专利名称：：Ⅰ型和ⅱ型抗-cd20抗体的组合疗法的制作方法I型和II型抗-CD20抗体的组合疗法本发明涉及两种不同的抗-CD20抗体用于制备用于治疗癌症，尤其是表达CD20的癌症的药物的应用。
背景技术：
：⑶20分子(也称为人B-淋巴细胞-限制性分化抗原或Bp35)是位于前-B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上的分子量约为35kD的疏水性跨膜蛋白(Valentine，Μ.Α.，等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264(19)(1989)11282-11287；和Einfield，D.Α.，等EMBOJ.7(3)(1988)711-717)。⑶20存在于超过90%的来自外周血或淋巴器官的B细胞的表面上并且在前B细胞发育的早期过程中表达，并且保持直到血浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上。具体而言，⑶20在超过90%的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson,K.C.，等，血液(Blood)63(6)(1984)1424-1433)，但是不存在于造血干细胞，前B细胞，正常血浆细胞或其它正常组织(Tedder，Τ.F.，等，J，Immunol.(免疫学杂志)135(2)(1985)973-979)。CD20蛋白的85个氨基酸的羧基末端区域位于细胞质内。该区域的长度与其它B细胞特异性表面结构如IgM，IgD，和IgG重链或Il类组织相容性抗原α或β链的长度形成对照，其分别具有3，3，28，15，和16个氨基酸的相对较短的细胞质内区域(K0mar0my，M.，等，NAR11(1983)6775-6785)。在最后61个羧基端氨基酸中，有21个是酸性残基，而仅有2个是碱性的，这说明该区域具有强净负电荷。GenBank登记号是NP-690605。认为⑶20可能参与调节B细胞的活化和分化过程中的早期步骤(Tedder等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)25卷16(1986)881-887)并且可以起钙离子通道的作用(Tedder，T.F.，等，细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)14D(1990)195)。存在两种不同类型的抗-⑶20抗体，其显著不同在于它们的⑶20结合模式和生物活性(Cragg,M.S.，等，血液(Blood)，103(2004)2738-2743；和Cragg,M.S.，等，血液(Blood)，101(2003)1045-1052)。I型抗体，如利妥昔单抗，在补体介导的细胞毒性中是有效的，而II型抗体，如托西莫单抗(Bi)，11B8和AT80或人源化的B-Lyl抗体通过伴随磷脂酰丝氨酸暴露的胱天蛋白酶不依赖性程序性细胞死亡有效地起始靶细胞死亡。I型和II型抗⑶-20抗体的共享共有特征总结如下表1<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表1:1型和II型抗⑶-20抗体的性质W02004035607涉及针对CD20的人单克隆抗体及其用于治疗与表达CD20的细胞相关的疾病的应用。发明简述本发明包括I型抗-⑶20抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗表达⑶20的癌症，所述应用的特征在于所述I型抗-CD20抗体与II型抗-CD20抗体共同施用。本发明还包括I型抗-⑶20抗体作为第一抗-⑶20抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗表达CD20的癌症，所述应用的特征在于所述a)所述第一抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述第一抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.8-1.2的比率，b)所述第一抗-⑶20抗体与作为第二抗-⑶20抗体的II型抗-⑶20抗体共同施用c)所述第二抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述第二抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.3-0.6的比率。本发明包括I型抗-⑶20抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗患有表达CD20的癌症的患者，所述应用的特征在于所述I型抗-CD20抗体与II型抗CD-20抗体共同施用。本发明还包括I型抗-⑶20抗体作为第一抗-⑶20抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗患有表达CD20的癌症的患者，所述应用的特征在于所述a)所述第一抗-⑶20抗体具有这样的比率，S卩，关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述第一抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.8-1.2的比率，b)所述第一抗-⑶20抗体与作为第二抗-⑶20抗体的II型抗-⑶20抗体共同施用c)所述第二抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述第二抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.3-0.6的比率。本发明还包括I型抗-⑶20抗体，其用于治疗表达⑶20的癌症，其特征在于所述I型抗-⑶20抗体与II型抗⑶-20抗体共同施用。本发明还包括I型抗-⑶20抗体，其用于治疗患有表达⑶20的癌症的患者，其特征在于所述I型抗-CD20抗体与II型抗CD-20抗体共同施用。优选地，所述表达⑶20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。优选地，所述第一和第二抗-⑶20抗体(I型和II型)是单克隆抗体。优选地，所述I型抗-⑶20抗体是利妥昔单抗。优选地，所述II型抗-⑶20抗体是人源化的B-Ly1抗体。优选地，所述II型抗-⑶20抗体具有增加的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。优选地，所述I型抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC_No.CCL-86)上⑶20的结合能力，所述第一抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.9-1.1的比率。优选地，所述II型抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上⑶20的结合能力，所述第二抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.35-0.55，更优选地，0.4-0.5的比率。在本发明的一个优选实施方案中，所述I型抗-CD20抗体是利妥昔单抗，所述II型抗-⑶20抗体是人源化的B-Lyl抗体并且所述表达⑶20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。本发明还包括用于组合治疗患有表达⑶20癌症的患者的试剂盒，其包括II型抗-⑶20抗体和I型抗-⑶20抗体。优选地，所述试剂盒特征在于所述I型抗-CD20抗体是利妥昔单抗，所述II型抗-⑶20抗体是人源化的B-Lyl抗体并且所述表达⑶20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)ο发明详述术语“抗体”包括各种形式的抗体，其包括但不限于完整抗体、人抗体、人源化抗体和遗传改造的抗体如单克隆抗体，嵌合抗体或重组抗体以及所述抗体的片段，条件是保持按照本发明的特征性特点。用于本文时，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单氨基酸组成的抗体分子的制剂。