (0.05ml/管) 3)阴性对照1管 (0.05ml/管) 4)样品管 30管 (200μL空管) 5)样品定量吸管30支 (定量线2μL) 6)乳胶定量吸管1支 (定量线40μL) 7)乳胶凝集卡 2块 (30样个品孔) 实施例12 本发明试剂盒的使用方法 1、样品制备 1)雏鸭血清样品提取方法小跖骨内侧用酒精棉球消毒，然后用7号针头刺破鸭小跖骨静脉让血流进样品管中，约1-2滴然后用干棉花止血。收集的血液置于室温下1h左右，血液凝固析出血清后置4℃下使血凝块收缩。
2)20日龄以上鸭血清样品提取方法。翅膀内侧酒精棉球消毒，贵要静脉采血置于样品管中，约1-2滴然后用干棉花止血。收集的血液置于室温下1h左右，血液凝固析出血清后置4℃下使血凝块收缩。
2、检测 用乳胶定量吸管吸取乳胶到定量线(40μL)滴于凝集板上的黑色凹孔内，用样品定量吸管从样品管中小心吸取血清至定量线(2μL)，注意别吸到血凝块，滴于凝集板上的乳胶滴中，搅拌混匀使乳胶及样品混合液铺满整个黑色圆孔，摇动30秒后观察结果。
3、结果判定 1)对照试验30秒内出现如下结果，试验方可成立阳性对照与乳胶诊断试剂作用出现明显均匀一致的凝集，阴性对照与乳胶诊断试剂不凝集。
2)“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明，30秒以内发生凝集；“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊30秒到1分钟内发生凝集；“++”约50％乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊1-2分钟内发生凝集；“+”有少许凝集2-3分钟内发生凝集，液体呈混浊；“-”液滴呈原有的均匀乳状超过3分钟不凝集。“++++”“+++”视为强阳性，“++”“+”视为弱阳性，“-”视为阴性。
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。
附录本发明的缓冲液的配制 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，用双蒸水定容至1000ml。
0.02M pH7.2的磷酸盐缓冲液NaCl 8.0g，Na2HPO4.12H2O 1.41g，KH2PO4 0.14g，用双蒸水定容至1000ml。
0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液Na2CO3 3.18g，NaHCO3 5.86g，用双蒸水定容至1000ml。
2×SDS-PAGE上样缓冲液0.5M pH6.8 Tris碱2.0mL，10％SDS 4.0mL，甘油2.0mL，1％溴酚蓝0.05mL，双蒸水 定容至10mL，DTT 0.154g(用时现加)。
脱色液醋酸3mL，甘油10mL，双蒸水87mL。
权利要求
1、一种适用于1型鸭肝炎病毒抗体检测的乳胶凝集试剂盒，它包含盒体和设在盒体内的核心试剂，它还包括阳性对照样品、阴性对照样品、样品管、刻度样品吸管、刻度乳胶吸管和观察结果用的载体，其特征在于，所述的核心试剂是由鸭肝炎种毒AV21111纯化并灭活的I型鸭肝炎弱毒致敏聚苯乙烯乳胶得到乳胶抗原，所述的阳性对照样品是1型鸭肝炎强毒抗血清，所述的阴性对照样品是无1型鸭肝炎母源抗体的1日龄雏鸭血清，所述的载体是带有凹窝的纸质乳胶凝集卡。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的乳胶凝集卡凹窝为圆形，窝底为黑色，凹窝周围为白色。
3、根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的乳胶凝集卡用油墨印制。
4、权利要求1所述的1型鸭肝炎病毒抗体检测的乳胶凝集试剂盒的制备方法，其步骤在于
1)将1型鸭肝炎病毒种毒株AV21111进行增殖与纯化，得到乳胶抗原；
2)将步骤1)的乳胶抗原致敏乳胶颗粒，得到致敏乳胶；
3)制备I型鸭肝炎病毒抗体阳性对照血清和阴性对照血清；
4)制作用于承载样品和观察结果的纸质的乳胶凝集卡。
5、根据权利要求4所述的方法，其中纯化1型鸭肝炎病毒的方法是
1)将I型鸭肝炎弱毒株AV21111无菌接种于鸡胚尿囊腔内，蜡封，并置于37.8℃孵化箱中培养，剔除24h内死亡的鸡胚，无菌收取24小时后死亡的鸡胚尿囊液备用；
2)在步骤1)的鸡胚尿囊液中加入1％的福尔马林溶液置于4℃灭活12h以上，先经5000rpm离心30min，取上清，反复冻融3次，10000rpm离心30分钟，取上清，15000rpm离心30分钟，取上清，60000rpm离心2h，去上清，按体积比取步骤1)的尿囊液体积的1/24的磷酸盐缓冲液(0.02M、pH7.2)洗涤沉淀，重悬得到纯化的I型鸭肝炎弱毒；
3)利用扫描电镜或核酸蛋白测定仪鉴定步骤2)的I型鸭肝炎弱毒纯度。
6、根据权利要求4所述的方法，其中步骤4)所述的乳胶凝集卡带有圆形凹窝，窝底为黑色，凹窝周围为白色。
7、权利要求1、2或3所述的乳胶凝集卡在制备乳胶凝集检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明属于禽类免疫学技术领域，具体涉及一种适用于1型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集试剂盒及其在1型鸭肝炎病毒抗体检测中的应用。本发明的试剂盒，包含盒体和设在盒体内的核心试剂，阳性对照样品、阴性对照样品、样品管、刻度样品吸管、刻度乳胶吸管和观察结果用的载体，其特征在于，所述的核心试剂是由鸭肝炎种毒AV21111纯化并灭活的1型鸭肝炎弱毒致敏聚苯乙烯乳胶得到乳胶抗原，所述的阳性对照样品是1型鸭肝炎强毒抗血清，阴性对照样品是无1型鸭肝炎母源抗体的1日龄雏鸭血清。所述的载体是带有凹窝的纸质乳胶凝集卡。本发明还公开了该试剂盒的制备方法及应用。该试剂盒能特异性强、灵敏度高、操作简便和诊断快速等显著优点。
文档编号G01N33/543GK101101297SQ20071005282
公开日2008年1月9日 申请日期2007年7月24日 优先权日2007年7月24日
发明者胡薛英, 彭婉芬, 程国富, 谷长勤, 张万坡 申请人:华中农业大学