因此，术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在一个实施方案中，人单克隆抗体是通过杂交瘤产生的，所述杂交瘤包含获自转基因非人动物，例如转基因小鼠的B细胞，所述B细胞具有包含融合于无限增殖化细胞的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。优选地，所述第一和第二抗-⑶20抗体(I型和II型)是单克隆抗体。术语“嵌合抗体”指一种单克隆抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。特别优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。这种鼠/人嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述免疫球蛋白基因包括编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是其中类或亚类已经经过从初始抗体的类或亚类修饰或改变的那些。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison,S.L.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.AcadSci.USA)81(1984)6851-6855；US5,202，238和5，204，244。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰从而包括与亲本免疫球蛋白的特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠⑶R移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见，例如，Riechmann,L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，Μ.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合和双功能抗体的抗原的那些代表性序列。用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(vanDijk，M.A.，和vandeWinkel，J.G.，当前化学生物学观点(Curr.Opin.inChemicalBiology)5(2001)368-374)。基于所述技术，可以生产针对多种靶标的人抗体。人抗体的实例例如描述于Kellermarm，S.Α.，等，当前生物技术观点(CurrOpinBiotechnol.)13(2002)593-597。用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NSO或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经过体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。用于本文时，“特异性结合”或“特异性结合于”指特异性结合于CD20抗原的抗体。优选地，结合亲和性是10_8mOl/l以下，优选地，10_9mOl/l以下(例如lO.mol/l)的KD值，更优选地，具有I(T1V)Vl以下(例如，10_12mol/l)的KD-值。结合亲和性用标准结合测定法，如在表达CD20的细胞上的表面等离振子共振技术(例如Biacore)来确定。用于本文时“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选是双链DNA。“恒定结构域”不直接参与抗体与抗原的结合但是参与效应子功能(ADCC，补体结合和CDC)。用于本文时，“可变区”(轻链(VL)的可变区，重链(VH)的可变区)表示直接参与抗体与抗原结合的每个轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列是广泛保守的，并通过三个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)连接。所述构架区采取b折叠构象并且所述CDRs可以形成连接b折叠结构的环。每条链中的CDRs通过构架区保持它们的三维结构并且与来自另一条链的CDRs—起形成抗原结合位点。抗体的重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和性中具有特别重要的作用，并且因此提供本发明的另外的目标。用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FRl，CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照KabatE.A.等，免疫目的的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth)，Bethesda，MD.(1991))的标准定义和/或来自“高变环”的那些残基来确定⑶R和FR区域。术语“⑶20‘‘和‘‘⑶20抗原‘‘在本文中交互使用，并且包括人⑶20的任何变体，同种型和物种同源物，其由细胞天然表达或在用CD20基因转染的细胞上表达。本发明的抗体与CD20抗原的结合通过使CD20失活来介导对表达CD20的细胞(例如肿瘤细胞)的杀死。对表达⑶20的细胞的杀死可以通过下列机制中的一种或多种发生细胞死亡/程序性细胞死亡诱导，ADCC和/或⑶C。⑶20的同义词，如本领域所公认地，包括B-淋巴细胞抗原⑶20，B_淋巴细胞表面抗原Bi，Leu-16,Bp35,BM5，和LF5。根据本发明的术语“抗-CD20抗体”是特异性结合于CD20抗原的抗体。根据抗-⑶20抗体与⑶20抗原的结合性质和生物活性，可以根据Cragg，Μ.S.，等，血液(Blood)103(2004)2738-2743；和Cragg,M.S.，等血液(Blood)101(2003)1045-1052区分两种类型的抗-CD20抗体(I型和II型抗CD-20抗体)，见表2。表2:1型和II型抗⑶-20抗体的性质<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>I型和II型抗-CD20抗体的一种基本性质是它们的结合模式。因此，I型和II型抗-⑶20抗体可以通过所述抗-⑶20抗体和利妥昔单抗与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20结合能力相比的比率进行分类。I型抗⑶-20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.8-1.2，优选地0.9-1.1的比率。所述I型抗CD-20抗体的实例包括例如利妥昔单抗，1F5IgG2a(ECACC,杂交瘤；Press，0.W.，等，血液(Blood)69/2(1987)584-591)，HI47IgG3(ECACC,杂交瘤)，2C6IgGl(如在WO2005/103081中公开)，2F2IgGl(如在WO2004/035607和WO2005/103081中公开)和2H7IgGl(如公开于WO2004/056312)。优选地，所述I型抗-CD20抗体是与利妥昔单抗结合相同的表位的单克隆抗体。所述II型抗CD-20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.3到0.6，优选地，0.35到0.55，更优选地，0.4到0.5的比率。所述II型抗⑶-20抗体的实例包括例如托西莫单抗(BiIgG2a)，人源化的B-Lyl抗体IgGl(如公开于WO2005/044859的嵌合人源化的IgGl抗体)，11B8IgGl(如公开于WO2004/035607)，和AT80IgGl。优选地，所述II型抗-CD20抗体是与人源化的B-Lyl抗体(如公开于WO2005/044859)结合相同表位的单克隆抗体。“关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力，抗-CD20抗体与利妥昔单抗相比的比率”通过在关于Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)的FACS阵列(FACSArray)(BectonDickinson)中使用所述与Cy5缀合的抗-⑶20抗体和与Cy5缀合的利妥昔单抗的直接免疫荧光测量(测量平均荧光强度(MFI))来确定，如在实施例2中所述，并且计算如下与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力的比率=MFI(Cv5-抗-CD20抗体)χCv5-标记比率(Cv5-利妥昔单抗)MFI(Cy5-利妥昔单抗)Cy5-标记的比率(Cy5-抗-CD20抗体)MFI是平均荧光强度。“Cy5-标记的比率”用于本文时意指Cy5-标记分子的数量/分子抗体。典型地，所述I型抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述第一抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.8-1.2，优选地，0.9-1.1的比率。典型地，所述II型抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述第二抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.3-0.6，优选地，0.35-0.55，更优选地0.4-0.5的比率。在优选的实施方案中，所述II型抗-⑶20抗体，优选地，人源化的B-Lyl抗体，具有增加的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。所谓“具有增加的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的抗体”意为这样的抗体，如该术语在本文中定义地，其具有如通过本领域技术人员已知的任何适合方法确定的增加的ADCC。一个被接受的体外ADCC测定法如下1)所述测定法使用靶细胞，已知所述靶细胞表达由抗体的抗原结合区识别的靶抗原；2)所述测定法使用由随机选择的健康供体血液分离的人外周血单核细胞(PBMCs)，如效应细胞；3)所述测定法根据下述流程进行i)使用标准密度离心方法分离PBMCs，并且以5X106细胞/ml悬浮在RPMI细胞培养基中；)靶细胞通过标准组织培养方法培养，从具有高于90%的存活力的指数生长期收获，在RPMI细胞培养基中洗涤，并用100微居的“Cl-标记，用细胞培养基洗涤2次，并以10'细胞/ml的密度重悬于细胞培养基中；iii)将上述100微升的最终靶细胞混悬液转移到96孔微量滴定板的每个孔中；iv)所述抗体在细胞培养基中从4000ng/ml系列稀释到0.04ng/ml并将50微升由此生成的抗体溶液加入96孔微量滴定板中的靶细胞中，一式三份地测试完全涵盖上述浓度范围的多种抗体浓度；ν)对于最大的释放(MR)对照，含有标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的2%(VN)非离子去垢剂的水溶液(Nonidet，西格玛(Sigma)，圣路易斯)，代替抗体溶液(上述iv点)；vi)对于自发的释放(SR)对照，含有标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的RPMI细胞培养基来，代替抗体溶液(上述iv点)；vii)然后，将96孔微量滴定板以50xg离心1分钟并在4C温育1小时；viii)将50微升的PBMC混悬液(上述i点)加入每个孔中，从而产生251的效应细胞靶细胞比率，并将所述板置于5%C02大气下，37C的温箱中4小时；ix)收获来自每个孔的无细胞上清液，并使用Y-计数器量化通过实验释放的放射性(ER)；χ)按照式(ER-MR)/(MR-SR)X100计算关于每种抗体浓度的特异性溶胞百分比，其中ER是关于该抗体浓度量化的平均放射性(见以上ix点)，MR是关于MR对照(见以上V点)量化的平均放射性(见以上ix点)，并且SR是关于SR对照(见以上vi点)量化的平均放射性(见以上ix点)；4)“增加的ADCC”定义为在上述测试的抗体浓度范围内观察到的最大特异性溶胞百分比的增加，和/或获得在上述测试的抗体浓度范围内观察到的最大特异性溶胞百分比的一半所需要的抗体浓度的减少。ADCC的增加与这样的ADCC有关，其使用上述测定法测量，由相同抗体介导，使用本领域技术人员已知的相同标准生产、纯化、配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生，但是其尚未通过被改造为过表达GnTIII的宿主细胞产生。所述“增加的ADCC”可以通过所述抗体的糖改造获得，这意味着，通过改造它们的寡糖成分来增强所述单克隆抗体的天然，细胞介导的效应子功能，如在Umana，P.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol).17(1999)176-180和US6，602，684中所述。术语“补体-依赖性细胞毒性(CDC)，，指根据本发明的抗体在补体存在下，溶解人肿瘤靶细胞。优选地，通过用根据本发明的抗-CD20抗体在补体存在下处理表达CD20的细胞制剂来测量CDC。如果抗体以IOOnM的浓度，在4小时后诱导20%以上的肿瘤细胞溶解(细胞死亡)，则存在CDC。优选地，测定使用51Cr或Eu标记的肿瘤细胞和测量释放的51Cr或Eu来进行。对照包括与补体，但无抗体一起温育肿瘤靶细胞。典型地，IgGl同种型的I型和II型抗⑶-20抗体显示特征性⑶C性质。彼此比较，I型抗⑶-20抗体具有增加的⑶C(如果是IgGl同种型)且II型抗⑶-20抗体具有减少的⑶C(如果是IgGl同种型)。优选地，I型和II型抗⑶-20抗体二者均是IgGl同种型抗体。“利妥昔单抗”抗体是包含人Y1鼠恒定结构域的针对人CD20抗原的遗传改造的嵌合单克隆抗体。这种嵌合抗体包含人Yl恒定结构域并且在US5,736,137(Andersen,等)中以〃C2B8"的名称鉴定，所述US5，736，137于1998年4月17日授权，并且转让给IDEC药物公司(IDECPharmaceuticalsCorporation)。利妥昔单抗被批准用于治疗患有复发或顽固性(refrating)低级或滤泡性，⑶20阳性，B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者。作用研究的体外机制显示利妥昔单抗展示人补体-依赖性细胞毒性(CDC)(Reiff,M.Ε.等，血液(Blood)83(2)435-445(1994))。另外，其在测量抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的测定法中显示显著的活性。术语“人源化的B-Lyl抗体”指如公开于WO2005/044859和WO2007/031875的人源化的B-Lyl抗体，其通过与来自IgGl的人恒定结构域嵌合化(chimerization)和随后的人源化(见WO2005/044859和WO2007/031875)获自鼠单克隆抗-CD20抗体B-Lyl(鼠重链(VH)的可变区=SEQIDNO1；鼠轻链(VL)的可变区=SEQIDNO:2_见Poppema，S.禾口Visser,L.，生物测试公报(BiotestBulletin)3(1987)131-139)。这些“人源化的B-Lyl抗体”详细公开于WO2005/044859和WO2007/031875中。优选地，“人源化的B-Lyl抗体”具有重链(VH)可变区，其选自SEQIDNo.3到SEQIDNo.20的组(TO2005/044859和WO2007/031875的B-HH2到B-HH9和B-HL8到B-HL17)。特别优选的是Seq.IDNo.3,4,7,9,11，13和15(TO2005/044859的B-HH2，BHH-3，B-HH6，B-HH8，B-HL8，B-HLll和B-HL13)。优选地，所述“人源化的B-Lyl抗体”具有轻链(VL)可变区SEQIDNo.20(W02005/044859的B-KV1)。此外，所述人源化的B-Lyl抗体优选地是IgGl抗体。优选地，所述人源化的B-Lyl抗体在Fc区中根据WO2005/044859,WO2004/065540,WO2007/031875,Umana,P.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180和WO99/154342中所述的方法进行糖改造。所述糖改造的人源化B-Lyl抗体在Fc区中具有改变的糖基化模式，优选地具有减少的岩藻糖残基水平。优选地，Fc区的至少40%以上(在一个实施方案中介于40%和60%之间，在另一个实施方案中至少50%，并且在另一个实施方案中至少70%以上的)的寡糖是非-岩藻糖基化的。此外，Fc区的寡糖优选地是二等分的(bisected)。本发明包括I型抗-⑶20抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗表达⑶20的癌症，所述应用的特征在于所述I型抗-CD20抗体与II型抗CD-20抗体共同施用。本发明包括I型抗-⑶20抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗患有表达CD20的癌症的患者，所述应用的特征在于所述I型抗-CD20抗体与II型抗CD-20抗体共同施用。优选地，所述应用的特征在于所述I型抗-CD20抗体是利妥昔单抗，所述II型抗-⑶20抗体是人源化的B-Lyl抗体并且表达⑶20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。寡糖成分可以显著地影响与治疗性糖蛋白的功效相关的性质，包括物理稳定性，对蛋白酶攻击的抗性，与免疫系统的相互作用，药物代谢动力学和特定的生物活性。所述性质可以不仅取决于寡糖的存在与否，还取决于寡糖的特殊结构。可以作一些寡糖结构和糖蛋白功能之间的归纳。例如，某些寡糖结构介导糖蛋白通过与特定的碳水化合物结合蛋白的相互作用从血流中快速清除，而其它的可以被抗体结合并且引发不需要的免疫反应(Jenkins,N.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol).14(1996)975-81)。哺乳动物细胞是用于生产治疗性糖蛋白的优选的宿主，这是由于它们以对于人应用最相容的形式使蛋白糖基化的能力(Cumming，D.Α.，等，糖生物学(Glycobiology)1(1991)115-30Jenkins，N.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol).14(1996)975-81)。细菌极少使蛋白糖基化，并且象其它类型的常用宿主，如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞一样，产生这样的糖基化模式，其与从血流中快速清除，不合需要的免疫相互作用，和在某些特殊情形中，与减少的生物活性相关。在哺乳动物细胞中，在过去的二十年里，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是最常用的。除了提供适合的糖基化模式外，这些细胞容许持续的产生遗传稳定，高产率的克隆细胞系。它们可以使用无血清的培养基在简单的生物反应器中培养到高密度，并且容许发展安全和可再现的生物工艺。其它常用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞，NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。更近期，还已经测试了由转基因动物的生产(Jenkins，N.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol).14(1996)975-81。所有抗体在重链恒定区域中的保守位置包含碳水化合物结构，每种同种型具有N-连接的碳水化合物结构的独特阵列，其以不同方式影响蛋白装配，分泌或功能活性。(Wright,Α.，和Morrison,S.L.，生物技术趋势(TrendsBiotech).15(1997)26-32)。所连接的N连接的碳水化合物的结构，根据加工的程度显著不同，并且可以包括高甘露糖，多分支的以及二分支的复合寡糖。(Wright，Α.，和Morrison，S.L.，生物技术趋势(TrendsBiotech).15(1997)26-32)。典型地，存在对在特定的糖基化位点连接的核心寡糖结构的不同种类的(heterogeneous)处理从而使甚至单克隆抗体以多种糖形存在。同样地，已经显示细胞系之间存在抗体糖基化的主要差异，并且甚至对在不同培养条件下生长的给定细胞系，观察到了微小差异(Lifely,M.R.等，糖生物学(Glycobiology)5(8)(1995)813-22)0获得较大的效力增加，而又同时保持简单的生产工艺并潜在避免明显的，不合乎需要的副作用的一种方式，是通过改造它们的糖成分从而增强单克隆抗体的天然，细胞介导的效应子功能，如在Umana，P.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180和US6，602，684中所述。IgGl型抗体，即在癌症免疫疗法中最常用的抗体，是在每个CH2结构域中的Asn297处具有保守性N-连接糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合的二分支寡糖埋在CH2结构域之间，形成与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)是必需的(Lifely,M.R.，等，糖生物学(Glycobiology)5=813-822(1995)Jefferis,R.，等，免疫学综述(Immunol.Rev.)163:59_76(1998)；Wright,Α.和Morrison,S.L.，生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)15:26_32(1997))。以前已经显示β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶111(〃GnTII17y)，即一种催化二等分的寡糖形成的糖基转移酶)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达，显著增加由改造的CHO细胞产生的抗成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性(见Umana，P.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180；和WO99/154342，将其全部内容并入本文作为参考)。抗体chCE7属于一大类未缀合的单克隆抗体，其具有高肿瘤亲和性和特异性，但是当以缺乏GnTIII酶的标准工业化细胞系生产时，其效力太低而无法在临床上有效使用(Umana，P.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180。该研究首先显示ADCC活性的较大增加可以通过改造生成抗体的细胞以表达GnTIII来获得，其还导致按与恒定区(Fe)-相关的二等分的寡糖，包括二等分的，非岩藻糖基化寡糖的比例，高于天然存在的抗体中存在的水平的增加。术语“表达⑶20”抗原意欲指⑶20抗原在细胞中，优选地在T细胞或B细胞，更优选地B细胞的细胞表面上的显著的表达水平，所述细胞分别来自肿瘤或癌症，优选地非实体肿瘤。具有“表达CD20的癌症”的患者可以通过本领域已知的标准测定法确定。例如，⑶20抗原表达使用免疫组织化学(IHC)检测，FACS或通过基于PCR的相应mRNA的检测进行测量。术语“表达⑶20的癌症”用于本文时，优选地指淋巴瘤(优选地，B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞性白血病。所述淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小无裂细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散发性伯基特淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结节外(extranodal)边缘区B细胞淋巴瘤(黏膜相关的淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞性淋巴瘤(包括B细胞弥漫型大细胞性淋巴瘤(DLCL)，弥漫型混合细胞性淋巴瘤，成免疫细胞性淋巴瘤，原发纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心型淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)f)毛细胞性白血病，g)淋巴细胞性淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)，B细胞前淋巴细胞性白血病，i)浆细胞瘤，浆细胞骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤j)霍奇金病。优选地，所述表达⑶20的癌症是B细胞性非霍奇金淋巴瘤(NHL)。特别地，表达⑶20的癌症包括套细胞淋巴瘤(MCL)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，B细胞弥漫型大细胞性淋巴瘤(DLCL)，伯基特淋巴瘤，毛细胞性白血病，滤泡性淋巴瘤，多发性骨髓瘤，边缘区淋巴瘤，移植后淋巴组织增生病症(PTLD)，HIV相关的淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，或原发性CNS淋巴瘤。术语“治疗方法”或其等价物，当应用于例如癌症时，指被设计用于减少或消除患者的癌细胞数量或减轻癌症症状的方法或作用过程。“治疗癌症或其它增生病症的方法”并不必然意味着癌细胞或其它病症实际上会消除，细胞的数量或病症实际上会减少，或癌症或其它病症的症状实际上会减轻。通常，治疗癌症的方法会被执行，即使仅有很低的成功可能性，但是只要考虑到患者的医疗历史和估计的存活预期期限，仍然认为该方法诱导了总体有益的作用过程。术语“共同施用(co-administration)”或“共同施用(co-administering)”指将所述第一和第二抗-CD20抗体作为一个单一制剂或两个分开的制剂进行施用。所述共同施用可以同时或以任何顺序相继进行，其中优选地，存在一段这样的时间，其间两种(或所有的)活性剂同时发挥它们的生物活性。如果使用一种单一制剂，同时共同施用两种抗-CD20抗体。如果使用两种分开的制剂(一种关于第一抗-CD20抗体，一种关于第二抗-CD20抗体)，所述第一和第二抗-CD20抗体同时(例如通过一次单独的持续输注或通过同时进行的两次分开的持续输注)或相继共同施用。当将两种抗体相继共同施用时，剂量以同一天两次分开的给药进行施用，例如在不同时间的两次分开的持续输注，或一种抗体在第1天施用，且第二抗体在第2-7天，优选地在第2-4天共同施用。因此，术语“相继”意指在给药第一抗体后7天内，优选地，在第一抗体给药后4天内；术语“同时地”意指在同一时间。术语“共同施用”，针对抗-CD20抗体的维持剂量，意指维持剂量可以同时共同施用，例如在一次持续的输注中，条件是该治疗周期对于两种抗体是合适的，例如每周。或维持剂量在一天或数天内，相继共同施用，例如一种抗体的维持剂量约每周施用，并且第二抗体的维持剂量也是每2周进行共同施用。此外，其它治疗周期/通常例如从3天到数周，可以用于两种抗体。将抗体以有效量施用于患者是不言而喻的，所述有效量是将激发由研究者，兽医，医生或其它临床医生探索的组织、系统，动物或人的生物或医学反应的主题化合物或组合的量。所述第一和第二抗-CD20抗体共同施用的量和共同施用的时机取决于被治疗的患者的类型(物种，性别，年龄，体重等)和病症和被治疗的疾病或病症的严重性。所述第一和第二抗-CD20抗体以一次或经过一系列治疗适当地共同施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg到50mg/kg(例如0.l_20mg/kg)的所述第一或第二抗-CD20抗体是对于给患者共同施用的初始候选剂量，不管其是例如通过一次或多次分开的施用，或是通过持续输注进行。在一个实施方案中，关于所述第一或第二抗-CD20抗体的初始输注时间可以比随后的输注时间更长，例如关于初始输注约90分钟，和关于随后的输注约30分钟(如果初始输注被充分耐受)。所述第一或第二抗-⑶20抗体的优选剂量应该在约0.05mg/kg到约30mg/kg的范围内。因此，约0.5mg/kg,2.Omg/kg,4.Omg/kg,10mg/kg或30mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量可以被共同施用于患者。根据患者的类型(物种，性别，年龄，体重等)和患者的病症以及根据抗-CD20抗体的类型，所述第一的剂量可以不同于第二抗-CD20抗体的剂量。所述剂量可以每天地或间歇地共同施用，例如每隔2天到每6天或甚至每1-3周。可以施用初始较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。在一个优选的实施方案中，所述药物用于在所述患有表达⑶20的癌症的患者中预防或减少转移或进一步的弥散。所述药物有效用于增加所述患者的存活的延续时间，增加所述患者的无进展的(progressionfree)存活，增加反应的持续时间，导致被治疗患者的统计学显著和临床有意义的改善，如通过存活的延续时间，无进展存活，应答率或反应的持续时间测量地。在一个优选的实施方案中，所述药物有效用于增加一组患者中的应答率。在本发明的背景下，可以将另外的其它细胞毒剂，化疗剂，或抗癌剂或增强所述药剂效果的化合物用于关于表达CD20癌症的抗-CD20抗体组合治疗中。优选地，所述抗-CD20抗体组合治疗在没有所述另外的细胞毒剂，化疗剂，或抗癌剂，或增强所述药剂的化合物的情况下使用。所述药剂包括，例如烷化剂，或具有烷化作用的试剂，如环磷酰胺(CTX；例如Cytoxan)，苯丁酸氮芥(CHL；例如留可然(leukeran))，顺钼(CisP；例如顺钼(platinol))白消安(例如马利兰(myleran))，美法仓，卡莫司汀(BCNU)，链脲霉素，曲他胺(TEM)，丝裂霉素C，等；抗代谢药，如甲氨蝶呤(MTX)，依托泊苷(VP16；例如凡毕士(vepesid))，6-巯基嘌呤(6MP)，6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)，阿糖胞苷(Ara-C)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，卡培他滨(例如希罗达(Xeloda))，达卡巴嗪(DTIC)，等；抗生素如放线菌素D，多柔比星(DXR;例如亚德里亚霉素(adriamycin))，柔红霉素(道诺霉素)，博来霉素，普卡霉素等；生物碱，如长春花生物碱如长春新碱(VCR)，长春碱，等；和其它抗肿瘤药剂，如紫杉醇(例如泰素(taxol))和紫杉醇衍生物，细胞生长抑制剂，糖皮质类固醇如地塞米松(DEX;例如地卡特隆(decadron))和皮质甾类如泼尼松，核苷酶抑制剂如羟基脲，氨基酸缺失(Cbpleting)酶类如门冬酰胺酶，亚叶酸和其它叶酸衍生物，和类似的，多样的抗肿瘤药剂。还可以将下列药剂用作另外的药剂阿米福汀(arnifostine)(例如氨磷汀>(ethyol))，放线菌素D，氮芥(mechlorethamine)(氮芥(nitrogenmustard))，链佐星，环磷酰胺，洛莫司汀(CCNU)，多柔比星脂质体(doxorubicinlipo)(例如盐酸多柔比星脂质体(doxil))，吉西他滨(例如健)，柔红霉素脂质体(daunorubicinlipo)(例如枸橼酸柔红霉素脂质体(daunoxome))，丙卡巴胼，丝裂霉素，多西他赛(例如泰索帝(taxotere))，阿地白介素，卡钼，奥沙利钼，克拉屈滨，喜树碱，CPT11(伊立替康)，10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)，氟尿苷，氟达拉滨异环磷酰胺，伊达比星，美钠，干扰素β，干扰素α，米托蒽醌，托泊替康，亮丙立德，甲地孕酮，美法仑，巯嘌呤，普卡霉素，米托坦，培门冬酶，喷司他丁，哌泊溴烷，普卡霉素，他莫昔芬，替尼泊苷，睾内酯，硫鸟嘌呤，塞替派，乌拉莫司汀(uracilmustard)，长春瑞滨，苯丁酸氮芥。优选地，所述抗-CD20抗体组合治疗在无所述另外的药剂的情况下使用。上述细胞毒剂和抗癌剂以及抗增生靶特异性抗癌药如蛋白激酶抑制剂在化学治疗方案中的应用是癌症治疗领域中通常充分表征的，并且它们在本文的应用被归入与用于监测耐受性和有效性，以及用于控制施用路径和剂量相同的考虑因素中，其具有一些调整。例如，细胞毒剂的实际剂量可以根据患者培养的细胞反应而改变，所述细胞反应通过使用组织培养法来测定。一般情况下，与在缺少另外的其它药剂的情况下使用的量比较，所述剂量应该减少。有效的细胞毒剂的典型剂量可以在生产商推荐的范围内，并且在通过动物模型中的一种或多种体外反应指示时，可以减少至多约一个数量级的浓度或量。因此，实际的剂量将取决于医师的判断，患者的病症，和治疗法的有效性，所述治疗法基于原代培养的恶性细胞和组织培养的组织样品的体外反应性或在适合的动物模型中观察到的反应。在本发明的背景中，可以进行有效量的电离辐射，和/或除了表达CD20的癌症的抗CD20抗体组合治疗之外，可以使用防辐射药物。辐射源可以在被治疗的患者内部或外部。当所述源在患者外部时，所述疗法已知为外部光束放射疗法(EBRT)。当所述辐射源在患者内部时，所述治疗称为近距放射治疗(BT)。用于本发明背景下的放射性原子可以选自包括，但不限于镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123和铟-111的组。也可以用所述放射性同位素标记所述抗体。优选地，抗-CD20抗体组合治疗在无所述电离辐射的情况下使用。放射疗法是用于控制不可切除或不可手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。当放射疗法与化学疗法组合时，观察到了改进的效果。放射疗法基于这样的原则，即被递送到靶区域的高剂量辐射将导致肿瘤和正常组织中的生殖细胞的死亡。辐射剂量方案通常在辐射吸收剂量(Gy)，时间和分级(fractionation)方面进行限定，并且必须由肿瘤学家仔细限定。患者接受的辐射的量将取决于多种考虑因素，但是两个最重要的考虑因素是肿瘤相对于身体的其它重要结构或器官的位置，以及肿瘤扩散的程度。关于经历放射疗法的患者的典型治疗过程应该是在1-6周期间的治疗时间表，其中施用于患者的总剂量在10和SOGy之间，施用以约1.8到2.OGy的单一每日部分施用于患者，每周5天。在本发明的优选实施方案中，当人患者中的肿瘤用本发明的组合疗法和放射治疗时，存在协同作用。换言之，当与辐射组合，任选地与另外的化疗剂或抗癌剂组合时，包含本发明的组合的药剂对肿瘤生长的抑制被增强。辅助放射疗法的参数例如包含在WO99/60023中。根据已知方法，通过作为推注(bolus)静脉内施用或通过在一段时期内持续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内或鞘内途径将所述抗体施用于患者。优选抗体的静脉内或皮下施用。本发明还包括试剂盒，其特征在于包含容器，所述容器内的包含所述I型和II型抗-CD20抗体的的组合物，其以一个单一或两个分开的制剂的形式存在，以及指导所述组合物的使用者向患有表达CD20的癌症的患者施用所述I型和II型抗-CD20抗体的包装插件。优选地，所述试剂盒的特征在于所述I型抗-CD20抗体是利妥昔单抗，所述II型抗-⑶20抗体是人源化的B-Lyl抗体并且所述表达⑶20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)ο术语“包装插件”指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其可以包括关于适应症(indication)、使用、剂量、施用、禁忌症(contraindication)和/或关于使用所述治疗产品的警示信息。在优选的实施方案中，制品容器的成品还可以包含药用载体。制品的成品还可以包括无菌稀释剂，其优选地贮存在单独的另外的容器中。当用于本文时，“药用载体”意欲包括任何和所有与药物施用相容的物质，包括溶齐U、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等以及与药物施用相容的其它物质和化合物。除了在任何常规介质或药剂与活性化合物不相容的情况下以外，预期其在本发明的组合物中的应用。还可以将补充性活性化合物引入到组合物中。药物制剂根据本发明使用的抗体的治疗制剂通过将具有需要的纯度的抗体与任选的药用载体，赋形剂或稳定剂混合来制备以用于贮存(雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版，Osol,A.Ed.(1980))，其以冻干制剂或水溶液的形式存在。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对于受者是无毒的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲苯酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖；二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；形成盐的平衡离子如钠；金属复合物(例如锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN，PLUR0NICS或聚乙二醇(PEG)。根据本发明的制剂可以是关于每种抗-CD20抗体的两种分开的制剂。备选地，本文的制剂还可以在一种制剂中包含两种抗体。另外地，所述组合物还可以包括化疗剂，细胞毒剂，细胞因子，生长抑制剂或抗血管生成剂。所述分子合适地以有效用于预期目的的量组合存在。活性成分还可以包埋在微囊剂中，所述微囊剂是例如通过团聚技术或通过界面(interracial)聚合制备的，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳状液(macroemulsion)中的羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate))微囊剂。所述技术在雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceuticalSciences),第16版，Osol,Α·编辑(1980)中公开。可以制备持续释放制剂。适合的持续释放制剂的实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质以成形的制品形式存在，例如薄膜，或微囊剂。持续释放基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯))，或聚(乙烯醇)，聚交酯(US3，773，919)，L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸_乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德组成的可注射的微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。用于体内施用的制剂必需是无菌的。这通过无菌滤膜过滤来容易地实现。本发明还包括I型抗-⑶20抗体，其用于治疗表达⑶20的癌症，其特征在于所述I型抗-⑶20抗体与II型抗⑶-20抗体共同施用。本发明还包括I型抗-⑶20抗体，其用于治疗患有表达⑶20的癌症的患者，其特征在于所述I型抗-CD20抗体与II型抗CD-20抗体共同施用。在本发明的一个实施方案中，所述I型抗-CD20抗体是利妥昔单抗，所述II型抗-⑶20抗体是人源化的B-Lyl抗体并且表达所述⑶20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)ο本发明还包括I型抗-⑶20抗体，其用于治疗表达⑶20的癌症或患有表达⑶20的癌症的患者，其特征在于a)所述I型抗-⑶20抗体具有这样的比率，S卩，关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述I型抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.8-1.2的比率，b)所述I型抗-⑶20抗体与11型抗-⑶20抗体共同施用，和c)所述II型抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述II型抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.3-0.6的比率。优选地，所述表达⑶20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。优选地，所述I型抗-⑶20抗体是利妥昔单抗。优选地，所述II型抗-⑶20抗体是人源化的B-Ly1抗体。优选地，所述II型抗-⑶20抗体具有增加的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。提供下面的实施例和图来辅助理解本发明，本发明的实际范围由后附的权利要求提出。要理解的是可以在不背离本发明精神的前提下对提出的方法进行改进。序列表SEQIDNO1鼠单克隆抗-⑶20抗体B-Lyl的重链(VH)的可变区的氨基酸序列。SEQIDNO2鼠单克隆抗-⑶20抗体B-Lyl的轻链(VL)的可变区的氨基酸序列。SEQIDNO:3_19人源化的B-Lyl抗体的重链(VH)的可变区的氨基酸序列(B-HH2-B-HH9,B-HL8，和B-HLlO到B-HL17)SEQIDNO20人源化的B-Lyl抗体的轻链(VL)的可变区的氨基酸序列B-KVl附图简述图II型抗-CD20抗体(利妥昔单抗)与II型抗-CD20抗体(B-HH6-B-KV1GE)的组合治疗对OCI-LylS人非霍奇金淋巴瘤(NHL)的抗肿瘤活性，所述I型抗-⑶20抗体(利妥昔单抗)具有这样的比率，即，关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述I型抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比1.0的比率，所述II型抗-⑶20抗体(B-HH6-B-KV1GE)具有这样的比率，即，关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力，所述II型抗-CD20抗体与利妥昔单抗相比0.44的比率。肿瘤体积的平均值[mm3]绘制在y轴上；肿瘤细胞注射后的天数绘制在χ-轴上。图例A)赋形剂(圆形)，B)利妥昔单抗30mg/kgi.v.一周一次(三角形)·C)人源化的B-Iyl(B-HH6-B-KV1GE)30mg/kg一周一次(正方形)和D)利妥昔单抗与B-HH6-B-KV1GE共同施用(每种30mg/kg，一周一次)(交叉形)图21型抗-⑶20抗体(Cy5_利妥昔单抗=白色条)和II型抗-⑶20抗体(Cy5人源化的B-LylB-HH6-B-KV1GE=黑色条)在Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的平均荧光强度(MFI，左y-轴)；关于与CD20的结合能力，I型抗-CD20抗体(利妥昔单抗)和II型抗-⑶20抗体(B-HH6-B-KV1GE)与利妥昔单抗相比的比率(在右y_轴上的刻度)图3两种II型抗⑶-20抗体的治疗对于Z138人非霍奇金淋巴瘤(NHL)的抗肿瘤活性。两种抗体都是人源化的B-Lyl抗-⑶20抗体；1)B-HH6-B-KV1糖改造的(GE)和2)B-HH6-B-KV1野生型(wt，未糖改造)。肿瘤体积的平均值[mm3]绘制在y轴上；在肿瘤细胞注射后的天数绘制在χ轴上。图例A)赋形剂(圆形)，B)人源化的B-IylGE(B-HH6-B-KV1GE)30mg/kg每周一次(三角形)和C)人源化的B-Iylwt(B-HH6-B-KVlwt)30mg/kg一周一次(交叉形)实验方法实施例1I型抗-CD20抗体(利妥昔单抗)与II型抗-CD20抗体(B-HH6-B-KV1GE)的组合治疗的抗肿瘤活件测试药剂I型抗-⑶20抗体利妥昔单抗以储液(c=10mg/ml)提供，其来自霍夫曼-拉罗奇，巴塞尔，瑞士(HoffmannLaRoche，Basel，Switzerland)。缓冲液包含聚山梨醇酯80，氯化钠和柠檬酸钠。II型抗-CD20抗体B-HH6-B-KV1GE(=人源化的Β-Lyl，糖改造的B-HH6-B-KV1，见WO2005/044859和WO2007/031875))以储液提供(c=9.4mg/kg)，其来自格利卡特，SchlierenJi^±(GlycArt，Schlieren，Switzerland)。抗体缓冲剂包含组氨酸，海藻糖和聚山梨醇酯20。两种溶液都适当地从储液稀释在PBS中，以用于在前的注射。细胞系和培养条件使用0CI_Lyl8人非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞(Chang，H.，等，白细胞淋巴瘤(LeukLymphoma)·1992年9月；8(1-2)129-36)(弥漫型大细胞性淋巴瘤-DLCL)。将肿瘤细胞系常规培养在补充了20%胎牛血清(PAA实验室，奥地利)和2mML-谷氨酰胺，25nMHEPES和0.05mM巯基乙醇的INDM培养基(PAA，实验室，奥地利)中，条件为37°C，在5%CO2的水饱和大气下。将第2代用于移植。动物雌性SCID米色鼠；到达时4-5周龄(购自Bomholtgard，Ry,丹麦)在无特定病原体的条件下维持，伴随每天12小时光照/12小时黑暗的周期，根据规定指南(committedguidelines(GV-Solas；Felasa；TierschG)进行。实验研究方案由当地政府审查和批准。到来后，将动物维持在动物机构的隔离区中一周，以使它们适应新环境和用于观察。常规进行持续的健康监测。任意提供膳食(ProvimiKliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。监测每天控制动物的临床症状并检测不利的效果。为了在整个实验过程中监测，每周两次记录动物的实验体重，并且在分期后用测径器测量肿瘤体积。动物的治疗动物治疗在随机化那天，即细胞移植后24天开始。人源化的II型抗-CD20抗体B-HH6-B-KV1GE接受组和相应的赋形剂组以指定的30mg/kg剂量，在第24，31，38，45和52研究日i.v.q7d治疗。在第26，33，40，47和54天，进行I型抗-⑶20抗体利妥昔单抗作为单一药剂的治疗和与II型抗-⑶20抗体B-HH6-B-KV1GE组合的治疗。体内肿瘤生长抑制研究由于肿瘤负荷，接受赋形剂对照的荷瘤动物在治疗后10天被排除。以30mg/kg的利妥昔单抗作为单一药剂每周一次治疗动物抑制了异种移植物生长达10天(TGI68%)0之后，尽管进行了另外的每周一次的利妥昔单抗单一药剂注射，肿瘤异种移植物持续进展。相反，每周一次用B-HH6-B-KV1GE(30mg/kg)进行的单一药剂治疗控制了OCI-LylS肿瘤生长(TGI100%)。尽管如此，最终肿瘤移植物还是在B-HH6-B-KV1GE单一药剂施用下开始进展。然而，都在30mg/kg的利妥昔单抗和B-HH6-B-KV1GE的组合则明显表现出优越的功效。异种移植的肿瘤得到控制，并且与每种单一药剂抗体武器(arm)相反，肿瘤停滞随时间推移仍维持。实施例2关于与Raii细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，II型抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比的比率的确定将Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)维持在包含10%FCS(Gibco，Cat.-No.10500-064)的RPMI-1640培养基(PanBiotechGmbH,Cat.-No.P04-18500)的培养物中。根据生产商的说明书，使用Cy5MonoNHS酯(阿莫仙GE健康保健(AmershamGEHealthcare)，目录号PA15101)来标记II型抗-⑶20抗体B-HH6-B-KV1(人源化的B-Lyl抗体)和利妥昔单抗。Cy5-缀合的利妥昔单抗具有2.0分子Cy5/抗体的标记比率，Cy5-缀合的B-HH6-B-KV1具有2.2分子Cy5/抗体的标记比率。为了确定和比较两种抗体的结合能力和模式，通过使用伯基特淋巴瘤细胞系Raji(ATCC-No.CCL-86)的直接免疫荧光生成结合曲线(通过Cy5_缀合的利妥昔单抗和Cy5-缀合的B-HH6-B-KV1的滴定)。分别关于Cy5_缀合的利妥昔单抗和Cy5-缀合的B-HH6-B-KV1将平均荧光强度(MFI)分析为EC50(最大强度的50%)。将5*105细胞/样品在4°C染色30分钟。之后，将细胞在培养基中洗涤。将碘化丙锭(PI)染色用于排除死细胞。使用FACS阵列(BectonDickinson)进行测量，在FarRedA测量碘化丙锭(PI)，在Red-A测量Cy5。图2显示，Cy5~标记的B-HH6-B-KV1(黑色条)和Cy5_标记的利妥昔单抗(白色条)以EC50(最大强度的50%)结合的平均荧光强度(MFI)。接着，根据下式计算与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力的比率。与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力的比率二MFI(Cv5-抗-CD20抗体)χCv5标记比率(Cv5-利妥昔单抗)MFI(Cy5-利妥昔单抗)Cy5标记的比率(Cy5-抗-CD20抗体)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>=MFI(B-HH6-B-KVnχCy5标记比率(Cy5-利妥昔单抗)MFI(Cy5-利妥昔单抗)Cy5标记的比率(B-HH6-B-KV1)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>因此与利妥昔单抗相比，作为典型II型抗-⑶20抗体的B-HH6-B-KV1表现出降低的结合能力。实施例3糖改造的(GE)和非糖改造的(野生型，wt)抗-⑶20抗体(B-HH6-B-KV1GE和wt)针对SCID米代鼠中的Z138MCL异种移棺物的类似的抗肿瘤活件测试药剂II型抗-⑶20抗体B-HH6-B-KV1GE(糖改造的(GE)和野生型(wt))以储液提供(c=9.4mg/kg和12.5mg/ml)，其来自格利卡特，Schlieren，瑞士(GlycArt，Schlieren,Switzerland)。抗体缓冲剂包含组氨酸，海藻糖和聚山梨醇酯20。两种溶液都适当地从储液稀释在PBS中，以用于在前的注射。细胞系和培养条件Z138人B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞最初获自格利卡特(GlycArt)(套细胞淋巴瘤-MCL)。将肿瘤细胞系常规培养在补充了20%胎牛血清(PAA实验室，奥地利)和2mML-谷氨酰胺的DMEM培养基(PAA，实验室，奥地利)中，条件为37°C，在5%CO2的水饱和大气下。将第2代用于移植。动物雌性SCID米色鼠；到达时4-5周龄(购自Bomholtgard，Ry，丹麦)在无特定病原体的条件下维持，伴随每天12小时光照/12小时黑暗的周期，根据规定指南(committedguidelines(GV-Solas；Felasa；TierschG)进行。实验研究方案由当地政府审查和批准。到来后，将动物维持在动物机构的隔离区中一周，以使它们适应新环境和用于观察。常规进行持续的健康监测。任意提供膳食(ProvimiKliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。监测每天控制动物的临床症状并检测不利的效果。为了在整个实验过程中监测，每周两次记录动物的实验体重，并且在分期后用测径器测量肿瘤体积。治疗动物动物治疗在随机化那天，即s.c.细胞移植后14天开始。以指定的10mg/kg的剂量，在第14，20，27和34研究日，i.v.q7d治疗人源化的抗CD20抗体(B-HH6-B-KV1GE和wt)接受组和相应的赋形剂组。体内肿瘤生长抑制研究由于肿瘤负荷，将接受赋形剂对照的荷瘤动物在治疗开始后的19天排除。用10mg/kg的作为wt或糖改造的B-HH6-B-KV1(B-HH6-B-KV1GE和wt)每周治疗动物在开始治疗后不久即抑制了异种移植物的长出(outgrowth)。在控制终止时，所有的抗体肿瘤退化，并且随后，大部分的Z138肿瘤异种移植物显示完全的好转。在这种异种移植物模型中，观察到在wt和糖改造形式的抗⑶20抗体B-HH6-B-KV1之间没有显著的差异。这并不是不可能的，因为小鼠不在它们的NK细胞上表达正确的Fc受体，并且此外，由于严重的三重免疫缺陷，认为SCID米色鼠对于NK-介导的ADCC是无能力的。因此，在SCID米色鼠中的s.c.异种移植物模型不适合于模拟关于糖改造修饰抗体的人ADCC介导的效果。权利要求I型抗-CD20抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗表达CD20的癌症，所述应用的特征在于所述I型抗-CD20抗体与II型抗CD-20抗体共同施用。2.I型抗-⑶20抗体用于制备药物的应用，所述药物用于治疗患有表达⑶20的癌症的患者，所述应用的特征在于所述I型抗-CD20抗体与II型抗CD-20抗体共同施用。3.I型抗-⑶20抗体，用于治疗表达⑶20的癌症，其特征在于所述I型抗-⑶20抗体与II型抗⑶-20抗体共同施用。4.I型抗-CD20抗体，用于治疗患有表达CD20的癌症的患者，其特征在于所述I型抗-⑶20抗体与II型抗⑶-20抗体共同施用。5.根据权利要求1或2任一项的应用，其特征在于a)所述I型抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述I型抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.8-1.2的比率，和b)所述II型抗-⑶20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述II型抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.3-0.6的比率。6.根据权利要求1-3任一项的应用，其特征在于所述表达CD20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。7.根据权利要求1-5任一项的应用，其特征在于所述I型和II型抗-CD20抗体是单克隆抗体。8.根据权利要求1-6任一项的应用，其特征在于所述I型抗-CD20抗体是利妥昔单抗。9.根据权利要求1-7任一项的应用，其特征在于所述II型抗-CD20抗体是人源化的B-Lyl抗体。10.根据权利要求1-4任一项的应用，其特征在于所述I型抗-CD20抗体是利妥昔单抗，所述II型抗-CD20抗体是人源化的B-Lyl抗体并且所述表达CD20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。11.根据权利要求1-9任一项的应用，其特征在于所述II型抗-CD20抗体具有增加的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。12.根据权利要求1-9任一项的应用，其特征在于，所述II型抗-⑶20抗体Fc区的至少40%以上的寡糖是非岩藻糖基化的。13.根据权利要求1-9任一项的应用，其特征在于所述I型抗-CD20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述I型抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.9-1.1的比率。14.根据权利要求1-9任一项的应用，其特征在于所述II型抗-CD20抗体具有这样的比率，即关于与Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的⑶20的结合能力，所述II型抗-⑶20抗体与利妥昔单抗相比0.35-0.55，优选地0.4-0.5的比率。15.一种试剂盒，其包含II型抗-⑶20抗体和I型抗-⑶20抗体，用于组合治疗患有表达⑶20的癌症的患者。16.根据权利要求15的试剂盒，其特征在于所述I型抗-CD20抗体是利妥昔单抗，所述II型抗-⑶20抗体是人源化的B-Lyl抗体并且所述表达⑶20的癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。全文摘要本发明涉及I型和II型抗-CD20抗体的组合疗法，其用于治疗癌症，尤其是表达CD20的癌症。文档编号C07K16/28GK101821292SQ200880105614公开日2010年9月1日申请日期2008年8月20日优先权日2007年9月5日发明者克里斯蒂安·克莱因,巴勃罗·乌马纳,托马斯·弗里斯申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司;罗氏格黎卡特股份公司